CN110960509A - 一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒，用脂质材料包裹已装载黄芩苷的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物，并用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000进行表面修饰；其中，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000的质量比为4～5：0.2～0.3：0.8～1.5：1。该纳米粒的粒径较小且均匀，稳定性高，分散性好，包封率高，显著提高了黄芩苷的水溶性及生物利用度，具有显著的抗肿瘤效果，在制备乳腺癌治疗药物中具有良好的应用前景。

Description

一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
近年来有数据表明，在我国乳腺癌已成为女性最常见肿瘤其中之一，约占女性发病恶性肿瘤的四分之一。世界范围内其每年新发病例约170万，死亡约41万。我国每年女性乳腺癌发病人数约16.9万，因乳腺癌死亡约4.5万，且发病率和死亡率还在不断攀升。目前，乳腺癌的治疗手段以手术和化疗为主，然而肿瘤对传统的细胞毒性化疗药物产生耐药从而导致化疗失败是目前乳腺癌药物治疗较为突出的问题。因此，寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物成为近些年各国学者的研究热点。
黄芩苷(Baicalin，BCN)是从唇形科植物黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，是黄芩素葡萄糖醛酸的结合体，中药材黄芩的主要活性成分，化学名为5，6-二羟基-7-O-葡萄糖醛酸黄酮苷，CAS号：21967-41-9，分子式：C21H18O11，分子量：446.36100，常温下为淡黄色粉末，无臭，味苦，难溶于甲醇、乙醇、丙酮、微溶于氯仿和硝基苯、几乎不溶于水，可溶于热乙酸和碱性溶液。黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降胆固醇、抗血栓形成、缓解哮喘、泻火解毒、止血、安胎、抗变态反应及解痉作用，也具有较强的抗癌反应生理效能。但是，由于黄芩苷分子结构中的黄酮和葡萄苷酸之间形成分子内氢键，导致其水溶性和脂溶性均较差，并含有多酚羟基结构容易氧化变质，口服生物利用度仅为2.2％，应用受到限制。因此，研发一种新的药物传递系统来改善黄芩苷的生物利用度具有重要意义。
目前，现有技术已有制备黄芩苷固体脂质纳米粒、黄芩苷纳米乳、黄芩苷固体自微乳化释药系统和黄芩苷纳米胶束的报道。但是，黄芩苷固体脂质纳米粒的包封率低、易泄露、载药量低、稳定性差，适用于剂量小、脂溶性好的原料，水溶性原料需先制成前体药物或者采用复乳法制备；黄芩苷纳米乳存在粒径较大、不稳定、靶向性差等缺点，适用于水溶性或者脂溶性较好的原料，配方中会用到大量表面活性剂；黄芩苷固体自微乳化释药系统和黄芩苷纳米乳类似，只是不含水相，通过口服胃肠道蠕动自发形成乳剂，处方中也有大量表面活性剂；黄芩苷纳米胶束容易受稀释和环境因素影响，出现胶束结构破坏而提前释药、靶向性和生物利用度降低等问题。
因此，在提高黄芩苷生物利用度的基础上，制备出包封率高、稳定性好、抗肿瘤效果显著的乳腺癌治疗药物具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒及其制备方法和应用。
本发明的目的是提供一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒。
本发明另一目的是提供所述纳米粒的制备方法。
本发明再一目的是提供所述纳米粒在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒(B-PLN)，用脂质材料包裹已装载黄芩苷的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，并用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)进行表面修饰；其中，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为4～5：0.2～0.3：0.8～1.5：1。
所述黄芩苷聚合物脂质纳米粒由聚合物核和包裹于聚合物核外的脂质层组成，其中，聚合物核主要用于包载黄芩苷并作为载体结构的刚性支撑，赋予脂质层机械稳定性；脂质层的疏水链形成疏水核心，通过疏水作用力将黄芩苷和聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载于其中；脂质层的亲水基形成脂质单分子层，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000嵌入脂质单分子层中，在脂质壳外形成聚乙二醇化隐形层；脂质层的主要作用是：a、生物相容性的脂质屏蔽以避免被网状内皮系统快速清除；b、防止药物的快速渗漏，达到长循环和控制释药的作用；c、由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000嵌入脂质单层中形成的聚乙二醇化隐形层，起到保持空间稳定性和体内长循环双重作用。
该黄芩苷聚合物脂质纳米粒体系通过特定配料的完美配合，显著提高了黄芩苷的水溶性和生物利用度；而且该纳米粒的粒径较小，分散性好，包封率高达60％以上，无耐药性、无毒副作用、抗肿瘤效果显著，能够快速到达肿瘤部位进行作用，并在肿瘤部位持续作用很长时间，更好的发挥抑制乳腺癌细胞生长的作用。
优选地，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为4.5～5：0.25～0.3：1～1.5：1。
更优选地，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为5：0.3：1.5：1。
本发明还提供了所述黄芩苷聚合物脂质纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.按照所述质量比取黄芩苷，溶解于碱性溶液中，形成内水相，并配制乳化剂的水溶液，形成外水相；
S2.取聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脂质材料和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，溶解于有机溶剂中，形成油相；
S3.将步骤S1的内水相涡旋注入步骤S2的油相中，超声，形成W/O初乳；
S4.将步骤S3的W/O初乳与步骤S1的外水相混合搅拌均匀，形成W/O/W复乳，减压蒸发，即得所述黄芩苷聚合物脂质纳米粒。
优选地，步骤S2所述油相与步骤S1所述内水相和外水相总体积的体积比为1：9～11。
更优选地，步骤S2所述油相与步骤S1所述内水相和外水相总体积的体积比为1：10。
优选地，步骤S1所述内水相和外水相的体积比为0.5～1.5：40～50。
更优选地，步骤S1所述内水相和外水相的体积比为1：45。
优选地，步骤S2所述脂质材料为大豆磷脂或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
更优选地，步骤S2所述脂质材料为大豆磷脂。
优选地，步骤S1所述乳化剂为P188或F68。
更优选地，步骤S1所述乳化剂为P188。
优选地，步骤S3所述涡旋注入时的温度为68℃～72℃。
更优选地，步骤S3所述涡旋注入时的温度为70℃。
优选地，步骤S4所述搅拌的时间为1.8～2.2h。
更优选地，步骤S4所述搅拌的时间为2h。
优选地，步骤S1所述碱性溶液为碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液或氨水中的任意一种或几种。
更优选地，步骤S1所述碱性溶液为碳酸氢钠溶液。
优选地，步骤S2所述有机溶剂为丙酮、二甲基亚砜或乙酸乙酯中的任意一种或几种。
更优选地，步骤S2所述有机溶剂为丙酮。
另外，所述纳米粒在制备乳腺癌治疗药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的黄芩苷聚合物脂质纳米粒是由亲水性脂质材料包裹已装载黄芩苷的聚合物PLGA，并用DSPE-PEG2000修饰，运用W/O/W复乳溶剂挥发法制备而得到；其中，采用碱性溶液溶解黄芩苷，能够显著提高黄芩苷的水溶性及生物利用度，增大B-PLN的包封率；
该纳米粒的粒径较小且均匀，稳定性高，分散性好，具有一定的缓释效果，不仅能够提高载药稳定性，还可以使B-PLN经静脉注射后不会马上被MPS丰富的组织捕获，从而在血液中循环时间延长，进而增加进入病理组织中的机会；
该纳米粒对乳腺癌MCF-7细胞具有显著的细胞毒性和促进MCF-7细胞凋亡的作用，能够抑制MCF-7模型裸鼠的生长和肿瘤体积的增大，增大抑瘤率，进而显著提高B-PLN的抗肿瘤效果；另外，该纳米粒的制备方法简单、成本低，在制备乳腺癌治疗药物中具有广泛的推广应用前景。
附图说明
图1是脂质材料用量、PLGA用量、黄芩苷用量响应值的响应面图。
图2是B-PLN分散液的外观形态图。
图3是B-PLN分散液的透射电镜形态图。
图4是B-PLN的粒径测定结果图。
图5是B-PLN的Zeta电位测定结果图。
图6是B-PLN体外释放曲线图。
图7是空白-PLN对MCF-7细胞活力的影响结果图。
图8是BCN、B-PLN对MCF-7细胞活力的影响结果图。
图9是在12h内黄芩苷聚合物脂质纳米粒对MCF-7细胞凋亡的影响结果图。
图10是在24h内黄芩苷聚合物脂质纳米粒对MCF-7细胞凋亡的影响结果图。
图11是本发明建立得到的乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型。
图12是裸鼠体重变化测定结果图。
图13是乳腺癌细胞MCF-7裸鼠肿瘤形态图。
图14是裸鼠肿瘤体积变化结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1黄芩苷聚合物脂质纳米粒制备工艺条件的优化
1、制备温度的优化
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，脂质材料需溶解于水相中，因此制备温度需达到脂质材料的熔点以上，一般的脂质材料的熔点为60℃～65℃；固定其他制备因素条件不变的情况下，改变制备温度，选择制备温度分别为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃进行实验，考察制备温度对B-PLN粒径及包封率的影响，确定B-PLN的最佳制备温度。
(2)实验结果
制备温度对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表1所示，可以看出，随着制备温度的升高，B-PLN的粒径出现降低的趋势，包封率出现先增加后减小的趋势；当制备温度小于等于65℃或大于等于75℃时，B-PLN粒径会出现峰；其中，当制备温度为70℃时，B-PLN具有较小的粒径、粒径均匀，包封率为74.2％；因此，选择最佳制备温度为70℃。
表1制备温度对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000051
2、搅拌时间的优化
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，有机相加入水相后，搅拌时间对B-PLN制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择搅拌时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h进行实验，考察搅拌时间对B-PLN的粒径及包封率影响，确定制备B-PLN的最佳搅拌时间。
(2)搅拌时间
搅拌时间对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表2所示，可以看出，随着搅拌时间的增加，制备的B-PLN粒径先增加后减小的趋势，包封率出现增大的趋势；其中，当搅拌时间为2h时，B-PLN粒径较小，均匀，且包封率较高；因此，选择最佳搅拌时间为2h。
表2搅拌时间对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000061
3、脂质材料的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，发现脂质材料对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择单硬脂酸甘油酯：胆固醇(2：1)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、大豆磷脂共4种脂质材料进行实验，考察脂质材料对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳脂质材料。
(2)实验结果
脂质材料对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表3所示，可以看出，采用单硬脂酸甘油酯：胆固醇(2：1)作为脂质材料所制备的B-PLN非常不稳定，所得B-PLN粒径较大，包封率较低，且制备的B-PLN分散液较浑浊；采用DLPC制备的B-PLN不稳定，包封率较低，且三天后出现白色沉淀；而采用DMPC和大豆磷脂制备的B-PLN粒径较大且均匀，包封率较高；其中，大豆磷脂制备的B-PLN粒度较小，分散较好，包封率较高；因此，选择最佳脂质材料为大豆磷脂。
表3脂质材料对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000071
4、乳化剂的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，发现乳化剂对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择F68、泊洛沙姆188(P188)、吐温-80(T-80)、司班-80、天然水溶性VE(TPGS)共5种乳化剂进行实验，考察乳化剂对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳乳化剂。
(2)实验结果
乳化剂对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表4所示，可以看出，采用司班-80作为乳化剂时，出现分层现象，司班-80在B-PLN分散液上层且有沉淀且粒径不稳定；采用TPGS作为乳化剂时，所制备的B-PLN包封率最低且粒径不稳定；采用T-80作为乳化剂时，出现白色沉淀，制备的B-PLN不稳定且包封率较低；而采用F68和P188作为乳化剂时，所制备的B-PLN的粒径均匀；其中，采用P188作为乳化剂时，所制备的B-PLN粒径较小，分散均匀，且包封率较高；因此，选择最佳乳化剂为P188。
表4乳化剂对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000081
5、油相与水相(内水相和外水相)体积比的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，油相与水相体积比对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择油相与水相体积比分别为1：4、1：6、1：8、1：10、1：12进行实验，考察油相与水相体积比对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳油相与水相体积比。
(2)实验结果
油相与水相体积比对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表5所示，可以看出，随着油相与水相体积比的增加，制备的B-PLN粒径出现先增加后减小再增加再减小的趋势，包封率出现先增加后减小的趋势；其中，当油相与水相体积比为1:10时，测得B-PLN的包封率最高，粒径较小且均匀；因此，选择最佳油相与水相体积比为1:10。
表5油相与水相体积比对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000082
6、脂质材料用量的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，脂质材料用量对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择脂质材料用量分别为20mg、30mg、40mg、50mg、60mg进行实验，考察脂质材料用量对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳脂质材料用量。
(2)实验结果
脂质材料用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表6所示，可以看出，随着脂质材料用量的增加，制备的B-PLN的包封率出现先增加后降低的趋势，粒径出现先减小后增大的趋势；当脂质材料用量为40～50mg时，制备的B-PLN包封率达到最高，因此选择制备B-PLN的脂质材料总量为40～50mg。
表6脂质材料用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000091
7、DSPE-PEG2000与脂质材料质量比的确定
(1)实验方法
固定其他制备因素条件不变的情况下，分别选择DSPE-PEG2000与脂质材料质量比为10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％时制备B-PLN，考察不同DSPE-PEG2000与脂质材料质量比条件对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳DSPE-PEG2000与脂质材料质量比。
(2)实验结果
DSPE-PEG2000与脂质材料质量比对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表7所示，可以看出，随着DSPE-PEG2000与脂质材料质量比的增加，制备的B-PLN粒径和包封率均出现先减小后增大的趋势；当DSPE-PEG2000与脂质材料质量比为15％～25％时，包封率呈现上升趋势；但当二者质量比增加到30％～50％时，包封率呈现下降趋势；其中，二者质量比为20％～25％时的包封率高，粒径均匀；因此，选择DSPE-PEG2000与脂质材料质量比为20％～25％(1:4～5)。
表7DSPE-PEG2000与脂质材料质量比对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000101
8、PLGA用量的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，PLGA用量对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择PLGA用量分别为6、8、10、12、14mg进行实验，考察PLGA用量对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳PLGA用量。
(2)实验结果
PLGA用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表8所示，可以看出，随着PLGA用量的增加，制备的B-PLN粒径出现增大的趋势，包封率出现先增加后减小的趋势；当PLGA用量为8～14mg时，制备的B-PLN的粒径均匀，且包封率较高；其中，当PLGA用量为10mg时制备的B-PLN包封率较高，且粒径较小；因此，选择PLGA最佳用量为10mg。
表8PLGA用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000102
9、黄芩苷用量的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，黄芩苷用量对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择黄芩苷用量分别为1、1.5、2、2.5、3mg进行实验，考察黄芩苷用量对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳黄芩苷用量。
(2)实验结果
黄芩苷用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表9所示，可以看出，随着黄芩苷的增加，B-PLN的粒径随着黄芩苷用量的增加而增加，包封率出现先升高后降低的趋势，黄芩用量对包封率的大小影响显著；可能的原因是聚合物材料与脂质材料所能够包载的药量是有限的，当其包载的黄芩苷达到最大值之后，多增加的黄芩苷就会泄漏出来，导致包封率下降。其中，当黄芩苷用量为2mg时，制备的B-PLN的粒径均匀，且包封率高；因此，选择最佳黄芩苷用量为2mg。
表9黄芩苷用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000111
10、乳化剂用量的确定
(1)实验方法
在制备B-PLN的过程中，乳化剂用量对B-PLN的制备具有一定的影响，因此固定其他制备因素条件不变的情况下，选择乳化剂用量分别为0.25％、0.30％、0.35％、0.40％、0.50％(w/w)进行实验，考察乳化剂用量对B-PLN粒径及包封率的影响，确定制备B-PLN的最佳乳化剂用量。
(2)实验结果
乳化剂用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果如表10所示，可以看出，当乳化剂用量为0.25％时，由于乳化剂用量浓度较低，制备的B-PLN不稳定，出现絮凝；随着乳化剂用量浓度的增大，包封率不断升高，当乳化剂用量为0.4％～0.5％时，制备的B-PLN粒径不稳定，有小峰；而当乳化剂用量为0.3％～0.35％时，制备的B-PLN粒径大小均匀，稳定性好且包封率较高；其中，当乳化剂用量为0.35％，包封率高；因此，选择制备B-PLN的最佳P188用量为0.35％。
表10乳化剂用量对B-PLN粒径及包封率的影响结果
Figure BDA0002345238200000121
实施例2Box-Behnken响应面实验
1、Box-Behnken响应面实验优化
(1)实验方法
根据实施例1的实验结果可以看出，脂质材料用量、PLGA用量、黄芩苷用量对制备B-PLN的粒径及包封率具有显著的影响；因此，通过Box-Behnken响应面软件设计，进行Box-Behnken响应面实验优化。
以脂质材料用量、PLGA用量、黄芩苷用量为自变量，粒径(Y1)及包封率(Y2)为因变量，采用二次多元及多元线性回归建立二次多元回归模型，以置信度(P)及拟合优度(r)结果评估模型拟合效果。
为了更直观的观察各因素(脂质材料用量、PLGA用量、黄芩苷用量)之间的相互影响及各因素对粒径、包封率的影响，根据二次多元回归模型结果，继续用Design-Expert8.0.6软件进行响应面分析，绘制包粒径、包封率和各因素之间的3D效应面图。
依据3D效应面图结果确定最优制备工艺，然后制备B-PLN，测定其包封率与粒径，平行操作3次，与模型预测值进行比较。
(2)实验结果
Box-Behnken响应面实验设计及响应值结果如表11所示。
表11 Box-Behnken响应面实验设计及响应值结果
Figure BDA0002345238200000131
二次多元回归模型如下：
Y1＝98.31+7.33A+0.12B-0.44C+1.42AB-3.07AC+6.68BC-11.41A2+13.99B2-0.178C2(R2＝0.9737)，其各项系数中A、BC、A2、B2(p＜0.01)极其显著；
Y2＝81.12+2.09A-2.23B+4.3C-10.85AB-1.683AC+3.84BC-7.19A2-6.65B2-12.74C2(R2＝0.9100)，其各项系数中C、AB、A2、B2、C2(p＜0.01)极其显著；可以看出，B-PLN的粒径(Y1)的R2值为0.9737，包封率(Y2)的R2值为0.9100，均接近于1，说明模型拟合效果良好。
脂质材料用量、PLGA用量、黄芩苷用量响应值的响应面图如图1所示，可以看出，最优制备工艺为，脂质材料用量：50mg；PLGA用量：15mg；黄芩苷用量3mg；包封率：78.92％。平行制备3批样品，测定B-PLN粒径：93.59nm；包封率：82.15％。
模型预测值与实测值的比较结果如表12所示，可以看出，实测值与模型预测值偏差小于5％，说明模型拟合较好。
表12模型预测值与实测值的比较结果
Figure BDA0002345238200000141
实施例3黄芩苷聚合物脂质纳米粒的制备
称取3mg黄芩苷，溶解于1mL 0.1mol/L碳酸氢钠溶液中，形成内水相；配制0.35％188乳化剂水溶液45mL形成外水相；称取15mg PLGA、50mg大豆磷脂和10mgDSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000与大豆磷脂质量比为1:5)，超声溶解于丙酮中，形成油相；70℃温度下将内水相边涡旋边注入油相中，涡旋0.5min，然后冰水浴探针式超声(功率40％)3min，形成W/O初乳；
再将W/O初乳在高速搅拌下注入外水相中，8000r/min搅拌2h，然后常温水浴探针式超声(超声功率60％)6min，形成W/O/W复乳，37℃下将所得W/O/W复乳减压旋转蒸发至丙酮挥发完全，即得黄芩苷聚合物脂质纳米粒；
其中，油相与内水相和外水相总体积的体积比为1：10；内水相和外水相的体积比为1：45。
实施例4黄芩苷聚合物脂质纳米粒的制备
称取2mg黄芩苷，溶解于0.5mL 0.1mol/L碳酸钠溶液中，形成内水相；配制0.3％F68乳化剂水溶液40mL形成外水相；称取8mg PLGA、40mg DMPC和10mg DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000与DMPC质量比为1:4)，超声溶解于二甲基亚砜中，形成油相；68℃温度下将内水相边涡旋边注入油相中，涡旋0.5min，然后冰水浴探针式超声(功率40％)3min，形成W/O初乳；
再将W/O初乳在高速搅拌下注入外水相中，8000r/min搅拌1.8h，然后常温水浴探针式超声(超声功率60％)6min，形成W/O/W复乳，37℃下将所得W/O/W复乳减压旋转蒸发至丙酮挥发完全，即得黄芩苷聚合物脂质纳米粒；
其中，油相与内水相和外水相总体积的体积比为1：9；内水相和外水相的体积比为0.5：40。
实施例5黄芩苷聚合物脂质纳米粒的制备
称取2.5mg黄芩苷，溶解于1.5mL 0.1mol/L氨水中，形成内水相；配制0.33％P188乳化剂水溶液50mL形成外水相；称取10mg PLGA、45mg大豆磷脂和10mg DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000与大豆磷脂质量比为1:4.5)，超声溶解于乙酸乙酯中，形成油相；72℃温度下将内水相边涡旋边注入油相中，涡旋0.5min，然后冰水浴探针式超声(功率40％)3min，形成W/O初乳；
再将W/O初乳在高速搅拌下注入外水相中，8000r/min搅拌2.2h，然后常温水浴探针式超声(超声功率60％)6min，形成W/O/W复乳，37℃下将所得W/O/W复乳减压旋转蒸发至丙酮挥发完全，即得黄芩苷聚合物脂质纳米粒；
其中，油相与内水相和外水相总体积的体积比为1：11；内水相和外水相的体积比为1.5：50。
以下以实施例3制备得到的黄芩苷聚合物脂质纳米粒为例，对本发明制备得到的纳米粒进行理化性质考察、对乳腺癌MCF-7细胞的毒性测定、以及对乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型的药效研究，具体的实验方法和实验结果分别如下：
应用例1黄芩苷聚合物脂质纳米粒的理化性质测定
通过对黄芩苷聚合物脂质纳米粒粒的外观形态与微观形态观察、粒径及Zete电位测定、体外释放测定、红外光谱扫描法分析及冻干保护剂的选择，评价B-PLN的理化性质，具体的实验方法和实验结果如下：
1、实验方法
1)B-PLN形态观察：取适量的B-PLN分散液，稀释适当的倍数，将稀释的B-PLN分散液滴入铜网，2％的磷钨酸染色1min，晾干铜网，透射电镜下观察B-PLN的形态。
2)Zeta电位与粒径测定：取适量的B-PLN分散液，稀释适当的倍数，取1mL加入样品池中，通过纳米粒度仪测定其Zeta电位与粒径分布。
3)B-PLN稳定性考察：将平行三次制备的B-PLN样品，分别置于室温及冰箱4℃条件下保存，以B-PLN粒径和包封率为评价指标，考察B-PLN三个月内的稳定性；分别取等体积的空白PLN、B-PLN以纯净水和生理盐水为溶剂的溶液于西林瓶中，静置24h后，拍照进行前后对比分析。
4)B-PLN体外释放研究：
(1)标准曲线的制备
配制浓度分别为1.875、3.75、7.5、15、30、60μg/mL的黄芩苷标准溶液，用甲醇定容，取等体积不同浓度的BCN标准溶液，过0.45μm水系滤膜，检测不同浓度黄芩苷标准溶液的峰面积，以黄芩苷标准溶液浓度为横坐标，不同浓度黄芩苷标准溶液的峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制黄芩苷标准溶液放入标准曲线，得出线性公式。
(2)精密度实验
黄芩苷标准品精密称取适量，配制浓度为3.75、7.5、15μg/mL的黄芩苷标准溶液，将稀释的黄芩苷标准溶液取等体积，过0.45μm有机系滤膜，每个浓度每天进样5次，连续进样5天，根据HPLC实验所得数据，计算黄芩苷标准溶液在该方法条件下的日内与日间精密度。
(3)B-PLN体外释放曲线的制作
取相同浓度的B-PLN分散液与黄芩苷标准溶液，将其置于分子量为8000～14000的透析袋中，设置溶出仪的转速为100r/min，温度为37℃，进行体外释放实验，分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h取样(取样体积＝加样体积)过膜测定，计算B-PLN分散液与黄芩苷标准溶液在释放介质中的累积释放率。
2、实验结果
1)B-PLN分散液的外观形态如图2所示，可以看出，B-PLN分散液具有淡蓝色乳光，为透明胶体溶液，具有较好的稳定性。B-PLN分散液的透射电镜形态如图3所示，可以看出，B-PLN呈类球型，大小均匀，无聚集现象。
2)B-PLN的粒径测定结果如图4所示，可以看出，B-PLN的粒径为98.31±2.87nm。B-PLN的Zeta电位测定结果如图5所示，可以看出，B-PLN的Zeta电位为-25.47±2.84mV，PDI为0.25±0.06(小于0.3)，说明制备的B-PLN粒径均匀，分散性好，且具有较好的稳定性。
3)B-PLN稳定性考察结果如表13所示，可以看出，B-PLN于4℃保存，粒径及包封率12周内无较大变化，因此所制备的B-PLN于4℃条件下保存较稳定。
表13 B-PLN稳定性考察结果
Figure BDA0002345238200000161
4)黄芩苷标准溶液的标准曲线方程为y＝53.213x-4.7967(R2＝0.9999)，说明黄芩苷标准溶液的线性关系良好。
黄芩苷标准溶液的精密度实验结果如表14所示，可以看出，黄芩苷标准溶液浓度分别为3.75、15、60μg/mL时，测得日内精密度分别为0.10％、0.68％、0.83％，日间精密度分别为1.03、0.84、0.79％，精密度均小于2％，因此采用HPLC方法测定黄芩苷含量精密度较好，符合方法学要求。
表14黄芩苷标准溶液的精密度实验结果
Figure BDA0002345238200000171
B-PLN体外释放曲线如图6所示，可以看出，黄芩苷标准溶液在前12h内已经释放完全，而B-PLN分散液在36h内累积释放率约90％，说明B-PLN分散液相比于黄芩苷标准溶液具有一定的缓释效果。
应用例2黄芩苷聚合物脂质纳米粒对乳腺癌MCF-7细胞活力的影响
1、实验方法
(1)试剂配制
培养基的配制：取10mL胎牛血清，1mL双抗(青霉素/链霉素溶液)，89mLRPMI-1640不完全培养基，混合。
MTT溶液的配制：250.0mg MTT粉末，用PBS配制浓度为5mg/mL的溶液，无菌条件下操作，过0.22μm无菌滤膜，分装于15mL离心管中，置于-20℃冰箱保存备用。
PBS溶液的配制：取10g分装的PBS粉末，将其溶解于1L的容量瓶中，超纯水定容，高压灭菌锅灭菌，无菌条件下分装，于4℃保存。
B-PLN分散液及空白PLN溶液的配制：取B-PLN，采用冻干保护剂冻干后，根据HPLC法测定包封率，计算黄芩苷浓度。取适量B-PLN分散液及空白PLN溶液，过0.22μm无菌滤膜，于4℃冰箱保存。
黄芩苷溶液的配制：以DMSO为溶剂，制备浓度为2mg/mL的黄芩苷溶液，得到的黄芩苷溶液用RPMI-1640不完全培养基稀释不同浓度梯度，过0.22μm无菌滤膜，现配现用。
(2)MCF-7细胞复苏、培养、传代
MCF-7细胞从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴中使其快速溶化，于1000rpm离心5min，弃上清液，用PBS轻轻吹打清洗，于1000rpm离心5min，弃上清液，加RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)使其重悬，放于CO2培养箱中(5％CO2，37℃)培养。每隔2天更换培养液，倒置显微镜下观察，当MCF-7细胞生长覆盖培养瓶大于80％时，将培养瓶中含细胞代谢物的培养基吸走，PBS清洗3次，胰酶消化离心，弃上清液，加入培养液重悬，吸取一定体积的细胞悬液分装到新的培养瓶中，于CO2培养箱中培养。
(3)黄芩苷聚合物脂质纳米粒对MCF-7细胞活力的影响实验
1)分别精密量取适量的空白-PLN、BCN、B-PLN，经0.22μm的滤膜过滤，待用。
2)取对数期生长的MCF-7细胞，加入胰酶消化为单层细胞，且相互之间不连接成团，即加入培养基，吹打分散混匀，细胞混悬液在血球计数板上计数。
3)将细胞混悬液稀释到细胞数为1×104cells/mL。
4)将96孔板在紫外灯下消毒30min，每孔加入100μL的细胞混悬液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
5)24h后，取出96孔板，去除旧的培养基，分别加入空白-PLN、BCN、B-PLN(浓度分别为80、40、20、10、5、2.5和1.25μg/mL)，材料设置五个浓度梯度组和空白对照组，每组5个平行，将不同组96孔板放入培养箱中48h。
6)48h后，取出96孔板，去除旧的培养基，每空加入20μL MTT溶液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养4h。
7)4h后，取出96孔板，去除其中的MTT溶液和培养基，加入150μL的DMSO溶液溶解甲瓒，轻轻摇晃使结晶物溶解，37℃孵育20min，之后将96孔板置于酶标仪上检测，在490nm处记录OD值。
以空白组调零，实验重复3次，计算细胞活力及IC50。细胞毒性计算公式如下：
细胞活力(％)＝(药物处理组OD值-空白调零组OD值)/(对照组OD值-空白调零组OD值)×100％。
(4)黄芩苷聚合物脂质纳米粒对MCF-7细胞凋亡的影响实验
1)将取对数生长期MCF-7细胞，用无酚红胎牛血清培养基制备MCF-7细胞悬液，以2×105个/孔接种于6孔板中，于5％CO2，37℃培养箱中培养过夜，去除培养基，加入PBS、空白-PLN、BCN、B-PLN(以BCN计20μmol/L)的新鲜培养液孵48h；
2)培养完毕后，用胰蛋白酶消化细胞，预冷的PBS洗净，以1000rpm离心5min，收集细胞；
3)预冷的PBS重悬细胞后，加入冷冻乙醇调节乙醇终浓度为75％，细胞样品置于-20℃中固定过夜；
4)取出样品，冷冻PBS洗净后，加入PI/RNAse染液，室温下染色15min；
5)用流式细胞仪(Ex＝488nm，Em＝575nm)检测488nm处红色荧光，记录OD值；实验重复三次，取平均值；
6)采用FlowJo 10.0.7软件对数据进行分析。
2、实验结果
空白-PLN对MCF-7细胞活力的影响结果如图7所示，可以看出，在0.0525～1.68μg/mL浓度范围内，空白-PLN对MCF-7细胞毒性无明显毒性。
BCN、B-PLN对MCF-7细胞活力的影响结果如图8所示，可以看出，随着BCN浓度的增加，BCN和B-LPN对MCF-7细胞毒性增强，其呈现一定程度的浓度依赖性，且B-LPN对MCF-7细胞的毒性显著高于BCN。
黄芩苷聚合物脂质纳米粒在12h内和24h内对MCF-7细胞凋亡的影响结果分别如图9和图10所示，可以看出，BCN、B-PLN具有促进MCF-7细胞凋亡的作用，B-LPN对MCF-7细胞凋亡的促进作用显著高于BCN，且随着作用时间的延长，B-LPN对MCF-7细胞凋亡的促进作用显著增强。
应用例3黄芩苷聚合物脂质纳米粒对乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型的药效研究
1、实验方法
(1)乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型的建立
将购置于广东省医学实验动物中心的雌性Balb/c裸鼠于无菌级(SPF)动物房中分笼饲养，相对湿度60±15％，环境温度23±2℃，自然光照，国家标准固体混合饲料喂养，自由饮水，待其饲养一周后，将培养的密度为1×107MCF-7细胞与基质胶等比混合，皮下注入雌性Balb/c裸鼠(4-5周龄，体重18-22g)腋下右侧方，2w左右，待肿瘤长至约100mm3时，视为建模成功。
(2)实验分组及给药方式
将建模成功的MCF-7模型裸鼠，随机平均分为生理盐水组、BCN组、空白-PLN组、B-PLN组共四组，分别尾静脉注射生理盐水、BCN、空白-PLN、B-PLN，每3d给药一次，共给药7次。
(3)乳腺癌细胞MCF-7裸鼠体重变化测定
每只乳腺癌细胞MCF-7裸鼠均先称量体重，根据体重给药，给药剂量为6mg/kg(按BCN量计)。每次给药前用天平对每只MCF-7模型裸鼠进行称重并记录，记录MCF-7模型裸鼠给药前后体重变化。
(4)乳腺癌细胞MCF-7裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定
建模后，每次给药前测量MCF-7模型裸鼠肿瘤的长径和短径，并根据以下公式计算肿瘤体积大小，根据MCF-7模型裸鼠的肿瘤体积变化绘制肿瘤生长曲线，根据以下公式计算抑瘤率：
裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率计算公式如下：
肿瘤体积＝1/2ab2；公式中：a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。
抑瘤率(％)＝(V盐水-V治疗)/VPBS×100％；
公式中：a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。V盐水为注射生理盐水的MCF-7模型裸鼠的体积，V治疗分别为注射blank-PLN、BCN、B-PLN的MCF-7模型裸鼠的体积。
(5)数据分析
所有数据重复三次，计算其平均值及SD值(x±SD)，结果进行t检验，P＜0.05说明数据较显著，显著性分析采用SPSS 22.0软件进行计算，图片采用OriginPro8软件进行绘制。
2、实验结果
本发明建立得到的乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型如图11所示。
(1)裸鼠体重变化测定结果
裸鼠体重变化测定结果如图12所示，可以看出，生理盐水组和空白-PLN组MCF-7模型裸鼠体重随着时间的延长有一定程度的增加，而BCN组与B-PLN组相较于生理盐水组的裸鼠体重增长不明显，B-PLN组MCF-7模型裸鼠体重增长最缓慢且体重最低；说明B-LPN能够显著抑制MCF-7模型裸鼠的生长。
(2)裸鼠肿瘤体积变化和抑瘤率测定结果
乳腺癌细胞MCF-7裸鼠肿瘤形态如图13所示，裸鼠肿瘤体积变化结果如图14所示，可以看出，生理盐水组MCF-7模型裸鼠肿瘤体积出现增长的趋势且肿瘤体积较大，BCN组MCF-7模型裸鼠肿瘤的增长相对于生理盐水组稍有减缓，B-PLN组肿瘤体积增长的较为缓慢，说明B-PLN相比于BCN可以显著增强其对MCF-7模型裸鼠肿瘤的抑制作用。
裸鼠肿瘤抑瘤率测定结果如表15所示，可以看出，BCN组抑瘤率为27.89％，而B-PLN组抑瘤率高达33.16％；说明B-PLN具有显著的抑瘤效果。
表15裸鼠肿瘤抑瘤率测定结果
Figure BDA0002345238200000211
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黄芩苷聚合物脂质纳米粒，其特征在于，用脂质材料包裹已装载黄芩苷的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，并用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000进行表面修饰；其中，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为4～5：0.2～0.3：0.8～1.5：1。
2.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述脂质材料、黄芩苷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的质量比为4.5～5：0.25～0.3：1～1.5：1。
3.权利要求1或2所述黄芩苷聚合物脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.按照权利要求1或2所述质量比取黄芩苷，溶解于碱性溶液中，形成内水相，并配制乳化剂的水溶液，形成外水相；
S2.取聚乳酸-羟基乙酸共聚物、脂质材料和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，溶解于有机溶剂中，形成油相；
S3.将步骤S1的内水相涡旋注入步骤S2的油相中，超声，形成W/O初乳；
S4.将步骤S3的W/O初乳与步骤S1的外水相混合搅拌均匀，形成W/O/W复乳，减压蒸发，即得所述黄芩苷聚合物脂质纳米粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述油相与步骤S1所述内水相和外水相总体积的体积比为1：9～11。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述内水相和外水相的体积比为0.5～1.5：40～50。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述脂质材料为大豆磷脂或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述乳化剂为P188或F68。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述涡旋注入时的温度为68℃～72℃。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述搅拌的时间为1.8～2.2h。
10.权利要求1～2所述纳米粒或权利要求3～9所述方法制备得到的纳米粒在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
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