KR20110117769A - 표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광감작제(photosensitizer)를 포함하는 덴드리머층과 고분자층을 포함하는 다층 박막 구조의 중공구; 및 상기 중공구에 약물이 내포되어 있는 표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 약물전달체는 부작용 없이 표적 부위에서 광역동 치료와 화학적 약물 치료가 동시에 가능하므로 약효를 극대화시킬 수 있다.

Description

표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법{Drug delivery system for targeting and method for preparing the same}

본 발명은 표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

통상적으로 암을 치료하는 방법에는 외과적 수술, 방사선 치료 및 약물 치료의 세 가지 방법이 있다. 각 방법은 암 치료를 위해 독자적으로 사용될 수도 있고 두 가지 이상의 방법이 함께 사용될 수도 있으며, 많은 초기 단계의 암들은 외과적 수술로 치료가 가능하지만, 암이 많이 진전되거나 전이가 일어날 경우에는 외과적 수술만으로는 치료가 어렵고, 방사선 치료 또는 약물 치료 등의 방법이 병행되어야 한다.

방사선 치료는 X-선이나 γ-선을 암세포에 조사하는 방법으로서, 이때 방출되는 광선은 외과적으로 수술이 곤란한 부위나 방사선에 특히 반응성이 좋은 암세포에 사용되거나 수술 전후에 사용될 수도 있다. 또한, 약물 치료는 세포독성(cytotoxic) 약을 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 효소를 파괴하는 방법을 채용한다. 특히, 약물 치료법이 외과적 수술이나 방사선 치료에 비해 갖는 장점은 신체의 어떤 부위에 암이 발명되더라도 약물을 도달시킬 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 점이며, 이와 같은 사유로 약물 치료법은 전이성 암 치료에 대한 표준요법으로 널리 사용되고 있다. 물론, 약물 치료법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시켜 환자의 삶의 질을 개선시키고 수명을 연장시켜 주는 중요한 역할을 한다.

약물 치료법에 널리 사용되는 기존의 항암제는 항암효과를 갖지만, 세포독성을 나타내기 때문에 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 미쳐서 원치 않는 부작용을 나타내는 경우가 많다. 세포독성을 나타내는 약물(Cytotoxic drug)이 정상세포에는 해를 주지 않고 암세포에만 영향을 주는 선택성을 갖는다는 보고도 있으나, 이는 왕성하게 증식하는 암세포와 그렇지 않은 정상세포와의 차이에서 오는 선택성이다. 따라서, 인체에서 골수, 모낭, 위장관 내피세포 등은 세포독성 약물들의 영향을 받기 때문에, 약물 치료를 받은 암환자는 적혈구, 백혈구 및 혈소판의 감소 등으로 세균감염, 자연출혈, 탈모, 메스꺼움 및 구토의 부작용을 겪게 된다.

따라서, 주변 정상세포에 영향을 끼치지 않고 암세포만을 선택적으로 공격하는 표적지향성 약물전달시스템(targeted drug delivery system)의 필요성이 증가되고 있다.

특히, 암세포의 경우 수동적 표적화 혹은 능동적 표적화 방법을 이용하여 표적화가 가능한데, 나노미터(nm) 단위의 기술을 함께 이용할 경우 나노입자의 크기와 표면 특성을 미세하게 조절함으로써 약물의 효과를 극대화할 수 있을 것으로 기대된다.

수동적 표적화 방법은 암세포가 일반 정상세포에 비하여 그 혈관 조직이 느슨한 EPR(enhanced permeation and retention) 효과를 이용하는 것으로, 400nm이하의 크기를 갖는 나노 입자를 이용하면 이러한 EPR 효과가 나타나는 것으로 알려져 있다.

광감작제를 포함하는 덴드리머를 사용하여 광역동 치료와 화학적 약물 치료를 동시에 가능하게 한 약물전달체의 제조가 국내 특허 공개 제2009-0084247호 및 일본 특허 공개 제2005-120068호에 개시된 바 있으나, 이의 약물전달체는 미셀 형태로서, 봉입되는 약물의 종류와 양에 있어 약물 적용에 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 광감작제(photosensitizer)를 포함하는 덴드리머층 및 고분자층을 포함하는 다층 박막 구조의 중공구; 및 상기 중공구에 약물이 내포되어 있는, 적용할 수 있는 약물의 종류에 제한이 없고, 광역동 치료와 화학적 약물 치료가 동시에 가능한 표적지향성 약물전달체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 광역동 치료와 화학적 약물 치료가 동시에 가능한 표적지향성 약물전달체 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광감작제(photosensitizer)를 포함하는 덴드리머층 및 고분자층을 포함하는 다층 박막 구조의 중공구; 및 상기 중공구에 약물이 내포되어 있는 표적지향성 약물전달체를 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

전하성 형판용 나노입자 상에 반대 이온의 광감작제를 포함하는 덴드리머 또는 고분자를 적층시키는 단계;

상기 적층된 덴드리머층에 덴드리머층과 반대 이온의 고분자를 적층시키거나, 상기 적층된 고분자층에 고분자층과 반대 이온의 덴드리머를 적층시켜 상기 전하성 고분자 나노입자를 코어로 하여 덴드리머/고분자의 다층박막 구조의 나노입자를 제조하는 단계;

상기 다층박막 구조의 나노입자에서 코어의 전하성 형판용 나노입자를 제거하여 다층박막 구조의 중공구를 형성시키는 단계; 및

상기 중공구 내에 약물을 주입시키는 단계

를 포함하는 표적지향형 약물전달체의 제조방법을 다른 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 표적지향형 약물전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 또 다른 특징으로 한다.

본 발명은 모형 입자로 사용되는 전하성 고분자 나노입자 크기와 입자 표면에 형성되는 다층박막의 수를 조절함으로써 약물전달체의 나노입자 크기 제어가 가능하여 EPR 효과를 기대할 수 있는 크기의 약물전달체를 형성할 수 있으며, 이러한 표적지향형 약물전달체는 내부와 외부에 각각 약물과 광감작제를 포함하고 있어 최종적으로 치료에 있어서 광역동 치료와 화학적 약물 치료를 동시에 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약물전달체는 중공구 내에 약물의 종류에 관계없이 약물 주입이 가능하다.

도 1은 본 발명에 따른 일 실시예에 따른 약물전달체의 구성도를 간략하게 도시한 것이다.
도 2는 PAH와 덴드리머 포르피린으로 이루어진 다층 박막 구조를 형성하는 과정을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3은 층상 자가조립 방법을 이용하여 다층박막이 형성되는 단계마다 입자의 표면 전하를 제타포텐셜을 통해 측정한 결과이다.
도 4는 층상 자가조립 방법을 이용하여 다층박막이 형성되는 단계마다 입자의 흡광도를 자외선흡광기를 통해 측정한 그래프이다.
도 5는 폴리스티렌 나노입자의 주사 전자현미경을 통해 입자 크기를 확인한 것이다.
도 6은 덴드리머/PAH 층 수가 1, 2, 3일 때의 입자 크기를 나타낸 투과 전자현미경을 통해 확인한 것이다.
도 7은 중공구 형태의 약물전달체를 형성하는 과정을 예시적으로 도시한 것이다.
도 8은 중공구 형태의 약물전달체를 주사전자현미경으로 확인한 것이다.
도 9는 중공구 형태의 약물전달체를 투과전자현미경으로 확인한 것이다.
도 10은 시간에 따른 독소루비신의 주입량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 시간에 따른 독소루비신의 방출량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 482 nm의 파장에서 독소루비신의 농도에 따른 흡광도를 도시한 것이다
도 13은 중공구 입자농도 12.5 ㎍/ml 기준으로 세포 생존율 비교를 나타낸 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 광감작제(photosensitizer)를 포함하는 덴드리머층 및 고분자층을 포함하는 다층 박막 구조의 중공구, 및 상기 중공구에 약물이 내포되어 있는 표적지향형 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

덴드리머에 포함된 광역동 치료법에 사용되는 광감작제는 임상적으로 적합한 파장을 흡수하여 표적 세포나 조직을 산화시켜서 파괴하는 일중항 산소(singlet oxygen)와 같은 활성산소종을 생성하는 감작제이다. 상기 광감작제로는 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린, 나프탈로시아닌, 테트라사이클린 및 아미노레뷰리닉산 등을 들 수 있다. 특히, 상기 광감작제를 포함하는 덴드리머 중에서 본 발명의 실시예에서 광감작제로 포르피린을 함유하는 덴드리머는 전하를 갖고 있어 층상 자기 조립 방법을 이용하여 쉽게 다층 박막을 사용할 수 있다는 이유로 사용하였고, 바람직하기로는 하기 화학식 1로 표시되는 덴드리머 포르피린으로, 덴드리머 포르피린의 중심부에 위치하는 금속 원자 M은 이에 제한되는 것은 아니지만, Zn, Mg, Fe, Cu, Co, Ni 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 상기 금속들은 생체 내에서 안정적인 포르피린 화합물을 형성할 수 있으면서도 일중항 산소(singlet oxygen)을 생성할 수 있는 금속인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 M은 광여기 상태로의 에너지가 높고, 일중항 산소의 생성에 특히 유리한 Zn일 수 있다.

상기 M은, Zn, Mg, Fe, Cu, Co, Ni 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.

한편, 상기 고분자는 덴드리머와 상반되는 전하를 가지는 것이 바람직하며, 자기 조립에 의한 층간 정전기적 인력을 통하여 다층 박막 구조의 중공구를 형성할 수 있다.

상기 다층 박막의 바람직한 예로는 음전하의 덴드리머를 사용할 경우, 음전하 덴드리머, 양전하 고분자 순으로 적층된 다층 박막, 양전하 고분자, 음전하 덴드리머 순으로 적층된 다층 박막; 양전하의 덴드리머를 사용할 경우, 양전하 덴드리머, 음전하 고분자 순으로 적층된 다층 박막, 음전하 고분자, 양전하 덴드리머 순으로 적층된 다층 박막을 포함할 수 있다.

특히, 본 발명의 실시예에서는 전하성 형판용 나노입자로 음전하 고분자 나노입자를 사용하였고, 상기 음전하 고분자 나노입자 상에 양전하 고분자를 적층시키고, 그 주위에 다시 음전하 덴드리머 층을 적층시켜 표적지향형 약물전달체를 제조하였다.

상기 전하성 형판용 입자로는 폴리스티렌, 실리카 또는 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

상기 양전하 고분자로는 폴리알릴아민 하이드로클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리라이신, 폴리디메틸다이알릴암모늄 클로라이드, 또는 키토산 등을 들 수 있다. 또한, 음전하 고분자로는 폴리스티렌설포네이트, 폴리아닐린프로판설포닉 에시드, 폴리비닐설포네이트, 폴리아크릴 에시드, 헤파린, DNA 등을 들 수 있다.

상기 음전하의 덴드리머는 덴드리머 말단이 COO^-[화학식 2 참조], SO₃ ^- 를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 양전하의 덴드리머의 경우에는 덴드리머 말단이 NH₃ ⁺, NH₂R⁺, NHR₂ ⁺, NR₃ ⁺ (이때, R은 탄소수 1 내지 10개의 알킬기를 나타낸다.) 등의 기능기를 가지는 것이 바람직하다.

상기 M은 상기 화학식 1의 M과 동일하다.

또한, 본 발명에 따른 약물전달체는 덴드리머와 고분자가 최종적으로 1 : 1 내지 10의 중량비로 혼합 결합된 것이 바람직하다. 이를 위해서 고분자와 덴드리머를 입자에 흡착시키는 과정을 거칠 때마다 물을 이용하여 반응하지 않고 남은 고분자 및 덴드리머를 제거하여 준다. 만약 이러한 세척과정이 제대로 이루어지지 않아 상기 중량비에 어긋날 경우, 중공구의 구조 안정성이 감소하는 문제점이 생긴다.

이러한 본 발명에 따른 약물전달체의 표면에 포함된 광감작제를 포함하는 덴드리머 층상 구조는 층상 자기조립 방법을 이용하여 나노 입자당 광감작제의 양을 쉽게 조절할 수 있는 편리성을 제공하는 동시에 단층 구조를 갖는 시스템과 달리 다층 박막 구조를 통하여 광감작제를 이용한 광역동 치료의 높은 효율성을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 약물전달체에 주입되는 약물은 그 크기가 약물전달체 입자보다 작아 전달체 내부에 주입 가능한 약물이면 모두 가능하며, 바람직하기로는 항암제, 더욱 바람직하기로는 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포사이드, 빈카알칼로이드, 빈블라스틴 또는 콜히친 등과 같은 약물을 사용하는 것이 적합하다.

본 발명에 따른 표적지향성 약물전달체는 EPR 효과가 가능하도록 입자 크기가 50 ~ 400 nm인 것이 바람직하다. 본 발명에서는 250 nm 정도의 크기를 갖는 나노입자를 사용하였으며, 이러한 나노입자의 크기는 전하성 형판용 나노입자에 따라 조절이 가능하다. 본 실험에서 사용한 폴리스티렌 나노입자의 크기는 주사 전자현미경을 통해 확인하였으며 이는 도 5에 나타나 있다. 본 실험에서 형판으로 사용된 폴리스티렌 나노입자의 경우 그 크기 조절이 수십에서 수백 나노미터까지 가능한 것으로 알려져 있다.

이러한 나노 크기의 약물전달체는 EPR 효과를 이용하여 나노 입자가 정상세포 보다 느슨한 혈관 조직을 가진 암세포에만 선택적으로 투과할 수 있도록 하여 약물로 인한 부작용을 최소화할 수 있게 해 준다.

한편, 본 발명에 따른 표적지향형 약물전달체의 제조방법을 더욱 상세하게 다음에서 설명한다.

먼저, 전하성 형판용 나노입자 상에 반대 이온의 광감작제를 포함하는 덴드리머 또는 고분자를 적층시킨다.

상기 전하성 형판용 나노입자는 약물전달체의 중공구 형성을 위한 코어 부분에 위치하는 고분자로서, 전하를 가지고 있어 이 고분자 주위에 이 전하와 상반되는 전하를 가지는 덴드리머 또는 고분자를 정전기적 인력을 통한 층상 자기 조립법으로 다층 박막을 형성시킬 수 있도록 하는 기본 틀에 해당된다.

상기 전하성 고분자 나노입자 상에 반대 이온의 광감작제를 포함하는 덴드리머 또는 고분자를 분산 반응시켜 적층시킨다.

상기 적층된 덴드리머층에 덴드리머층과 반대 이온의 고분자를 적층시키거나, 상기 적층된 고분자층에 고분자층과 반대 이온의 덴드리머를 적층시켜 상기 전하성 형판용 나노입자를 코어로 하여 덴드리머/고분자의 다층박막 구조의 나노입자를 제조한다.

상기 반대 이온의 고분자와 전하성 형판용 나노입자는 1 : 1 내지 10의 중량비로, 상기 반대 이온의 고분자와 덴드리머는 1 : 1 내지 10의 중량비로 반응시켜 정전기적 인력으로 결합하고, 상기 반응은 10 내지 30분 실시하는 것이 바람직하다. 상기 반응시간은 입자 표면에 고분자 및 덴드리머 단층이 형성되기 위해 필요한 최소시간으로 상기의 반응시간보다 더 적게 반응시킬 경우 표면 전체에 걸쳐 고분자 및 덴드리머의 단층이 형성되지 못할 수 있다.

상기 전하성 형판용 나노입자가 코어가 되고 이 나노입자 주위로 반대 이온의 덴드리머 또는 고분자가 정전기적 인력을 통해 결합되어 적층되고, 전하가 상반되도록 고분자와 덴드리머를 순서대로 반응시켜 이를 수회 반복함으로써 양전하와 음전하 간의 정전기적 인력을 이용한 층상 자기조립 방법을 통해 박막의 두께와 구성하는 층의 수를 손쉽게 조절할 수 있는 다층 박막의 나노입자를 형성한다. 이때, 표면에 마지막으로 흡착된 층에 따라 표면의 전하는 다르게 나타난다.

상기 다층박막 구조의 나노입자에서 코어의 전하성 형판용 나노입자를 제거하여 다층박막 구조의 중공구를 형성시킨다.

상기 전하성 형판용 나노입자는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 또는 톨루엔 등으로 제거된다.

이렇게 약물전달체의 표면은 광감작제를 포함하는 덴드리머층과 고분자층의 다층 박막 구조로 이루어져, 광감작제에 의한 광역동 치료가 이루어지는 공간이다.

다음으로, 상기 형성된 중공구 내에 약물을 주입시켜 최종 약물전달체를 제조한다.

본 발명의 약물전달체의 내부는 치료하고자 하는 질병에 사용되는 약물이 확산에 의해 유입되어 화학적 약물 치료법에 이용할 수 있도록 한 공간이다. 이때, 약물은 물에 녹아 있는 수용액 상태로 제공되며, 이는 입자 내부와 외부의 약물의 농도 차이에 의한 확산현상에 의해 약물 전달체 내부로 유입된다.

본 발명에 따른 약물전달체는 그 입자크기로 인하여 EPR 효과를 통해 표적 세포인 암세포에서만 광감작제에 의해 광역동 치료와 중공구 내 약물에 의해 확산 메커니즘으로 표적 세포에 방출되어 화학적 치료를 동시에 이룰 수 있으므로 부작용 없이 약효를 극대화시킬 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 표적지향형 약물전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 또는 건조시럽제 등의 경구용 제제 또는 주사제 등의 비경구용 제형으로 제제화할 수 있으나, 이러한 제형에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있으며, 이러한 담체의 예로는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등을 선택적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 부형제로서 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 붕해제로서 전분글리콘산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘 등이 사용될 수 있다. 결합제로는 폴리비닐피롤리돈, 저지환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시셀룰로오스 등이 사용될 수 있고, 활택제로서는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 나노 약물 전달체의 제조

가. 덴드리머 포르피린 다층박막 구조의 형성

전하성 형판용 나노입자인 폴리스티렌 나노입자[입자크기 230 nm. 도 5]에 덴드리머 포르피린[화학식 3]으로 이루어진 다층박막 구조를 형성하기 위하여, 덴드리머 포르피린 수용액과 양전하 고분자인 PAH[Poly(allylamine hydrochloride), MW 50,000, Sigma-Aldrich] 수용액을 제조하였다. 각 수용액은 PBS 완충용액(pH 7.4) 1 mL에 대하여 덴드리머 포르피린 및 PAH 1 mg을 각각 포함하도록 하였다.

도 2에 나타나 있듯이, 폴리스티렌 나노입자의 표면이 음전하를 띄므로 정전기적 인력을 이용하기 위해, 먼저 양전하를 갖는 상기에서 제작된 PAH 고분자 수용액 1 mL에 폴리스티렌 나노입자 10 mg을 분산시키고 15분간 반응시켰다(이하, 고분자 반응). 이때, 폴리스티렌(PS) 나노입자의 고른 분산을 위하여 상기 반응은 혼합장치 쉐이커 상에서 진행되었다. 반응이 끝난 PAH/PS 나노입자는 원심분리기(14000 rpm, 5분)를 통해 가라앉힌 후, 반응하지 않은 PAH 상층 수용액은 제거시켜 주었다. 덴드리머 포르피린 수용액을 반응시키기 전에 PAH/PS 나노입자는 순수 증류액으로 3번 세척과정을 거쳤다. 덴드리머 포르피린 수용액에 PAH/PS 나노입자 10 mg을 분산시키고 15분간 반응시켰다(이하, 덴드리머 반응). 이 반응 역시 쉐이커 상에서 진행되었으며, 상기 고분자 반응과 상기 덴드리머 반응을 되풀이함으로써(층상 자기조립법) 덴드리머 포르피린과 PAH로 이루어진 다층박막 구조를 형성시켰다. 표면에 마지막으로 흡착된 층에 따라서 표면의 전하는 다르게 나타나며, 덴드리머 포르피린과 PAH 층이 쌓일 때마다 변하는 표면의 전하는 제타 포텐셜을 통하여 측정되었고 이는 도 3에 나타낸 바와 같다.

본 실시예에서의 다층박막 구조는 덴드리머 포르피린 층으로 마무리하였으며, 층 수를 달리하여 층상 자기조립의 효과를 확인할 수 있었다. 도 4에서는 덴드리머 포르피린 층의 흡광도를 자외선 분광기로 측정하여 다층 박막의 층 수에 따른 흡광도의 변화를 나타내고 있다. 도 5는 본 실험에서 형판으로 사용된 폴리스티렌 나노입자의 크기를 주사 전자 현미경을 통해 확인한 것이다. 도 6에서는 덴드리머/PAH 층 수를 1, 2, 3으로 달리하여 형성하였을 때의 입자 크기를 나타낸 투과 전자현미경을 통해 확인해 보았다. (1층 입자크기: 260 ~ 270 nm. 2층 입자크기: 270 ~ 280 nm, 3층 입자크기: 280 ~ 290 nm)

나. 중공구(hollow sphere)의 형성

중공구의 형태를 갖는 나노 약물 전달시스템을 형성하기 위하여, 상기 가.와 같이 덴드리머 포르피린과 PAH로 이루어진 다층박막을 형성한 후에, 형판으로 사용된 폴리스티렌 나노입자를 클로로포름(Chloroform) 용액에 10분간 반응시킴으로써 제거하였다. 반응이 끝난 후, 남은 클로로포름 용액을 제거하고, 순수 증류수를 사용하여 3번의 세척과정을 거쳤다. 상기 과정은 도 7에 나타나 있다.

형성된 중공구는 물 1 ml에 중공구 10 ㎍을 포함한 수용액 상태로 분산시켜 준 후에 각각 실리콘 웨이퍼와 투과전자현미경용 그리드에 흡착시킨 후 주사 전자현미경과 투과 전자현미경을 통해 확인하였으며, 이는 도 8과 도 9에 나타나 있다.

도 8은 주사 전자현미경을 통한 중공구를 관찰한 것으로, 이때 중공구는 고분자/덴드리머 총 3층으로 이루어져 있다. 도 9 역시 고분자/덴드리머 3층으로 이루어진 중공구를 투과 전자현미경을 통해 확인한 것이다.

다. 중공구 내부로의 약물 주입

본 발명에서는 1 ml의 PBS 용액에 0.1 mg의 독소루비신을 포함한 수용액이 사용되었다. 약물전달체 입자 0.1 mg에 1 ml의 독소루비신 용액을 첨가한 후, 약물전달체 입자를 독소루비신 수용액에 분산시켰다. 이때, 독소루비신 수용액은 농도 차에 의한 확산메커니즘을 통해 상기 나.에서 형성된 중공구 내부로 주입되었다.

도 10에서는 시간에 따른 독소루비신의 약물전달체 입자 중량당 주입량(㎍/mg)을 나타낸 것이다. 유입시간은 최소 1시간에서 시작하여, 3, 5, 7, 9, 12, 24, 48, 72시간까지 설정하였다. 독소루비신 수용액을 각 유입시간만큼 반응시키고, 원심분리기(14000 rpm, 5분)를 이용하여 독소루비신이 주입된 중공구 입자를 가라앉힌 후, 반응하지 않은 상층액(독소루비신이 주입되지 않은 중공구 입자)을 분리하였다. 상기 나.에서 형성된 중공구 약물전달체(도 10의 hollow)의 흡광도와 중공구가 아닌 구 형태, 즉 폴리스티렌 나노입자를 제거하기 전의 약물전달체(도 10의 filled)의 흡광도를 자외선 분광기를 통해 측정하였다. 상기 구 형태의 약물전달체는 중공구 형태가 아니므로 약물이 전달체 내부로 유입되지 못하고 전달체의 표면에만 흡착되게 된다. 반면, 중공구 형태의 약물전달체는 표면에 흡착뿐만 아니라 내부에도 약물이 유입될 수 있으므로, 이 두 약물전달체의 비교를 통해 중공구 형태의 약물전달체의 약물 주입 효과를 살펴볼 수 있다. 흡광도와 농도와의 관계를 나타낸 비어의 법칙[J. D. J. Ingle and S. R. Crouch, Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, New Jersey]을 이용하면 측정된 흡광도를 통해 독소루비신의 농도를 유추할 수 있다. 도 12은 482 nm의 파장에서 독소루비신의 농도(0 ~ 200 ㎍/ml)에 따른 흡광도를 도시한 것이다. 이에 비어의 법칙을 적용하면 농도와 흡광도의 상관관계를 알 수 있다. 농도를 x라 하고 흡광도를 y라 하면 농도와 흡광도 사이에는 y=0.035x+0.0034 의 관계가 성립된다. 이를 통해 흡광도를 측정함으로써 임의의 독소루비신 용액의 농도를 유추할 수 있다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 고분자/덴드리머 층을 1, 2, 3 층으로 변화시켰을 때의 독소루비신의 주입량 변화를 통해 층 수에 따른 약물 자체의 주입량에는 큰 차이가 없으나, 중공구 형태와 구 형태일 때의 약물 주입량은 대략 2배 정도 차이 나는 것을 확인할 수 있다. 이는 구 형태일 때는 약물의 전달체 표면 흡착만이 일어나는 반면에, 중공구 형태일 때는 표면 흡착뿐만 아니라 전달체 내부로의 유입이 가능해져 더욱 효과적으로 약물을 주입할 수 있다는 것을 의미한다.

라. 약물 방출

생체 내에서 약물의 방출현상을 예상해보기 위하여, 인체의 체액과 동일한 농도를 갖는 0.9% 염화나트륨 수용액(pH 6.5)에 상기에서 제작된 독소루비신을 포함한 중공구 입자(유입시간은 72시간을 기준으로 하였다)를 분산시킨 후, 72시간 동안의 약물의 방출현상을 살펴보았다.

일정 시간이 흐른 후, 0.9% 염화나트륨 수용액으로 방출된 독소루비신의 양은 상기 다.에서 나타낸 바와 같이 흡광도를 통하여 계산하였다. 시간에 따른 독소루비신의 방출율(%)은 다음 수학식 1에 의해 산출되며, 이를 도 11에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 고분자/덴드리머 층을 1, 2, 3 층으로 변화시켰을 때의 독소루비신의 방출율 변화를 통해 층 수가 많아질수록 중공구 형태에서의 약물 최종 방출율과 방출속도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 흡착에 의한 약물 전달형태인 구 형태에서는 흡착된 약물의 50% 정도만이 방출된 반면에, 흡착과 내부 주입이 동시에 이루어진 약물 전달 형태인 중공구 형태에서는 적게는 75%에서 많게는 90%까지 약물의 방출이 이루어진다.

실험예 1: 세포실험을 통한 치료 효과 확인

상기 실시예 1에서 제조된 약물전달체의 효과를 알아보기 위하여 세포실험을 진행하였다.

본 발명에 있어, 항종양성 항생물질인 독소루비신이 중공구 입자 내부에 들어있는 경우와 그렇지 않은 경우, 각각의 항암 효과를 입증하기 위하여 세포 실험(in vitro)을 수행하였다. 본 실험에서 사용된 세포주는 HeLa이며, 10%의 FBS(Fetal bovine serum)과 1%의 항생물질을 포함하고 있는 RPMI 1640을 배지로 사용하여 배양되었다. 실험 방법은 다음과 같다.

접종 후 세포가 충분히 자랄 때까지(직경 10 cm) 배양시키고 배양 용기에서 배지를 제거한 다음, 트립신-EDTA 용액 1.5 mL을 넣고 3분 동안 CO₂ 배양기에 넣어 두었다. 배양기에서 배양 용기를 꺼낸 후 배지 용액 5 mL를 넣고 혼합 용액을 15 mL 코니칼 튜브에 옮긴 후 15000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 코니칼 튜브의 배지를 제거한 후 새로운 배지 용액 1 mL을 넣고 파이펫을 이용하여 조심스럽게 펠렛을 풀어주었다. 이 중 10 ㎕를 취해 사세포만을 염색하는 트리판블루 10 ㎕와 섞어준 후, 다시 10 ㎕을 취해 헤마사이토미터의 홈에 넣어 주었다. 현미경을 통하여 세포 개수를 측정하고 평균값을 구한 후 이를 바탕으로 필요한 세포의 양만큼 세포 현탁액에서 취해 전체 필요한 양의 배지에 넣고 섞어주었다. 본 실험에서 사용하는 세포 수는 한 웰당 2 X 10³개이며 배지의 양은 한 웰당 100 ㎕였다. 실험에 필요한 양만큼 준비된 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 각각 100 ㎕씩 넣어주었다. 빛을 쪼여주는 경우와 그렇지 않은 두 경우로 나누어 실험을 진행하였다. 세포가 배양 용기에 잘 붙을 수 있도록 24시간 동안 CO₂ 배양기에 넣어둔 후, 약물이 주입된 중공구 입자와 약물이 주입되지 않은 중공구 입자 물질을 세포에 처리하였다. 상기 입자, 즉 약물이 주입된 중공구 입자와 주입되지 않은 중공구 입자 용액(중공구 입자 질량 기준으로 0.1mg/ml 농도로 준비하였다) 200 ㎕에 배지 1800 ㎕을 섞어 1/100의 농도로 희석시킨 용액을 준비하고, 그 용액에 배지를 섞어 1/2의 농도로 희석시키는 과정을 반복하여 9개의 각각 다른 농도의 용액도 준비하였다. 위의 총 10개의 용액을 세포에 처리하며, 같은 농도의 용액은 4개의 웰에 각각 50 ㎕씩 넣어 결과적으로 총 4개의 결과를 얻어 그 평균값을 구하게 되었다.

상기 약물이 주입된 중공구 입자와 주입되지 않은 중공구 입자 용액을 세포에 처리하고 난 후 24시간 동안 96-웰 플레이트를 은박지로 싸서 빛을 차단시킨 상태로 CO₂ 배양기에 넣어 두었다. 24시간이 지난 후, 각 웰에 들어 있는 배지 용액을 제거하고, 세포 내에 들어가지 않은 물질을 제거하기 위해 PBS 용액 100 ㎕을 넣어 세척해 준 후 배지 용액 100 ㎕을 넣었다. 광역학 치료와 관련된 실험을 목적으로 제작된, 백색 발광 다이오드가 부착된 함에 96-웰 플레이트를 넣고 한 시간 동안 빛을 쪼여주었다. 발광 다이오드를 사용하여 그 과정 동안 발생하는 열을 최소화하였지만, 발생하는 열이 세포에 영향을 줄 수 있는 가능성을 고려하여 96-웰 플레이트 아래 보냉제가 들어 있는 플레이트를 놓아두어 배지 용액의 온도가 올라가는 것을 방지하였다. 이 과정 동안 빛을 쪼여주지 않는 대조군의 경우에는 빛이라는 인자를 제외한 모든 조건을 동일하게 하며, 모든 과정이 진행된 후에는 역시 은박지로 각각의 플레이트를 싼 후, CO₂ 배양기에 48시간 동안 넣어두어 세포 사멸이 일어나도록 하였다. 48시간 후, 각 웰에 5 mg/mL의 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) 용액 10 ㎕를 넣고 플레이트를 은박지에 싼 상태로 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 배지 혼합액을 제거하고 DMSO 100 ㎕를 넣어 생성된 포르마잔을 녹여준 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살아 있는 세포의 경우, MTT 용액을 넣어주면 탈수소화작용을 통해 포르마잔을 형성하게 되는데, 그 농도값이 세포 생존을 간접적으로 측정할 수 있는 척도가 되므로 이 방법을 주로 사용하며, 아무 처리를 하지 않은 세포에서의 흡광도 값을 100%로 보고 약물이 주입된 중공구 입자와 주입되지 않은 중공구 입자 처리를 한 세포들의 흡광도를 바탕으로 생존율을 계산하였다.

도 13을 나타나 있듯이, 중공구 입자농도 12.5 ㎍/ml 기준으로 세포 생존율 비교를 통해 아무런 처리를 하지 않은 세포의 생존율이 90%일 때, 덴드리머 포르피린에 의한 광역동 치료를 한 세포의 생존율은 60%, 독소루비신 약물에 의한 세포의 생존율은 20%, 약물과 광역동 치료가 동시에 이루어진 세포의 생존율은 5% 정도로, 약물 치료와 광역동 치료가 동시에 가능한 본 발명의 약물전달체의 효과적인 치료 효과를 입증할 수 있었다.

Claims (18)

1. 광감작제(photosensitizer)를 포함하는 덴드리머층과 고분자층을 포함하는 다층 박막 구조의 중공구; 및
   상기 중공구에 약물이 내포되어 있는 표적지향형 약물전달체.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 덴드리머층은 음전하성이며, 상기 고분자층은 양전하성인 약물전달체.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린, 나프탈로시아닌, 테트라사이클린 및 아미노레뷰리닉산 로 이루어진 군에서 선택된 약물전달체.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 고분자는 폴리알릴아민 하이드로클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리라이신, 폴리디메틸다이알릴암모늄 클로라이드, 또는 키토산 약물전달체.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 약물전달체.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 에토포사이드, 빈카알칼로이드, 빈블라스틴 또는 콜히친인 약물전달체.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 덴드리머와 고분자는 1 : 1 내지 10의 중량비로 혼합 결합된 약물전달체.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 약물전달체의 입자 크기는 50 내지 400 nm인 약물전달체.
   
9. 전하성 형판용 나노입자 상에 반대 이온의 광감작제를 포함하는 덴드리머 또는 고분자를 적층시키는 단계;
   상기 적층된 덴드리머층에 덴드리머층과 반대 이온의 고분자를 적층시키거나, 상기 적층된 고분자층에 고분자층과 반대 이온의 덴드리머를 적층시켜 상기 전하성 고분자 나노입자를 코어로 하여 덴드리머/고분자의 다층박막 구조의 나노입자를 제조하는 단계;
   상기 다층박막 구조의 나노입자에서 코어의 전하성 형판용 나노입자를 제거하여 다층박막 구조의 중공구를 형성시키는 단계; 및
   상기 중공구 내에 약물을 주입시키는 단계
   를 포함하는 표적지향형 약물전달체의 제조방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 전하성 고분자가 음전하성이며, 전하성 고분자 나노입자에 양전하성 고분자를 적층시킨 후, 음전하의 덴드리머를 적층시키는 약물전달체의 제조방법.
    
11. 제 9 항에 있어서, 상기 덴드리머층과 고분자층을 정전기적 인력에 의한 층상 자기조립법으로 덴드리머층, 고분자층을 반복하여 박막의 층 수를 조절하는 약물전달체의 제조방법.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 전하성 형판용 나노입자는 폴리스티렌, 실리카 또는 탄산칼슘인 약물전달체의 제조방법.
    
13. 제 9 항에 있어서, 상기 반대 이온의 고분자와 전하성 형판용 나노입자는 1 : 1 내지 10 중량비로 반응하여 적층되는 약물전달체의 제조방법.
    
14. 제 9 항에 있어서, 상기 고분자층 또는 덴드리머층은 10 내지 60 분 반응시켜 적층시키는 약물전달체의 제조방법.
    
15. 제 9 항에 있어서, 상기 반대 이온의 고분자와 덴드리머는 1 : 1 내지 10의 중량비로 반응하여 적층되는 약물전달체의 제조방법.
    
16. 제 9 항에 있어서, 상기 중공구 형성 시 전하성 형판용 나노입자는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 또는 톨루엔에 의해 제거되는 약물전달체의 제조방법.
    
17. 제 9 항에 있어서, 상기 약물 주입은 농도 차에 의한 확산으로 실시하는 약물전달체의 제조방법.
    
18. 제 1 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 따른 약물전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물.

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