KR102081666B1 - 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 광감각제-금속나노시트 복합체를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 엽산이 로딩된 금속나노시트를 활용하는 경우, 난용성 광감각제를 효과적으로 적재하여 가용성을 높일 수 있고, 체내 투여시 혈액 내에서 분해되지 않고 안정성을 유지하여 무분별한 광감각제의 방출을 억제할 수 있으며, 나아가 암세포 내로 들어간 나노시트는 암세포 내에 높은 농도로 존재하는 글루타치온 (GSH)에 의해 거의 완벽하게 분해될 수 있는바, 본 발명의 광감각제-금속나노시트 복합체를 사용함으로써, 항암제의 투여량을 획기적으로 낮추면서도 부작용이 적고 효과적인 치료가 가능한 신개념의 항암 치료 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.

Description

암 치료용 약학 조성물{Phamaceutical composition for treating cancer}
본 발명은 광감각제-금속나노시트 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
광역학 치료 (Photodynamic therapy, PDT)는 치료제로서의 광감각제 (photosensitizer, PS)와 유효한 광원 (light source)의 상호작용을 이용하여 부작용이 거의 없고, 세포 독성이 적어, 약물 내성이 거의 없는 암을 치료할 수 있는 매력적인 비침습적 치료 전략에 해당한다. PDT에서는, 일중항 산소 (SO)를 비롯한 활성산소종 (ROS)의 생성을 통한 세포사멸 및 괴사 (apoptosis and necrosis)로 세포 죽음 (cell death)을 유도한다. 이때, PS는 적절한 파장과 빛의 힘으로 선택적 조사를 통해 활성화되어 전자 또는 에너지를 주변 산소로 전달한다. 따라서 건강한 세포에 대한 손상을 최소화하면서 높은 치료 효과를 얻기 위해서는, PS를 종양에 표적으로 전달하기 위한 효과적인 전략이 필요하다.
다만, 광감각제를 이용한 광역학 치료법이 기존의 항암치료나 방사선 치료에서 보이는 부작용을 현저히 줄이면서도 암 치료 효과는 극대화할 수 있는 장점이 있으나, 광역학 치료 후 발생하는 피부 광민감성 (skin photosensitivity)의 문제가 지적되고 있다. 일례로, 미국 식약청의 허가를 받아서 암치료에 사용되는 광감각제인 Photofirin®의 경우, 정상조직에 비특이적으로 축적되어 광역학 치료 후에도 오랜 기간 광감각제가 피부와 눈 등에 잔존하므로, 환자가 빛에 노출되는 경우 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 피부 광민감성 부작용을 보인다. 이러한 피부 광민감성 부작용을 피하기 위하여 환자는 광역학 치료 시술 후 6주 이상 빛이 없는 환경에서 생활해야 하는 불편함이 있다. 또한, 광감각제가 종양 조직 주변의 정상조직에도 쌓이는 경우 표적-대비-배경신호 비 (target-to-background signal ratio)가 나빠지기 때문에 광감각제를 이용한 종양의 형광 영상 진단에 효율적이지 못하다.
또한, 대부분의 PS 유도체는 수용액 내 용해도가 낮아 광유도 활성이 낮고 세포 내 침투가 비효율적이다. 이에, 실리카, 금, 고분자, 업컨버젼 (upconversion), 및 탄소 나노입자 등 정상조직에 대한 비특이적 축적을 줄이기 위한 친수성 특성을 갖는 개질된 광감각제가 개발되고 있다. 그러나, 친수성이 증가된 광감각제는 정상세포에 대한 비특이적인 축적이 감소되고 체내에서 보다 빠르게 배출 되어 피부 광민감성 지속 기간이 상당히 단축되는 장점이 있는 반면, 치료에 충분한 양이 종양 조직에 전달되기 위해서는 용량을 높여서 투여해야 하는 단점이 있으며, 암 세포 내 침투도 어렵기 때문에 광역학 치료 효능이 낮아진다는 단점이 있다. 따라서, 암 세포에 특이적으로 축적률을 높이고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수한 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
최근, 독특한 물리적, 화학적 성질을 지닌 새로운 2 차원 물질이 생체 영상, 바이오센서, 약물/유전자 전달 및 재생의학 분야에서 주목을 받고 있다. 특히 블레이드 (blades)와 유사한 날카로운 모양을 가진 2D 물질은 보다 덜 날카로운 정도를 가진 물질에 비해 세포질 내에 더 높은 축적을 보였다. 나아가, 약물과 같은 생체기능 분자의 효과적인 세포 내 전달을 위해서는, 전달체는 물질의 높은 세포 흡수, 및 배설 속도가 낮은 세포 내에서의 장기간 보존이 가능해야 한다. 따라서 이러한 2D 물질은 구형 입자와 같이 매끄러운 표면을 갖는 재료로는 해결할 수 없는 임상 과제에 대한 해결 과제를 제공할 수 있는 대체제 중 하나로 여겨진다.
이에, 본 발명자들은 기존 광역동 치료의 한계를 극복하기 위해 안정성이 높고 생체 내 특정 환경에서 쉽게 분해되는 신규한 광역학 치료제를 개발하기 위해서 연구하던 중, 기존 나노입자들보다 세포 내 침투가 보다 용이할 뿐 아니라 암세포만 선택적으로 인식할 수 있는 기능성 나노시트를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 광감각제-금속나노시트 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 종양 세포 표면의 엽산 수용체에의 결합을 위한 엽산(folic acid) 및 기결정된 파장의 광 조사에 의해 여기되는 광감각제가 표면에 분포되며, 종양 조직 내에서 분해되는 금속나노시트를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서,
상기 금속나노시트는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈, 철, 망간, 또는 이의 산화물을 함유하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서,
상기 금속나노시트는 이산화망간 (MnO2)을 함유하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서,
상기 금속나노시트는 엽산 수용체 매개 엔도사이토시스 (FA receptor mediated endocytosis)에 의해 암세포 내로 이입되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서,
상기 광감각제는 프탈로시아닌계 (phtalocyanine) 화합물, 포르피린계 (phorphyrins) 화합물, 클로린계 (chlorins) 화합물, 박테리오클로린계 (bacteriochlorins) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계 (5-aminoevuline esters) 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
6. 위 1에 있어서,
상기 광감각제는 아연-프탈로시아닌 (ZnPC)인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
7. 위 1에 있어서,
상기 기결정된 파장은 600 내지 800 nm인, 암 치료용 약학 조성물.
8. 위 1에 있어서,
여기된 광감각제는 일중항 산소 또는 자유라디칼을 발생시키는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
9. 위 1에 있어서,
상기 광감각제는 엽산-금속나노시트-광감각제 복합체 총 중량 중 5 내지 20중량%로 포함되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
10. 위 1에 있어서,
상기 금속나노시트는 이산화망간 (MnO2)을 함유하는 것이고, 상기 광감각제는 아연-프탈로시아닌 (ZnPC)인, 암 치료용 약학 조성물.
11. 위 10에 있어서,
상기 아연-프탈로시아닌은 상기 금속나노시트에 Mn-N 배위결합으로 결합된것 인, 암 치료용 약학 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 광감각제는 입도 감소처리한 분말을 FA-MnO2 용액과 혼합하고 교반하여 금속나노시트에 결합된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
13. 위 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 암은 피부암, 구강암, 위암, 난소암, 유방암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 신장암, 폐암, 췌장암, 자궁 경부암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것인, 암 치료용 약학 조성물.
14. 금속나노시트 표면에 엽산을 분포시키는 단계; 및
상기 엽산이 분포된 금속나노시트의 표면에 광감각제를 분포시키는 단계를 포함하는 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
15. 위 14에 있어서, 상기 금속나노시트는 MnO2를 함유하는 것이고, 상기 광감각제는 아연-프탈로시아닌인, 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
16. 위 15에 있어서, 상기 광감각제를 분포시키기 전에 광감각제 분말의 입도 감소 처리하는 단계를 더 포함하는, 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
본 발명은 광감각제-금속나노시트 복합체를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 엽산이 로딩된 금속나노시트를 활용하는 경우, 난용성 광감각제를 효과적으로 적재하여 가용성을 높일 수 있고, 체내 투여시 혈액 내에서 분해되지 않고 안정성을 유지하여 무분별한 광감각제의 방출을 억제할 수 있으며, 나아가 암세포 내로 들어간 나노시트는 암세포 내에 높은 농도로 존재하는 글루타치온 (GSH)에 의해 거의 완벽하게 분해될 수 있는바, 본 발명의 광감각제-금속나노시트 복합체를 사용함으로써, 항암제의 투여량을 획기적으로 낮추면서도 부작용이 적고 효과적인 치료가 가능한 신개념의 항암 치료 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 약학 조성물은 종래 광감각제 항암제 대비 10%의 양만 투여해도 높은 항암 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 FA-MnO2 매개 ZnPc 전달 및 이에 따른 표적화된 광역동 치료 (PDT) 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 FA-MnO2의 특성을 확인한 것으로, a) FA-MnO2의 AFM 지형 이미지 (topographical images), b) TEM 이미지, c) XPS 분석에 의한 FA-MnO2 및 MnO2의 원소 조성, d) FA-MnO2 및 MnO2의 UV-Vis-NIR 흡광도 스펙트럼, 및 e) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 특성을 확인한 것으로, a) ZnPc 및 FA-MnO2/ZnPc의 UV-Vis-NIR 흡광도 스펙트럼, 및 b) 다양한 조건 하에서, 670 nm 방출 파장에 따른 FA-MnO2/ZnPc로부터의 ZnPc의 형광 강도의 시간-의존적 회복을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 세포 내 흡수 (intracellular uptake)를 확인한 것으로, a) MnO2/ZnPc, FA-MnO2 또는 FA-MnO2/ZnPc로 처리된 HeLa 세포의 명시야 및 형광 이미지, b) 유세포 분석에 의한 세포 집단 히스토그램, 및 c) 상기 히스토그램에 상응하는 상대적 형광 강도 막대 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 시험관 내 (in vitro) 광역학적 효과를 확인한 것으로, a) 레이저 조사 후 각 MnO2 유도체 처리된 HeLa 세포의 명시야 및 형광 이미지, b) 530 nm (λex=504)에 따른 SOSG의 시간-의존적 형광 강도, 및 c) 다양한 농도의 FA-MnO2/ZnPc 또는 ZnPc를 경량 투여한 HeLa 세포의 상대적인 생존율을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 생체 내 (in vivo) 표적화 및 광역학적 항암 효과를 확인한 것으로, a) 종양-이종이식 (tumor-xenograft) 마우스에 FA-MnO2/ZnPc, MnO2/ZnPc 또는 PBS를 정맥 주사 12 시간 후의 명시야 및 형광 이미지, b) 빛을 조사하면서 PBS, FA-MnO2, MnO2/ZnPc 또는 FA-MnO2/ZnPc로 처리한 종양-이종이식 마우스의 시간-의존적인 상대적 종양 부피, 및 c) PBS, FA-MnO2, MnO2/ZnPc 또는 FA-MnO2/ZnPc 주입 2 주 후, 종양 절편의 H&E 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 a) FA-MnO2/ZnPc 및 b) MnO2/ZnPc의 AFM 지형 이미지 (topographical images)를 나타낸 도이다.
도 8은 MDA-MB-231 세포 (FR-과발현 세포) 및 A-549 (FR-결핍 세포)의 명시야 및 형광 이미지를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 생체 외 (ex vivo) 항암 효과를 확인한 것으로, 종양-이종이식 (tumor-xenograft) 마우스에 FA-MnO2/ZnPc, MnO2/ZnPc 또는 PBS를 정맥 주사 12 시간 후, a) 종양 및 b) 주요 장기의 명시야 및 형광 이미지를 나타낸 도이다.
본 발명자들은, 실시예에서 엽산이 로딩된 광감각제-금속나노시트 복합체 (FA-MnO2/ZnPc)의 세포 내 침투 능력, 종양 표적화 능력, 및 생체 내 특정 환경에서 쉽게 분해되는 효과 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 암세포 표면의 엽산 수용체에의 결합을 위한 엽산(folic acid) 및 기결정된 파장의 광 조사에 의해 여기되는 광감각제가 표면에 분포되며, 종양 조직 내에서 분해되는 금속나노시트를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
본 발명에 따른 금속나노시트는 금, 은, 구리, 백금, 팔라듐, 니켈, 철, 망간, 또는 이의 산화물을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 이산화망간 (MnO2)을 함유할 수 있다. 특히, 이산화망간은 수용액에 대한 용해성이 우수하고, 소분자 및 생체 고분자와의 강한 상호작용 및 생체 내에서 예기치 않은 축적 없이 분해 및 배설에 따른 높은 생체 적합성을 갖는다. 또한, 질량 대비 매우 넓은 표면적에 따른 우수한 약물 적재 효율, 및 광범위한 파장대의 빛을 흡수함으로써 적재한 물질의 형광신호를 소광시키는 능력이 우수하다는 이점을 갖는바, 효과적인 광감각제의 전달체로서 사용될 수 있다. 또한, 아연-프탈로시아닌 광감제와 함께 사용될 때, 프탈로시아닌의 N과 이산화망간의 Mn이 배위결합을 이루어 강하게 결합할 수 있다.
금속나노시트의 표면에는 엽산 및 광감각제가 분포되어 있다.
엽산은 예를 들면, 금속나노시트 상에 적재되거나, 금속나노시트와 엽산 사이의 정전기적 상호작용, 배위결합, 및 공유결합 등의 방법으로 결합됨으로써 그 표면에 분포될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 암세포는 그 표면에 다량의 엽산 수용체를 가지므로, 금속나노시트에 표면에 엽산이 분포됨으로써 금속나노시트가 암세포 표면에 결합할 수 있고, 이후 엔토사이토시스에 의해 암세포 내로 이입될 수 있다.
광감각제는 예를 들면 금속나노시트와 광감각제 사이의 소수성 상호작용 (hydrophobic interaction), 파이-파이 상호작용 (pi-pi stacking interaction), 정전기적 상호작용, 수소결합, 배위결합, 공유결합 등 다양한 분자간 상호작용에 의해 로딩된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제는 프탈로시아닌계 (phtalocyanine) 화합물, 포르피린계 (phorphyrins) 화합물, 클로린계 (chlorins) 화합물, 박테리오클로린계 (bacteriochlorins) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 또는 5-아미노레불린 에스테르계 (5-aminoevuline esters) 화합물일 수 있으며, 구체적으로 아연-프탈로시아닌 (ZnPC)일 수 있다. 이때, 프탈로시아닌계의 광감각제는 대부분의 금속 이온과 배위결합 형태로 존재할 수 있으며, 특히 아연의 경우 인체 내 주요 호르몬, 효소 및 면역 작용에 필수 요소에 해당하는바, 아연-프탈로시아닌은 합성이 용이하고 경제적이라는 장점이 존재한다. 또한, 아연-프탈로시아닌은 흡광계수가 높아 적은 양으로도 효과적인 광역동 치료가 가능하다.
아연-프탈로시아닌은 난용성 물질로서 약물로의 사용이 매우 제한적인데, 본 발명은 나노시트가 이산화망간을 함유하는 경우에 아연-프탈로시아닌을 함께 사용하는 경우, Mn-N 배위 결합을 형성하여 아연-프탈로시아닌을 적재함으로써 약물 적재 효율을 현저히 상승시킬 수 있다.
광감각제로 아연-프탈로시아닌을 사용하는 경우의 구체적인 예를 들자면, 아연-프탈로시아닌은 통상 분말 형태로 판매되는데(예를 들어, 시그마알드리치사 제품), 본 발명은 감소된 입경을 갖는 아연-프탈로시아닌을 사용할 수 있으며, 예를 들면 분말 입경이 10㎛ 이하, 5㎛ 이하, 2.5㎛ 이하 등일 수 있다. 그러한 경우에 이산화망간 나노시트와 함께 사용시 아연-프탈로시아닌 분자가 보다 많은 양의 배위 결합을 이룰 수 있어, 나노시트에의 적재 효율이 현저히 높아질 수 있다. 이는 아연-프탈로시아닌 분말을 입도 감소 처리(저입도화 처리)를 거쳐 얻어진 것일 수 있으며, 예를 들면 체질하거나(sieving), 미세필터로 여과시키거나, 분말을 다시 분쇄처리하거나, 분말을 분산시킨 분산액을 증발시키는 등의 방식에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 감광각제는 기저상태에 있을 때는 독성을 나타내지 않으나, 특정 파장의 광을 흡수하면 일중항 상태 (single state)로 여기된다. 일중항 상태의 광감각제 중 일부는 형광의 형태로 에너지를 발산하면서 기저상태로 돌아가고, 대부분은 계간 전이 (intersystem crossing)를 통해 삼중항 상태 (triplet state)로 전이된다. 상기 일중항 상태 또는 삼중항 상태의 광감각제는 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 활성 산소종 (reactive oxygen species), 예를 들어 일중항 산소, 산소 라디칼, 슈퍼 옥사이드 (super oxide) 또는 퍼옥사이드 (peroxide)를 생성한다. 생성된 활성 산소종은 주변 종양 세포를 사멸 (apoptosis) 또는 괴사 (necrosis)시킬 수 있다.
상기 광감각제는 조직 내 광침투 가능성 및 활성 산소종의 생성 효율을 고려할 때, 450 내지 950 nm, 바람직하게는 600 내지 800 nm 범위 파장의 광 조사시 여기되어, 일중항 산소 또는 자유 라디칼을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 금속나노시트는 그 표면에 엽산 및 광감각제가 분포된 광감각제-금속나노시트 복합체의 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있으며, 조성물을 체내에 투여한 후 혈액 내에서 순환하는 동안에는 상기 광감각제가 상기 금속나노시트로부터 해리되지 않고, 복합체 형태를 유지할 수 있다.
상기 복합체에서 광감각제는 예를 들면 복합체 총 중량 중 5 내지 30중량%, 상기 범위 내에서 5 내지 30중량%, 5 내지 20중량%, 5 내지 15중량%, 5 내지 10중량% 등의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 복합체는 광감각제 자체에 비해 크기가 커서 상대적으로 혈관벽이 촘촘한 정상조직에는 쉽게 침투하기 어려워 혈액 내에서 분해되지 않고 안정성을 유지할 수 있으나, 종양에 과다 발현된 엽산 수용체 매개 엔도사이토시스 (FA receptor mediated endocytosis)에 의해 종양 세포 내로 이입될 수 있어, 종양 세포 내에 매우 용이하게 축적될 수 있다. 그 결과, 상기 복합체는 종양 조직에 특이적으로 축적될 수 있다.
종양 조직에 특이적으로 축적된 복합체는 시간이 경과함에 따라 광감각제가 금속나노시트로부터 서서히 분리되어 해리된다. 그 후, 상기 광감각제를 여기시킬 수 있는 파장을 갖는 광에 노출되면, 상기 광감각제는 일중항 상태(single state)로 여기되며, 상기 일중항 상태의 광감각제는 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 활성 산소종 (reactive oxygen species)을 생성한다. 생성된 활성 산소종은 주변 종양 세포를 사멸 (apoptosis) 또는 괴사 (necrosis)시킬 수 있다. 이와 같이, 종양 조직에 특이적 축적된 복합체가 서서히 해리됨에 따라 광역학 처리과정에서 종양조직을 효과적으로 파괴할 수 있으며, 이때, 금속나노시트는 광감각제 적재 유/무에 관계 없이, 종양 세포 내 존재하는 글루타티온 (glutathione)과 같은 환원제에 의해 쉽게 분해될 수 있으며, 금속나노시트가 분해됨으로써 적재된 약물 (또는 광감각제)를 방출한다. 또한, 종양조직에서의 선택적 형광 발생을 통하여 종양 진단을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 암은 그 표면에 엽산 수용체를 발현하는 종양 세포로부터 기인하는 모든 암일 수 있다. 예를 들면, 피부암, 구강암, 위암, 난소암, 유방암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 신장암, 폐암, 췌장암, 자궁 경부암 및 전립선암 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조되거나, 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 약학적으로 유효한 양의 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 얄려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기에서 "약제학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 암 치료를 필요로 하는 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 조성물의 암 치료제로서의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 포유동물에게 치료상 유효량의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말하며, "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법은 금속나노시트 표면에 엽산을 분포시키는 단계; 및 상기 엽산이 분포된 금속나노시트의 표면에 광감각제를 분포시키는 단계를 포함한다.
금속나노시트의 표면에의 엽산의 분포는 예를 들면 금속나노시트가 분산 또는 용해된 용매에 엽산을 혼합하고 교반하여 수행될 수 있다.
금속나노시트의 금속으로는 앞서 예시한 금속들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 MnO2를 사용할 수 있다.
용매로는 예를 들면 물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
교반은 예를 들면 초음파 처리에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
교반은 온도는 예를 들면 0℃ 내지 30℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라, 본 발명의 방법은 상기 금속나노시트 표면에 엽산을 분포시킨 다음에 이를 여과시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
여과는 예를 들면 1kDa 내지 50kDa의 막으로 투석하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 2kDa 내지 20kDa의 막으로 투석할 수 있고, 더욱 구체적으로는 5kDa 내지 15kDa의 막으로 투석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후, 상기 엽산이 분포된 금속나노시트의 표면에 광감각제를 분포시킨다. 이에 의해 금속나노시트의 표면의 일부에는 엽산이 분포하게 되고, 또한 나머지 일부에는 광감각제가 분포하게 된다.
엽산이 분포된 금속나노시트의 표면에의 광감각제의 분포는 예를 들면 상기 광감각제가 분산 또는 용해된 용매에 광감각제를 혼합하고 교반하여 수행될 수 있다.
광감각제로는 앞서 예시한 것들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아연-프탈로시아닌을 사용할 수 있다.
구체적인 예를 들면, 아연-프탈로시아닌은 분말상일 수 있고, 바람직하게는 이는 입도 감소 처리를 거친 것일 수 있다. 이에 본 발명은 아연-프탈로시아닌을 입도 감소 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러한 경우 아연-프탈로시아닌을 MnO2 금속나노시트와 함께 사용하는 경우에 아연-프탈로시아닌 분자와 금속나노시트간의 결합을 증가시켜, 적재 효율을 더욱 개선할 수 있다.
입도 감소 처리는 아연-프탈로시아닌 분말의 입경을 감소시키는 처리로서, 분말의 입경 감소에 사용되는 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들면 체질하거나(sieving), 미세필터로 여과시키거나, 분말을 다시 분쇄처리하거나, 분말을 분산시킨 분산액을 증발시키는 등의 방식에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
입도 감소 처리는 예를 들면 분말 입경이 10㎛ 이하, 5㎛ 이하, 2.5㎛ 이하 등이 되도록 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매는 예를 들면 물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
교반은 예를 들면 초음파 처리에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
교반은 온도는 예를 들면 0℃ 내지 30℃에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라, 본 발명의 방법은 상기 엽산이 분포된 금속나노시트의 표면에 광감각제를 분포시킨 다음에 이를 여과시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
여과는 예를 들면 0.01㎛ 내지 1㎛의 필터로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 0.1㎛ 내지 0.5㎛의 필터로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에서는 엽산 (FA)-결합 MnO2 (FA-MnO2) 나노시트가 광역동 치료 (PDT) 및 바이오 이미징 시스템을 위한 광감각제 (PS)의 운반체로서 사용될 수 있는 지 여부를 확인하고, 이를 이용한 효과적인 암 치료용 조성물 제조를 위해, 세포 실험을 통하여 광역동 치료 효과를 분석함으로써 FA-MnO2 나노시트의 우수성을 검증하였다.
1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 시료 준비
FA (Folic acid) 및 ZnPc (Zinc phthalocyanine)는 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구입하였고, CCK-8 분석키트는 Dojindo Molecular Technologies사 (USA)로부터 구입하였다. 포유류 세포에 대한 Live/dead viability/cytotoxicity kit (Calcein AM 및 ethidium homodimer-1) 및 singlet oxygen sensor green (SOSG)는 ThermoFisher Scientific (USA)에서 구입하였으며, PBS (Phosphate buffered saline, 10x), DMEM (Dulbecco’s modified eagle's medium), RPMI (Rosewell park memorial institute) 1640, FBS (소태아혈청) 및 P/S (페니실린 및 스트렙토마이신, 100x)는 WELGENE (대한민국)에서 구입하였다.
1-2. 특성화 (Characterization)
UV-vis 스펙트럼은 UV-2550 (Shimadzu, Japan)으로 수득하였다. 작용 기 (functional group)의 화학적 변형을 확인하기 위하여, KBr 펠렛 (pellet)을 사용하여 Nicolet iSTM 10 FT-IR 분광기 (Thermo Fisher Scientific, USA)를 통하여 FT-IR 스펙트럼을 특성화하였다. 형태학적 이미지와 두께는 원자력 현미경 (AFM), 30 nm 두께의 알루미늄 뒷면 리플렉스 코팅된 프로브 (비접촉-캔틸레버)와 XE-100 (Park System, Korea), 및 투과 전자 현미경 (TEM, LIBRA 123, Carl Zeiss)을 사용하여 확인하였다. 또한, XPS (AXIS-HSi, Shimadzu, Japan)는 물질의 원소 조성을 분석하기 위하여 수행되었으며, 수력학적 반경 및 제타 전위는 zetasizer NS90 (Malvern, UK)으로 측정하였다.
1-3. FA- MnO 2 나노시트 및 FA- MnO 2 / ZnPc 복합체 제조
준비된 MnO2 (1 mg ml- 1)를 수용액 중에서 FA (50 mM)와 혼합하고 얼음 수조 (bath)에서 2 시간 초음파 처리한 후, 실온에서 1 시간 동안 교반하고 10 kDa 막으로 밤새 투석하였다. ZnPc가 첨가된 FA-MnO2를 제조하기 위하여, ZnPc를 FA-MnO2 용액과 혼합한 후 얼음 수조에서 1 시간 초음파 처리한 후, polyvinyl difluoride (PVDF) 0.2μm syringe filter (Merck Millipore, USA)로 여과하였다. 이때, UV-vis 분광법 및 ZnPc의 흡광도 표준곡선을 이용하여 계산한 FA-MnO2-ZnPc 복합체에서의 ZnPc의 적재 용량은 ~8 wt%이었다. ZnPc는 상기 혼합 전에 5000메쉬(약 2.5㎛)의 체로 걸러 사용하였다.
또한, Synergy MX 형광 측정기 (BioTek, Inc.)를 사용하여 FAMnO2 (1.0 mg ml-1)의 존재 또는 부재 하에서 650 nm의 여기 파장에서 얻은 ZnPc (0.4 μM)의 형광 방출 스펙트럼에 의해 FA-MnO2에 대한 ZnPc의 로딩을 평가하였다. FA-MnO2로부터 ZnPc의 방출은 환원 조건에서 ZnPc의 회수된 형광에 의해 측정하였다. GSH 및 DTT (10 mM)를 FAMnO2/ZnPc 용액에 첨가하고 670 nm 발광 파장에서 형광 세기를 30 분마다 측정하였다. 시간-의존적 형광 스펙트럼은 ZnPc의 초기 형광에 비례하여 플롯되었으며, BSA 및 FBS 첨가 샘플을 대조군으로 사용하였다.
1-4. 세포 배양
인간 자궁경부암 세포주 HeLa 및 유방암 세포주 MDA-MB-231을 10 % FBS, 및 1 % P/S를 함유하는 DMEM에서, 5 % CO2, 37 ℃ 조건 하에 배양하였고, 인간 폐포 기저상피 세포주인 A-549는 RPMI 1640에서 동일한 성분 및 조건으로 배양하였다.
1-5. 세포 생존능 분석
FA-MnO2로 처리된 세포의 생존력을 측정하기 위하여, HeLa 세포 (1×104 세포/웰)를 96-웰 플레이트 3 개에서 24 시간 동안 준비하고, 다양한 농도의 FA-MnO2와 완전한 배지로 배양하였다. 12 시간 배양 후, 세포를 1x PBS로 조심스럽게 세척하고, CCK-8 분석 용액을 무-혈청 배지와 함께 1 시간 동안 첨가한 후, 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Inc., USA)를 사용하여 450 및 670 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
1-6. 세포 이미징 및 유세포 분석 (Cellular imaging and flow cytometry )
HeLa 세포 (1.2×105 세포/웰)를 4-웰 유리판에 24 시간 동안 배양하고, MnO2 유도체를 무-혈청 배지에서 12 시간 동안 각 웰에 첨가 하였다. FR-매개 세포 흡수 (cell uptake)의 영향을 확인하기 위하여, FA-MnO2/ZnPc (50 μg ml-1) 처리 전 2 시간 동안 유리-FA (10 mM)를 세포에 처리하였다. 12 시간 배양 후, 세포를 1X PBS로 조심스럽게 세척하고, 배지를 혈청 함유 신선한 배지로 대체하였다. MDA-MB-231 세포 및 A-549 세포는 유리-FA 처리를 제외하고 동일한 절차로 제조하였다.
제조사의 프로토콜에 따라 핵을 Hoechst 33342 염색 키트로 염색한 후, DeltaVision Elite Microscopy System 및 IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, USA)을 사용하여 명시야 및 형광 이미지를 얻었으며, 획득된 이미지는 제공된 소프트웨어를 사용하여 의사 착색 (pseudo-coloring), 형광 강도 및 배경 제거 프로세스를 위하여 사용되었다.
ZnPc의 정량적 평균 형광을 분석하기 위하여, MnO2 유도체로 처리된 HeLa 세포를 트립신-EDTA 처리 후 3 분간 수집 한 후, 수집된 세포에 10 % FBS를 첨가 한 후 원심분리 (1200 rpm, 3 분)하였다. 세포를 최종적으로 1X PBS로 세척하고, 세포의 형광을 유동 세포 형광 측정기 (FACS Canto, Beckton Dickinson Bioscience, USA)로 측정하였다. 수집된 유동 세포 계측 데이터를 FlowJo 소프트웨어로 분석하였다.
1-7. ( in vitro ) 광역동 치료 ( Photodynamic therapy)
시험관내 (in vitro) PDT (Photodynamic therapy)에 의한 치료 효과를 확인하기 위하여, 무-혈청 배지에서 FA-MnO2/ZnPc (50 μg ml- 1)을 12-웰 플레이트에서 24 시간 동안 전처리된 HeLa 세포 (1.2×105 세포/웰)에 처리하였다. 혈청 함유 배지로 배지를 교환 한 후 660 nm fiber-coupled laser (LaserLab, Korea, 30 mW cm-2)로 10 분간 세포를 조사하였다. 추가로 12 시간 배양 후, 각 웰을 제조자의 프로토콜에 근거한 라이브/데드 (Live/Dead) 분석 시약으로 처리하였다. 세포의 밝은 영역과 형광 이미지는 4X 대물렌즈가 있는 역 형광 현미경인 IX70 (Olympus, Japan)을 사용하여 얻었다.
다음으로, FA-MnO2/ZnPc의 광역학 효과와 관련된 양적 세포 생존능을 확인하기 위하여, HeLa 세포 (1×104 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 접종하고, 24 시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 FA-MnO2/ZnPc 및 ZnPc로 처리하였다. 배양 12 시간 후, 각 웰에 660 nm LED (Mikwang Electronics, Korea)를 30 mW cm-2로 10 분간 조사하였다. 혈청 함유 배지와 함께 12 시간 더 배양 후, CCK-8 세포 생존능 분석을 상기와 같이 수행하였다.
모든 실험은 3 중으로 수행되었다.
1-8. 일중항 산소 검출 ( Singlet oxygen detection)
SOSG 시약은 SO에 대해 매우 선택적이며 530 nm에서 SO가 존재할 때 강한 녹색 형광을 방출한다 (λex = 504 nm). ZnPc (3.2 μM) 및 FA-MnO2/ZnPc (1.0 mg ml-1)에 2 % 메탄올 용액에 용해된 SOSG (5.0 μM)를 첨가한 후, 필요에 따라 GSH (10 mM)를 첨가하였다. 각 웰의 최종 부피는 100 ml였다. SO의 생성은 660 nm의 LED (lightemitting diode) (30 mW cm- 2)를 사용하여 조사함으로써 유도되었다. 조사 후, 형광 측정기를 사용하여 샘플로부터의 녹색 형광 방출을 530 nm 파장에서 55 분 동안 관찰하였다.
1-9. ( in vivo ) 이미징 기초 생물 분류 및 PDT의 항암 효과
모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험 윤리위원회 (IACUC)가 승인한 프로토콜을 준수하여 수행되었다. Balb/c 수컷 누드 마우스 (5 주령)는 ORIENT BIO (Korea)로부터 구입하였다. 종양-보유 마우스는 멸균된 1x PBS (n=4) 100 μl와 HeLa 세포 (6×106 세포)의 현탁액을 피하 주사하여 제조하였다. 종양 크기가 ~ 50 mm3에 이르면, 1x PBS 용액 (0.5 mg ZnPc /kg) 중 MnO2/ZnPc 및 FA-MnO2/ZnPc를 종양-보유 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 대조군으로서, 한 그룹의 마우스를 동일한 부피의 1x PBS 용액으로 처리하였다. 명시야 및 형광 이미지는 주입 12 시간 후 Optix MX3 (ART, USA)를 사용하여 얻었다. 주입된 ZnPc의 생체 분포를 확인하기 위하여, 주사 12 시간 후 주요 장기를 페트리 접시에 수집하였다. 모든 획득된 이미지는 형광 강도로 의사 착색 (pseudo-coloring)을 위해 사용되었다.
항암 효과를 확인하기 위하여, MnO2 및 FA-MnO2 (0.5 mg ZnPc /kg)를 함유한 ZnPc를 100 μl의 최종 부피로 준비하였으며, 1x PBS를 대조군으로 준비하였다. HeLa 이식 된 이종 이식 마우스의 종양 부피가 ~ 50 mm3 (n=4)에 도달하였을 때, 상기 현탁액을 정맥 주사하였다. 주사 12 시간 후, 660 nm fiber-coupled laser (0.2 W cm-2, 10 분)를 사용하여 조사하였으며, 종양의 부피 및 체중의 변화를 2 주에 걸쳐 각 그룹에서 모니터링하였다. 종양의 부피는 길이와 폭이 각각 종양의 가장 긴 직경과 가장 짧은 직경 (mm)인 길이×(폭)2×1/2의 식을 사용하여 계산하였다. 상대적인 종양 부피는 초기 부피와 비교하여 계산하였다.
1-10. 조직학적 평가 ( Histological evaluation)
조직학적 평가는 정맥 내 주사 14 일째 PDT 후, 마우스를 희생시킴으로써 이루어졌다. 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양의 샘플을 채취하여 4 % PFA 용액에 넣고, 샘플을 자당-침투된 최적 절삭 온도 (OCT) 화합물에 임베딩 (embedded)하고 절편한 후, H&E 염색 (BBC Biochemical, Mt Vernon, WA, USA)을 수행하였다. 염색된 절편은 10X 대물렌즈가 있는 BX71 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
1-11. 통계학적 분석 (Statistical analysis)
모든 데이터는 최소 4 번의 독립적인 실험의 보정값±SD를 의미하며, 유의한 차이는 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 수행한 Student's t-test를 기준으로 결정되었다.
실시예1
1. FA- MnO 2 나노시트 ( nanosheet )의 제조
먼저, 상기 1-3의 방법으로, 이전의 공지된 절차에 일부 변형을 가하여 MnO2를 합성한 후, XPS, AFM, TEM 및 FTIR 분석을 사용하여 제조된 MnO2 나노시트를 특성화한 후, FA를 MnO2 나노시트에 접합시켰으며, 제조된 FA-MnO2 나노시트의 특징은 도 2에 나타내었다.
우선, AFM 및 TEM 이미지로부터 얻은 선윤곽 (line profile)을 갖는 지형 이미지를 통하여, 평균 약 3-10 nm 높이의 FA-MnO2 나노시트를 확인할 수 있었고 (도 2a 및 b 참조), 또한, MnO2에 대한 FA 결합 후, 탄소 및 질소의 원소 조성은 각각 63.5 및 9.19 %로 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었으며, MnO2에 기인한 370 nm의 특징적인 피크와 함께 FA에 상응하는 날카로운 UV-흡수 피크가 282 nm에서 나타남을 확인하였다 (도 2c 및 d 참조). 마지막으로, FT-IR을 통하여 고유 피크인 515 cm-1 (Mn-O) 및 479 cm-1 (Mn-N) 뿐만 아니라, FA의 부가적인 투과율 피크인 963 cm-1 (O-H bend) 및 900-750 cm-1 (C-H, aromatics)을 확인하였으며 (도 2e 참조), 제타 전위 값은 MnO2로의 FA 접합 후 -19.43±0.63 mV에서 -32.1±0.1 mV로 변한 것을 확인할 수 있었다.
상기 내용을 종합한 결과, FA-MnO2 나노시트가 성공적으로 제조된 것을 알 수 있었다.
2. FA- MnO 2 / ZnPc 복합체 (complex)의 제조
상기 실시예 2에서 제조된 FA-MnO2와 ZnPc (photosensitizer, PS 해당)의 혼합 용액을 간단히 초음파 처리하여 ZnPc 및 FA-MnO2 복합체 (FA-MnO2/ZnPc)를 제조하였다.
이때, 정전기적 상호작용 및 Mn-N 배위에 의해 FA-MnO2에 ZnPc가 로딩되며, FA-MnO2/ZnPc 착물은 627 및 729 nm 파장 UV-Vis 흡수 스펙트럼에서 적색 변위 피크, 670 nm 파장 (λex = 647 nm)에서 ZnPc의 형광 소광 및 잘 분산된 용액에서 다크 옐로우 (FA-MnO2)로부터 밝은 녹색 (FA-MnO2/ZnPc)으로 색이 변하는 것을 확인하였다. 이러한 광학적 특성은 ZnPc가 FA-MnO2에 성공적으로 로딩되었음을 의미하며, 정량적 측정 결과, FA-MnO2 나노시트에 ZnPc가 ~8 wt%의 용량으로 로딩되었다 (도 4a 참조). 응집 구조 없이 증가된 높이를 보여주는 AFM 이미지도 FA-MnO2 나노시트의 표면에 ZnPc가 성공적으로 로딩된 것을 뒷받침하였다 (도 7).
실험예
1. GSH에 의한 MnO 2 의 분해 및 이에 따른 ZnPc 분리 확인
세포질에 풍부하게 존재하는 환원제인 글루타치온 (Glutathione, GSH)는 MnO2의 분해를 유도하여, Mn2 + 양이온을 형성하는바, 세포 내로 들어간 MnO2 나노시트로부터 ZnPc가 쉽게 분리될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 FA-MnO2/ZnPc 복합체로부터 ZnPc가 쉽게 분리될 수 있는지 여부를 실험으로 확인하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc 용액에 GSH를 첨가하는 경우, ZnPc의 제거된 형광이 서서히 회복됨으로써, GSH에 의해 매개되는 FA-MnO2의 분해가 FA-MnO2/ZnPc 복합체로부터 ZnPc의 방출을 가능하게 한다는 것을 보여주었다. 반면, 무-GSH 조건 및 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 FBS와 같은 단백질을 첨가하는 경우, FA-MnO2/ZnPc 복합체의 분해를 거의 유도하지 않음을 알 수 있었다.
따라서, FA-MnO2/ZnPc 복합체는 어떠한 중합체 접합 또는 계면활성제의 첨가 없이도, 간단한 제조를 통해 생리적 조건에 용이하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
2. FA- MnO 2 / ZnPc 복합체의 종양 표적화 확인
FA-과발현 세포에 대한 FA-MnO2/ZnPc 복합체의 표적화 능력을 확인하기 위하여, 혈액 농도에 상응하는 낮은 농도의 GSH (1 mM)에서는 FA-MnO2의 특성에 현저한 변화가 관찰되지 않는 것에 기초하여, 인간 자궁경부암 세포인 HeLa 세포에 FR-α를 과발현시킨 후, 670 nm (λex = 647 nm)에서 ZnPc의 적색 형광을 관찰함으로써, MnO2 또는 FA-MnO2에 의한 ZnPc의 세포 내 전달을 평가하였다. 이때, FA-MnO2/ZnPc의 FA-매개 세포 내 흡수 (intercellular uptake)를 차단하기 위하여, FA-MnO2/ZnPc를 처리하기 전, FR을 포화시키기 위한 유리-FA를 HeLa 세포 표면에 2 시간 동안 전처리하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc 처리 세포의 세포질에서는 ZnPc의 강렬한 적색 형광이 나타난 반면, 대조적으로 유리-FA로 전처리된 MnO2/ZnPc 또는 FA-MnO2/ZnPc 처리 세포에서는 이러한 현저한 형광은 나타나지 않았다. 이러한 결과는, ZnPc이 FA-MnO2에 의하여 FA-매개 표적화되어 세포 내로 전달됨을 의미한다.
다음으로, FA-MnO2/ZnPc 복합체에 의한 ZnPc 흡수 정도를 확인하기 위하여, 유세포 분석기를 사용하여 흡수된 ZnPc의 정량 측정을 수행하여, 도 4b에 HeLa 세포에서 ZnPc의 형광 강도와 상관관계가 있는 세포 집단 히스토그램을 나타내었으며, 각 영역의 평균 형광을 계산하여 도 4c에 바 그래프로 나타내었다. 이를 통하여, FA-MnO2에 의한 FA-매개 ZnPc 전달을 양적으로도 확인하였다.
나아가, 상기의 FA-MnO2에 의한 표적화가 FA 및 FR 사이의 상호작용을 기반으로 하고 있음을 확인하기 위하여, 각각 FR 양성 (FR+) 및 FR 음성 (FR-) 세포인 MDA-MB-231 세포 (인간 유방암 세포주) 및 A-549 세포 (인간 폐포 기저상피 세포주)를 사용하여 ZnPc의 적색 형광을 관찰한 결과, FA-MnO2/ZnPc 처리된 MDA-MB-231 세포의 세포질에서 ZnPc의 강렬한 적색 형광이 관찰된 반면, MnO2/ZnPc 처리된 MDA-MB-231 세포, 및 MnO2/ZnPc 또는 FA-MnO2/ZnPc 처리된 A-549 세포에서는 형광이 거의 관찰되지 않았다 (도 8). 이러한 결과는, FA-과발현 세포 표면에서의 FA-FR 상호 작용을 통해 FA-MnO2/ZnPc가 엽산 수용체-매개 엔도시토시스 (endocytosis)에 의해 효과적으로 세포 내재화됨으로써, FA-MnO2가 활성 표적 약물 전달체로서 사용될 수 있음을 시사한다.
3. ( in vitro ) FA- MnO 2 / ZnPc 복합체의 광역학 치료 효과 확인
상기 실시예 결과들을 바탕으로, FA-MnO2/ZnPc 복합체의 광역학 치료 효과를 확인하였다.
먼저, HeLa 세포에서 세포 생존능 분석을 수행한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc 처리 세포의 경우, 각각 죽은 세포 및 살아있는 세포에서 유래한 572 nm에서의 적색 형광 (λex = 547 nm) 및 520 nm에서의 녹색 형광 (λex = 490 nm)은 녹색 형광만이 관찰된 다른 세포군과는 달리, 조사된 영역과 비조사된 영역의 경계가 뚜렷하게 구별되는 것을 관찰할 수 있었다.
다음으로, SO (single oxygen)의 생성에 의해 530 nm (λex = 504 nm)에서 SOSG의 녹색 형광이 강화되는 것을 바탕으로, SO의 생성을 정량적으로 조사하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, GSH-매개 MnO2 분해 및 광-유도 ZnPc 활성화에 의하여 SO가 생성되는 것을 확인하였으며, 이는 도 3b의 결과와 일치한다.
마지막으로, 다양한 농도의 FA-MnO2/ZnPc를 배양된 세포의 전체 웰에 빛을 조사하여 HeLa 세포에 처리한 후, CCK-8 세포 생존능 분석을 실시하여 용량-의존적인 PDT 효과를 평가하였다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc의 IC50 값은 38.1±2.2 μg/ml로, ZnPc 단독의 값인 115.1±3.4 μg/ml 보다 낮게 나타남을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 살아있는 세포에서 FA-MnO2/ZnPc의 효과적인 PDT 효과를 시사한다.
4. ( in vivo ) FA- MnO 2 / ZnPc 복합체의 종양 표적화 및 항암 효과 확인
시험관내 (in vitro) FA-MnO2/ZnPc 복합체의 표적화 및 광역학 치료 효과를 바탕으로, 마우스 모델을 사용하여 종양 조직에 대한 표적화된 축적 및 생체 내 (in vivo) 항암 효과를 확인하였다.
먼저, FA-MnO2 나노시트에 의해 전달된 ZnPc의 생체 내 분포를 모니터링하기 위하여, 상기 실시예 1-9의 방법으로 종양-보유 마우스를 제조하여 MnO2/ZnPc, FA-MnO2/ZnPc 및 PBS (대조군)를 정맥 주사하고, 12 시간 후, 종양의 형광 신호를 관찰하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc로 처리한 종양에서는 ZnPc의 강렬한 적색 형광이 관찰된 반면, MnO2/ZnPc 또는 PBS로 처리한 종양에서는 이와 같은 형광이 관찰되지 않았다.
또한, 마우스에서 분리된 FA-MnO2/ZnPc 처리 종양 조직 절편에서 다른 종양 그룹에 비해 현저한 형광 신호를 확인하였다 (도 9a). 또한, ZnPc의 적색 형광은 MnO2/ZnPc 및 FA-MnO2/ZnPc 처리 마우스 (도 9b)의 간에서 확인할 수 있었으며, 150 nm 크기의 MnO2/ZnPc 나노시트는 간과 비장에 쉽게 축적되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 생체 내에서 수정되지 않은 MnO2에 비해 FA-MnO2이 FR-양성 종양에 대한 표적화된 축적에 더욱 효과적임을 시사한다.
마지막으로, 인간 암 이종이식 (xenograft) 모델에 대한 FA-MnO2/ZnPc의 광역학적 항암 효과를 확인하였다.
각 종양의 부피를 50 mm3까지 성장시킨 후, FA-MnO2, MnO2/ZnPc, FA-MnO2/ZnPc (0.5 mg ZnPc /kg, 100 μl) 및 PBS를 정맥 주사하고, 12 시간 후, 660 nm 레이저 (0.2 mW cm- 2)로 10 분 동안 빛을 조사하고, 2 주 동안 각 그룹의 종양 부피의 변화를 모니터링하였다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, FA-MnO2/ZnPc로 처리하고 레이저를 조사한 마우스의 종양 성장은 유의하게 억제된 반면, 레이저 조사 여부와 무관하게 FA-MnO2 또는 MnO2/ZnPc로 처리한 군은 대조군과 비교하여 종양 체적에 유의한 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 생체 내에서 FA-MnO2/ZnPc 매개 PDT가 효과적으로 세포 사멸을 유도하고 종양의 성장을 억제하는 것을 시사한다.
FA-MnO2/ZnPc로 처리하고 레이저를 조사한 군과 나머지 군 사이의 통계적으로 유의한 차이를 보이는 상기 결과에 기초하여, FA-MnO2, MnO2/ZnPc, FA-MnO2/ZnPc 및 PBS 처리 14 일 후, 종양 절편의 H&E 염색을 수행하였다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, MnO2 /ZnPc, FA-MnO2 또는 1x PBS 처리 군과는 대조적으로, FA-MnO2/ZnPc (레이저 조사) 처리된 종양에서만 현저한 강도의 암 세포 사멸이 관찰되었다.
종합적으로, 본 발명의 FA-MnO2-기반 PS 전달 시스템은 종양 부위로의 ZnPc 전달의 효율적인 표적화를 통하여, 레이저 조사와 함께 일반적인 유효 투여량 (5.0 mg kg-1) 대비 약 10 %의 PS (0.5 mg kg- 1)의 투여만으로도, 높은 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 FA-MnO2-기반 표적 전달은 우수한 생체 적합성, 생체 영상 능력, 표적화 능력 및 치료 효과를 통하여, FR-양성 암을 치료할 수 있는 향상된 PDT의 효과적인 플랫폼 역할을 할 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. 이산화망간(MnO2) 나노시트; 상기 나노시트 표면의 히드록시기 부분에 결합된 엽산(folic acid); 및 상기 나노시트의 표면 중 상기 엽산이 결합되지 않은 부분에 결합된, 기결정된 파장의 광 조사에 의해 여기되는 광감각제;를 포함하고,
    상기 광감각제는 2.5㎛ 이하의 입경을 갖는 아연-프탈로시아닌 (ZnPc)인, 암 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 이산화망간 나노시트는 엽산 수용체 매개 엔도사이토시스 (FA receptor mediated endocytosis)에 의해 암세포 내로 이입되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 기결정된 파장은 600 내지 800 nm인, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    여기된 광감각제는 일중항 산소 또는 자유라디칼을 발생시키는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 광감각제는 엽산-이산화망간 나노시트-광감각제 복합체 총 중량 중 5 내지 20중량%로 포함되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 아연-프탈로시아닌은 상기 이산화망간 나노시트에 Mn-N 배위결합으로 결합된것 인, 암 치료용 약학 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 입도 감소처리한 분말을 FA-MnO2 용액과 혼합하고 교반하여 이산화망간 나노시트에 결합된 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  13. 청구항 1, 4, 7 내지 9, 11 및 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 피부암, 구강암, 위암, 난소암, 유방암, 골육종, 대장암, 식도암, 십이지장암, 신장암, 폐암, 췌장암, 자궁 경부암 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  14. 이산화망간 (MnO2) 나노시트 표면의 히드록시기 부분에 엽산을 결합시키는 단계; 및
    상기 이산화망간 나노시트의 표면의 엽산이 결합되지 않은 부분에 광감각제를 결합시키는 단계;를 포함하고,
    상기 광감각제는 입경 2.5㎛ 이하의 아연-프탈로시아닌 (ZnPC)인, 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
  15. 삭제
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 광감각제를 결합시키기 전에 광감각제 분말이 2.5㎛ 이하의 입경을 갖도록 아연-프탈로시아닌 분말을 입도 감소 처리하는 단계;를 더 포함하는, 암 치료용 약학 조성물의 제조 방법.
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