CN110960510A - 一种MnO2/FA/PSO纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MnO2/FA/PSO纳米制剂及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种MnO2/FA/PSO纳米制剂,用MnO2纳米层包裹补骨脂素,并用叶酸进行表面修饰;其中,所述MnO2纳米层、补骨脂素和叶酸的质量比为4.8~5.4:1.5~2.5:6.6~8.8。本发明采用MnO2纳米层载体包裹抗肿瘤药物补骨脂素,并在其表面修饰叶酸,负载于MnO2纳米层表面的叶酸能够与肿瘤细胞表面的叶酸受体进行主动靶向作用,有效地逆转了肿瘤细胞多药耐药作用,提高了补骨脂素的溶解性和生物利用度;另外,该MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径均匀,稳定性好,能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖和生长,促进其凋亡,在制备乳腺癌治疗药物中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地,涉及一种MnO2/FA/PSO纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,化疗是目前治疗乳腺癌的主要手段,但是肿瘤的多样性及复杂性常诱导肿瘤细胞出现多药耐药(MDR),导致肿瘤细胞对化疗药敏感性降低,最终使化疗失败。肿瘤MDR是指肿瘤细胞不仅对某种抗癌药物产生耐药性,而且对其它结构无关、作用机理各异的药物产生交叉耐药性,其发生分子机制主要与DNA损伤修复、ABC转运蛋白家族表达和功能异常、肿瘤干细胞、上皮间质转分化、谷胱甘肽-S-转移酶表达改变、表观遗传学修饰及缺氧等有关。因此,寻找有效逆转MDR药物是临床化疗亟需解决的问题。
补骨脂为补益类中药材,性温、味辛苦,补肾助阳,主要来源于豆科植物补骨脂,是一种香豆素类化合物,具有免疫调节、抗炎和抗肿瘤功效。补骨脂素(PSO)为呋喃香豆素类化合物,是补骨脂的主要活性成分,与补骨脂药材功效接近。现有技术中,蔡宇等(2004)对补骨脂素逆转肿瘤多药耐药的作用及机理进行了研究,证实了补骨脂素对多种小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤、肝癌等有生长抑制和体外细胞毒作用,逆转白血病多药耐药作用。但是,补骨脂素水溶性极低,生物利用度差,使得其应用受到限制。
因此,研究开发一种能够提高补骨脂素的水溶性和生物利用度,有效逆转肿瘤细胞多药耐药,且对乳腺癌具有显著治疗作用的药物具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的的缺陷和不足,提供一种MnO2/FA/PSO纳米制剂及其制备方法和应用。
本发明的目的是提供一种MnO2/FA/PSO纳米制剂。
本发明另一目的是提供所述纳米制剂的制备方法。
本发明又一目的是提供所述纳米制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明首先提供了一种MnO2/FA/PSO纳米制剂,用MnO2纳米层包裹补骨脂素,并用叶酸进行表面修饰;其中,所述MnO2纳米层、补骨脂素和叶酸的质量比为4.8~5.4:1.5~2.5:6.6~8.8。
该MnO2/FA/PSO纳米制剂中,MnO2作为一种无机材料,具有低密度、高比表面积、高稳定性和表面渗透性的特点,可容纳大量客体分子或大尺寸客体,从而产生一些微观包裹效应,MnO2纳米层还可通过与肿瘤微环境中的H2O2反应生成O2,进而改善微环境低氧状态;此外,乳腺癌肿瘤细胞高表达叶酸受体;本发明采用MnO2纳米层载体包裹抗肿瘤药物补骨脂素,并在其表面修饰叶酸,来增强肿瘤细胞的摄取,提高补骨脂素的生物利用度,从而达到显著的抗乳腺癌的效果。
优选地,所述MnO2纳米层、补骨脂素和叶酸的质量比为5.4:2.0:8.8。
另外,本发明还提供了所述纳米制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1.将羟化四甲基铵和过氧化氢溶液加入MnCl2溶液中,利用氧化还原法制备得到MnO2纳米层;
S2.按照权利要求1或2所述质量比在步骤S1制备得到的MnO2纳米层中加入叶酸,超声,探头超声,离心去除沉淀后用PBS溶液分散,再超声,再离心,得到的上清液即为MnO2/FA纳米层溶液;
S3.将补骨脂素加入步骤S2制备得到的MnO2/FA纳米层溶液中,最后超声,最后离心,得到的沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
优选地,步骤S1所述过氧化氢溶液的质量分数(wt%)为1%~3%。
更优选地,步骤S1所述过氧化氢溶液的质量分数为2%。
优选地,步骤S2所述超声的温度为20℃~25℃。
更优选地,步骤S2所述超声的温度为25℃。
优选地,步骤S2所述超声的时间为10~30min。
更优选地,步骤S2所述超声的时间为20min。
优选地,步骤S2所述探头超声的条件为:超声功率150~200W,工作3s,间歇5s,工作60次。
更优选地,步骤S2所述探头超声的条件为:超声功率200W,工作3s,间歇5s,工作60次。
优选地,步骤S2所述再超声的时间为15~20min。
更优选地,步骤S2所述再超声的时间为20min。
优选地,步骤S3所述最后超声的时间为5~15min。
更优选地,步骤S3所述最后超声的时间为10min。
另外,所述纳米制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用,也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用MnO2纳米层载体包裹抗肿瘤药物补骨脂素,并在其表面修饰叶酸,制备得到了MnO2/FA/PSO纳米制剂,MnO2纳米层不仅提高了PSO的溶解性,还能够有效地输送补骨脂素,负载于MnO2纳米层表面的叶酸能够与肿瘤细胞表面的叶酸受体进行主动靶向作用,使得MnO2/FA/PSO纳米制剂选择性地浓集于肿瘤细胞,有效地逆转了肿瘤细胞多药耐药作用,从而有效地提高了补骨脂素的生物利用度;
(2)本发明制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径均匀,稳定性好,具有显著的缓释效果;能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖,改变细胞周期时相分布,阻滞细胞于G2/M期,显著促进细胞凋亡,显著抑制MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤生长,抑瘤率显著增强;另外,该MnO2/FA/PSO纳米制剂得制备方法简便,成本较低,在制备乳腺癌治疗药物中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是MnO2纳米层的紫外光谱扫描结果图。
图2是MnO2纳米层的粒径图。
图3是MnO2纳米层的Zeta电位测定结果图。
图4是MnO2纳米层的TEM图。
图5是MnO2/FA/PSO纳米制剂的形态图。
图6是MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径图。
图7是MnO2/FA/PSO纳米制剂的表面电位测定结果图。
图8是MnO2/FA/PSO纳米制剂的稳定性考察结果图;其中,“A”为MnO2在纯净水中;“B”为MnO2在生理盐水中;“C”为MnO2/FA/PSO纳米制剂在纯净水中;“D”为MnO2/FA/PSO纳米制剂在生理盐水中。
图9是MnO2/FA/PSO纳米制剂的红外光谱扫描结果图;其中,“A”为PSO的红外光谱;“B”为MnO2/FA纳米粒的红外光谱;“C”为PSO与MnO2/FA纳米粒的物理混合物的红外光谱;“D”为MnO2/FA/PSO纳米制剂的红外光谱。
图10是MnO2/FA/PSO纳米制剂的体外释放测定结果图。
图11是MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果图;其中,(A)图为PBS对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果图;(B)图为;MnO2/FA对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果图;(C)图为PSO对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果图;(D)图为MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果图.
图12是MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响结果图。
图13是本发明建立得到的MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠模型图。
图14是MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的体重变化结果图。
图15是MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤形态图。
图16是MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积变化结果图。
图17是乳腺癌细胞MCF-7裸鼠抑瘤率测定结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 MnO2/FA/PSO纳米制剂制备工艺条件的优化
1、超声温度的优化
(1)实验方法
采用超声法制备MnO2/FA/PSO,在制备过程中,超声温度对PSO负载到MnO2/FA造成较大的影响,以此在固定其他制备因素条件不变的情况下,选择超声温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃进行实验,考察超声温度对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响,确定MnO2/FA/PSO制备过程中的最佳超声温度。
(2)实验结果
超声温度对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果如表1所示,可以看出,随着超声温度的升高,MnO2/FA/PSO的粒径出现增大的趋势,包封率出现先增加后减小的趋势;当超声温度大于等于30℃时,MnO2/FA/PSO粒径会出现峰;其中,当超声温度为25℃时,B-PLN具有较小的粒径、粒径均匀,包封率为73.2%;因此,选择最佳超声温度为25℃。
表1超声温度对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果
2、超声时间的确定
(1)实验方法
超声时间对MnO2/FA/PSO纳米粒具有重要的影响,因此固定其他制备因素条件不变的情况下,选择超声时间分别为5min、10min、15min、20min、30min进行实验,考察超声时间对MnO2/FA/PSO的粒径及包封率影响,确定制备MnO2/FA/PSO的最佳超声时间。
(2)实验结果
超声时间对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果如表2所示,可以看出,随着超声时间的增加,制备的MnO2/FA/PSO粒径先减小后增加的趋势,包封率出现先增大后减少的趋势;综合以下考察因素,当超声时间为20min时,MnO2/FA/PSO粒径较小,均匀,且包封率较高;因此,选择最佳超声时间为20min。
表2超声时间对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果
3.3探头超声功率的确定
(1)实验方法
在制备MnO2/FA/PSO的过程中,PSO需通过物理吸附于MnO2/FA,探头超声功率对MnO2/FA/PSO制备具有一定的影响,因此固定其他制备因素条件不变的情况下,选择探头超声功率分别为100W、150W、200W、250W进行实验,考察探头超声功率对MnO2/FA/PSO的粒径及包封率影响,确定制备MnO2/FA/PSO的最佳探头超声功率。
(2)实验结果
探头超声功率对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果如表3所示,可以看出,随着探头超声功率的增大,粒径逐渐减少,但当探头超声功率较大时,该纳米粒体系易出现絮状沉淀,稳定性较差;因此,选择最佳的探头超声功率为200W。
表3探头超声功率对MnO2/FA/PSO粒径及包封率的影响结果(n=3)
实施例2 MnO2纳米层的制备
1、实验方法
(1)MnO2纳米层的制备
将羟化四甲基铵(0.6M,20mL)和15mL质量分数为2%的过氧化氢的混合液在15s内加入到MnCl2(0.3M,10mL)溶液中,混合液由无色变为深棕色,在室温敞口条件下剧烈搅拌后过夜得到悬液;然后将悬液用蒸馏水和甲醇反复进行离心(2000rpm,10min)洗涤,收集沉淀,60℃条件下烘干备用;取10mg上述沉淀复溶在20mL超纯水中,超声10min,在2000rpm条件下进行离心10min,上清液即为MnO2纳米层溶液,冷冻干燥后得到MnO2纳米层颗粒。
(2)MnO2纳米层的性质考察
1)MnO2纳米层的紫外光谱扫描
取上述制备得到的MnO2纳米层颗粒加超纯水在超声条件下使其溶解,并利用紫外分光光度计(UV-2700)在200~800nm范围内进行光谱扫描并记录结果。
2)MnO2纳米层的粒径和Zeta电位的测定
取上述制备得到的MnO2纳米层颗粒,用纳米粒度分析仪测定其粒径;取上述制备得到的MnO2纳米层溶液200μL,加超纯水稀释至2mL并混匀,将样品加入电位杯放入样品池后,设定粒径仪的参数,在室温条件下,使用Nano-ZS90激光纳米粒度分析仪对MnO2纳米层溶液的电位进行测定、记录和分析。
3)MnO2纳米层的形态学考察
采用透射电子显微镜(TEM)观察MnO2纳米层的外观形态。
2、实验结果
MnO2纳米层的紫外光谱扫描结果如图1所示,可以看出,该MnO2纳米层颗粒的最大紫外吸收波长为367nm。MnO2纳米层的粒径和Zeta电位的测定结果分别如图2和图3所示,可以看出,该MnO2纳米层的粒径为43.75nm,Zeta电位为-22.31±0.03mV。MnO2纳米层的TEM图如图4所示,可以看出,该MnO2纳米层为椭圆形的片层状结构,大小为30~60nm,大小均匀,无聚集现象。
实施例3 MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
(1)MnO2/FA纳米粒的制备
称取5.4mg实施例1制备得到的MnO2纳米层,溶解于2.5mL的PBS溶液中,再加入8.8mg叶酸,在20℃条件下超声30min后,探头超声(超声功率200W,工作3s,间歇5s,60次)后,12000rpm离心5min以去除小颗粒,重新用PBS分散,再超声20min溶解后,3000rpm再离心5min以去除较大颗粒,上清液即为MnO2/FA纳米层溶液。
(2)MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
称取2.0mg补骨脂素粉末,加入上述步骤(1)制备得到的20mL MnO2/FA纳米层溶液中,室温条件下最后超声10min,4℃条件下12000rpm最后离心30min,弃上清,收集沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
实施例4 MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
(1)MnO2/FA纳米粒的制备
称取4.8mg实施例1制备得到的MnO2纳米层,溶解于2.5mL的PBS溶液中,再加入6.6mg叶酸,在25℃条件下超声10min后,探头超声(超声功率150W,工作3s,间歇5s,60次)后,12000rpm离心5min以去除小颗粒,重新用PBS分散,再超声15min溶解后,3000rpm再离心5min以去除较大颗粒,上清液即为MnO2/FA纳米层溶液。
(2)MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
称取1.5mg补骨脂素粉末,加入上述步骤(1)制备得到的20mL MnO2/FA纳米层溶液中,室温条件下最后超声5min,4℃条件下12000rpm最后离心30min,弃上清,收集沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
实施例5 MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
(1)MnO2/FA纳米粒的制备
称取5.4mg实施例1制备得到的MnO2纳米层,溶解于2.5mL的PBS溶液中,再加入8.8mg叶酸,在22℃条件下超声25min后,探头超声(超声功率160W,工作3s,间歇5s,60次)后,12000rpm离心5min以去除小颗粒,重新用PBS分散,再超声17min溶解后,3000rpm再离心5min以去除较大颗粒,上清液即为MnO2/FA纳米层溶液。
(2)MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
称取2.5mg补骨脂素粉末,加入上述步骤(1)制备得到的20mL MnO2/FA纳米层溶液中,室温条件下最后超声15min,4℃条件下12000rpm最后离心30min,弃上清,收集沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
实施例6 MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
(1)MnO2/FA纳米粒的制备
称取5.0mg实施例1制备得到的MnO2纳米层,溶解于2.5mL的PBS溶液中,再加入7.7mg叶酸,在24℃条件下超声15min后,探头超声(超声功率170W,工作3s,间歇5s,60次)后,12000rpm离心5min以去除小颗粒,重新用PBS分散,再超声18min溶解后,3000rpm再离心5min以去除较大颗粒,上清液即为MnO2/FA纳米层溶液。
(2)MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备
称取1.8mg补骨脂素粉末,加入上述步骤(1)制备得到的20mL MnO2/FA纳米层溶液中,室温条件下最后超声12min,4℃条件下12000rpm最后离心30min,弃上清,收集沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
以下以实施例3制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂为例,对本发明制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂进行理化性质考察、对乳腺癌MCF-7细胞的体外抗肿瘤研究、以及对MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的药效研究,具体的实验方法和实验结果分别如下:
应用例1 MnO2/FA/PSO纳米制剂的理化性质测定
通过MnO2/FA/PSO纳米制剂的外观形态与微观形态观察,Zeta电位及粒径测定来评价MnO2/FA/PSO纳米制剂的理化性质,具体实验方法和实验结果如下:
1、MnO2/FA/PSO纳米制剂的形态学考察
(1)实验方法
取实施例2制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂,稀释后得各样品分散液,滴于镀膜后的电镜制样铜网上,2%磷钨酸负染制片,自然晾干,置透射电子显微镜下观察MnO2/FA/PSO纳米制剂的形态并拍照。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂的形态如图5所示,可以看出,该MnO2/FA/PSO纳米制剂以层状结构聚集,均匀。
2、MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径及表面电位测定
(1)实验方法
粒径和电位大小是衡量纳米制剂质量的重要指标,由粒径分布判定制得的纳米颗粒的大小和分布范围;粒径小于200nm有利于纳米制剂通过EPR效应富集于肿瘤部位,更好地发挥抗肿瘤效果。
取200μL实施例2制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂,加超纯水稀释至2mL并混匀,将样品加入粒径杯或电位杯中,设定粒径仪的参数,在室温条件下,使用Nano-ZS90纳米激光粒度分析仪对MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径或表面电位进行测定并分析。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径和表面电位测定结果分别如图6和图7所示,可以看出,该MnO2/FA/PSO纳米制剂的粒径大小为149.53±0.28nm,粒径均匀,Zeta电位为-26.21±0.17mV,且分散指数良好。
3、MnO2/FA/PSO纳米制剂的稳定性考察
(1)实验方法
分别取等体积的MnO2、实施例2制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂以纯净水和生理盐水(Saline)为溶剂的溶液于西林瓶中,静置72h后,拍照进行前后对比分析。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂的稳定性考察结果如图8所示,可以看出,MnO2在纯净水和生理盐水中均不稳定,放置72h后均发生明显聚沉;而MnO2/FA/PSO纳米制剂放置72h后仍然呈均一透明的胶体溶液,具有黄色乳光,无聚沉现象,具有较好的稳定性;说明经过FA修饰后的MnO2/FA/PSO纳米制剂的稳定性显著提高。
4、MnO2/FA/PSO纳米制剂的红外光谱扫描
(1)实验方法
PSO具有羰基特征吸收峰,可以通过分析羰基吸收峰来分析PSO在MnO2/FA/PSO纳米制剂中的存在状态。
取PSO、实施例2制备得到的MnO2/FA纳米粒、PSO与MnO2/FA纳米粒的物理混合物(PSO+MnO2/FA)、MnO2/FA/PSO纳米制剂,分别与溴化钾混合,应用红外光谱在4000~400nm范围内扫描,通过扫描图谱判断PSO在MnO2/FA/PSO纳米制剂中的存在状态。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂的红外光谱扫描结果如图9所示,可以看出,PSO和PSO与MnO2/FA纳米粒的物理混合物的红外光谱中均有羰基的吸收峰,而MnO2/FA纳米粒和MnO2/FA/PSO纳米制剂的红外光谱中未发现明显的羰基吸收峰;说明PSO在MnO2/FA/PSO纳米制剂中被包裹或晶型发生改变。
5、MnO2/FA/PSO纳米制剂的体外释放测定
(1)实验方法
分别取相同浓度的实施例2制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂和PSO标准溶液1mL,将其置于分子量为8000~14000的透析袋中,释放介质为含0.5%SDS的PBS,设置溶出仪的转速为100r/min,温度为37℃,进行体外释放实验,分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h取样(取样体积=加样体积)过膜测定,计算MnO2/FA/PSO纳米制剂和PSO标准溶液在释放介质中的累积释放率。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂的体外释放测定结果如图10所示,可以看出,PSO标准溶液在前12h内已经释放完全(累积释放率为100%),而MnO2/FA/PSO纳米制剂在36h内累积释放率约90%,直至48h才释放完全;说明MnO2/FA/PSO纳米制剂具有显著的缓释效果。
应用例2 MnO2/FA/PSO纳米制剂的体外抗肿瘤研究
本应用例2中的所有数据重复三次,计算其平均值及SD值结果进行t检验,P<0.05说明数据较显著,实验数据采用GraphPad Prism6.01软件进行分析,图片采用OriginPro8软件进行绘制。
1、试剂配制
培养基的配制:取10mL胎牛血清,1mL双抗(青霉素/链霉素溶液),89mLRPMI-1640不完全培养基,混合。
MTT溶液的配制:250.0mg MTT粉末,用PBS配制浓度为5mg/mL的溶液,无菌条件下操作,过0.22μm无菌滤膜,于-20℃保存。
PBS溶液的配制:取10g分装的PBS粉末,将其溶解于1L的容量瓶中,超纯水定容,高压灭菌锅灭菌,无菌条件下分装,于4℃保存。
PSO溶液的配制:以DMSO为溶剂,制备浓度为2mg/mL的PSO溶液,得到的PSO溶液用RPMI-1640不完全培养基稀释不同浓度梯度,过0.22μm无菌滤膜,现配现用。
MnO2/FA/PSO分散液及MnO2/FA溶液的配制:分别取实施例2制备得到的MnO2/FA/PSO纳米制剂和MnO2/FA纳米粒,用RPMI-1640不完全培养基稀释不同浓度梯度,根据HPLC法测定包封率,计算PSO浓度,过0.22μm无菌滤膜,于4℃保存。
2、MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制
(1)实验方法
1)乳腺癌MCF-7细胞复苏、培养、传代
乳腺癌MCF-7细胞从液氮中取出,迅速放入37℃的恒温水浴中使其快速溶化,于1000rpm离心5min,弃上清液,用PBS轻轻吹打清洗,于1000rpm离心5min,弃上清液,加RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清,1%双抗)使其重悬,放于CO2培养箱中(5%CO2,37℃)培养。每隔2天更换培养液,倒置显微镜下观察,当MCF-7细胞生长覆盖培养瓶大于80%时,将培养瓶中含细胞代谢物的培养基吸走,PBS清洗3次,胰酶消化离心,弃上清液,加入培养液重悬,吸取一定体积的细胞悬液分装到新的培养瓶中,于CO2培养箱中培养。
2)MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定
取对数期生长的MCF-7细胞,用完全培养基制成细胞悬液,将细胞悬液稀释适当倍数,计数,MCF-7细胞以0.5×104个/孔,每孔取100μL细胞悬液,接种于96孔板;置于培养箱中培养24h后,每孔分别加入100μL含不同浓度(7.27、14.53、29.06、58.13、116.25、232.5、465.0、930.0μg/mL)PSO溶液的培养基、含不同浓度(0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.0、10.0、20.0)MnO2/FA溶液的培养基、以及含不同浓度(0.156、0.312、0.625、1.25、2.50、5.0、10.0、20.0)MnO2/FA/PSO分散液的培养基,同时设立对照孔(只有细胞、不加含样品的培养基)与空白组(只加含样品的培养基、没有细胞),每个浓度设置6个复孔,48h后,每孔加入20μL MTT溶液,培养4h,1000rpm离心5min,弃去上清液,加入150μL DMSO溶液,振摇5min,用酶标仪在波长570nm处读取吸光(OD)值,用以下公式计算MCF-7细胞在不同浓度PSO溶液、MnO2/FA溶液和MnO2/FA/PSO分散液中的增殖抑制率:
增殖抑制率(%)=1-(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。
(2)实验结果
不同浓度PSO溶液对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果如表1所示,可以看出,当PSO溶液的浓度为7.27~29.06μg/mL时,MCF-7细胞增殖抑制率仅为1.35%~2.22%,对MCF-7细胞均无明显的增殖抑制作用。
不同浓度MnO2/FA纳米粒对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果如表2所示,可以看出,当MnO2/FA溶液的浓度为0.156~2.50μg/mL时,MCF-7细胞增殖抑制率仅为1.891%~8.038%,对MCF-7细胞均无明显的增殖抑制作用。
不同浓度MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果如表3所示,可以看出,当MnO2/FA/PSO分散液的浓度为0.156~0.625μg/mL时,MCF-7细胞增殖抑制率为2.764%~8.469%。
根据表3、表4和表5的实验结果,可以看出,当PSO溶液的浓度为116.25μg/mL时对MCF-7细胞的增殖抑制率为24.30%,当MnO2/FA溶液的浓度为10.0μg/mL时对MCF-7细胞的增殖抑制率为22.090%,而当MnO2/FA/PSO分散液的浓度仅为5.0μg/mL时对MCF-7细胞的增殖抑制率高达45.207%;说明在MnO2/FA/PSO纳米制剂的浓度极低的情况下,即可达到抑制MCF-7细胞增殖、对MCF-7细胞产生毒性的作用,有效地在降低MnO2/FA/PSO纳米制剂用量的情况下达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。
表3 PSO对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果
表4不同浓度MnO2/FA纳米粒对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果
表5不同浓度MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制测定结果
3、MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响
(1)实验方法
将乳腺癌MCF-7细胞接种于6孔板(3.0×105个/孔)中,培养24h后,弃去旧培养基,将培养基换为分别含PBS溶液(空白对照组)、MnO2/FA溶液(载体组)、PSO溶液(原料药组)、MnO2/FA/PSO分散液(制剂组)的完全培养基和不含样品的完全培养基;其中,以PSO的浓度12μg/mL为标准。在培养箱中培养24h后,弃去旧培养基,用2mL PBS洗两遍后,向每个孔中加入0.5mL的胰酶(不含EDTA)进行消化,在1000rpm的条件下离心5min并弃去上清液,向离心管中缓慢地加入75%的酒精来固定细胞。在4℃条件下放置24h后,1200rpm离心10min,用PBS对细胞洗涤三次后,在避光条件下向每个样品中分别加入0.5mL碘化丙啶染色液,并使细胞分散均匀,温浴(37℃)30min后进行冰浴,作24h后,用PI单染法借助于流式细胞仪(FACS)检测各组细胞周期时相分布变化,并用Cell Quest软件分析处理数据。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞周期的影响结果如图11所示,可以看出,加入MnO2/FA溶液的载体组细胞周期时相分布与加入PBS溶液的空白对照组无明显差别,说明MnO2/FA纳米粒载体对细胞周期时相分布无影响;而加入PSO溶液的原料药组作用后,MCF-7细胞G2/M期的比例增加,说明PSO使得G2/M期阻滞;加入MnO2/FA/PSO分散液的制剂组同样表现为MCF-7细胞G2/M期阻滞,且MCF-7细胞G2/M期的比例增加显著;说明PSO能够改变MCF-7细胞周期时相的分布,阻滞细胞于G2/M期,且MnO2/FA纳米粒载体能够增强其阻滞MCF-7细胞的作用,PSO和MnO2/FA纳米粒在改变MCF-7细胞周期时相分布方面具有协同作用。
4、MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响
(1)实验方法
1)将取对数生长期MCF-7细胞,用无酚红胎牛血清培养基制备MCF-7细胞悬液,以2×105个/孔接种于6孔板中,于5%CO2,37℃培养箱中培养过夜,去除培养基,加入PBS溶液(空白对照组)、MnO2/FA溶液(载体组)、PSO溶液(原料药组)、MnO2/FA/PSO溶液(制剂组)(以PSO计20μmol/L)的新鲜培养液孵48h;
2)培养完毕后,用胰蛋白酶消化细胞,预冷的PBS洗净,以1000rpm离心5min,收集MCF-7细胞;
3)预冷的PBS重悬细胞后,加入冷冻乙醇调节乙醇终浓度为75%,细胞样品置于-20℃中固定过夜;
4)取出样品,冷冻PBS洗净后,加入PI/RNAse染液,室温下染色15min;
5)用流式细胞仪(Ex=488nm,Em=575nm)检测488nm处红色荧光,记录OD值,实验重复三次,取平均值;
6)采用FlowJo 10.0.7软件对数据进行分析,研究MCF-7细胞的凋亡情况。
(2)实验结果
MnO2/FA/PSO纳米制剂对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响结果如图12所示,可以看出,加入PBS溶液的空白对照组无细胞凋亡情况,加入MnO2/FA溶液的载体组的细胞凋亡率低于10%,说明MnO2/FA纳米粒载体对细胞凋亡影响比较小;而加入PSO溶液的原料药组和加入MnO2/FA/PSO分散液的制剂组表现除明显的细胞凋亡,说明PSO和MnO2/FA纳米粒载体均能够促进细胞凋亡,且MnO2/FA纳米粒载体的促凋亡作用显著高于PSO,PSO和MnO2/FA纳米粒载体在促进细胞凋亡方面具有协同作用。
应用例3 MnO2/FA/PSO纳米制剂对MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的药效研究
本应用例3中的所有数据重复三次,计算其平均值及SD值结果进行t检验,P<0.05说明数据较显著,实验数据采用GraphPad Prism6.01软件进行分析,图片采用OriginPro8软件进行绘制。
1、实验方法
(1)MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠模型的建立
将购置于广东省医学实验动物中心的雌性Balb/c裸鼠于无菌级(SPF)动物房中分笼饲养,相对湿度60±15%,环境温度23±2℃,自然光照,国家标准固体混合饲料喂养,自由饮水,待其饲养一周后,将培养的密度为1×107MCF-7细胞与基质胶等比混合,皮下注入雌性Balb/c裸鼠(4-5周龄,体重18-22g)腋下右侧方,2w左右,待肿瘤长至约100mm3时,视为建模成功。
(2)实验分组及给药方式
将建模成功的MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠,随机平均分为生理盐水组、PSO组、MnO2/FA组、MnO2/FA/PS组共4组,分别尾静脉注射生理盐水、PSO溶液、实施例2配制的MnO2/FA溶液、实施例2配制的MnO2/FA/PSO分散液,每3d给药一次,共给药7次。
(3)MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠体重变化测定
每只MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠均先称量体重,根据体重给药,给药剂量为6mg/kg(按PSO量计)。每次给药前,用天平对每只MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠进行称重并记录,记录MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠给药前后体重变化。
(4)MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定
建模后,每次给药前测量MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠肿瘤的长径和短径,并根据公式(1)计算裸鼠肿瘤体积大小,根据MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积变化绘制肿瘤生长曲线,根据公式(2)计算抑瘤率:
裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率计算公式如下:
肿瘤体积=1/2ab2;公式中:a为肿瘤长径,b为肿瘤短径。
抑瘤率(%)=(V盐水-V治疗)/V盐水×100%;公式中:V盐水为注射生理盐水的MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积,V治疗分别为PSO溶液、MnO2/FA溶液、MnO2/FA/PSO分散液的MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积。
实验终点取出各组MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤并称重。
2、实验结果
本发明建立得到的MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠模型如图13所示。
(1)裸鼠体重变化测定结果
MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的体重变化结果如图14所示,可以看出,生理盐水组、PSO组、MnO2/FA组MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的体重随着时间的增长均有一定程度的增加,而MnO2/FA/PSO组MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的体重由下降的趋势;说明MnO2/FA/PSO纳米制剂对MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠具有显著的毒性作用,使得裸鼠的体重逐渐消瘦。
(2)裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定结果
MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤形态如图15所示,MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积变化结果如图16所示,可以看出,生理盐水组MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积出现显著增长的趋势且肿瘤体积较大,与空白对照组相比,PSO组、MnO2/FA组和MnO2/FA/PS组均能够抑制MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠肿瘤的增长,其中,MnO2/FA/PSO组MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤体积增长率最低且肿瘤体积最小;说明与PSO相比,MnO2/FA/PSO纳米制剂能够显著抑制MCF-7细胞系乳腺癌裸鼠的肿瘤生长。
乳腺癌细胞MCF-7裸鼠抑瘤率测定结果如图17所示,可以看出,与生理盐水组对比,PSO组的抑瘤率为78.2%,MnO2/FA组的抑瘤率为42.1%,MnO2/FA/PS组的抑瘤率为89.9%;说明MnO2/FA/PS纳米制剂对乳腺癌细胞MCF-7具有显著的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种MnO2/FA/PSO纳米制剂,其特征在于,用MnO2纳米层包裹补骨脂素,并用叶酸进行表面修饰;其中,所述MnO2纳米层、补骨脂素和叶酸的质量比为4.8~5.4:1.5~2.5:6.6~8.8。
2.根据权利要求1所述的纳米制剂,其特征在于,所述MnO2纳米层、补骨脂素和叶酸的质量比为5.4:2.0:8.8。
3.权利要求1或2所述MnO2/FA/PSO纳米制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.将羟化四甲基铵和过氧化氢溶液加入MnCl2溶液中,利用氧化还原法制备得到MnO2纳米层;
S2.按照权利要求1或2所述质量比在步骤S1制备得到的MnO2纳米层中加入叶酸,超声,探头超声,离心去除沉淀后用PBS溶液分散,再超声,再离心,得到的上清液即为MnO2/FA纳米层溶液;
S3.将补骨脂素加入步骤S2制备得到的MnO2/FA纳米层溶液中,最后超声,最后离心,得到的沉淀即为MnO2/FA/PSO纳米制剂。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S1所述过氧化氢溶液的质量分数为1%~3%。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2所述超声的温度为20℃~25℃;步骤S2所述超声的时间为10~30min。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2所述探头超声的条件为:超声功率150~200W,工作3s,间歇5s,工作60次。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S2所述再超声的时间为15~20min。
8.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤S3所述最后超声的时间为5~15min。
9.权利要求1或2所述纳米制剂、或权利要求3~8任一所述方法制备得到的纳米制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
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赵万忠等: ""补骨脂素对乳腺癌耐药细胞株周期和细胞凋亡的影响",赵万忠等,《中华临床医师杂志》,第10卷第14期,第2111-2115页", 《中华临床医师杂志》 * |
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