CN106902095A - 一种集化疗与免疫疗法为一体的纳米制剂及制备方法 - Google Patents

一种集化疗与免疫疗法为一体的纳米制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种集化疗与免疫疗法为一体的纳米制剂及制备方法。本发明采用超声乳化法结合溶剂挥发法制得装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂；通过优化超声强度和时间，调节内水相和油相的比例，所制得的聚乳酸纳米制剂具有粒径小且均一，分散性好等优点。本发明所述的载黄芩苷聚乳酸纳米制剂具有活化抗原提呈细胞和杀伤黑色素肿瘤细胞的双重功能，为化疗与免疫疗法相结合的新型治疗肿瘤的方法奠定了基础。

Description

一种集化疗与免疫疗法为一体的纳米制剂及制备方法
技术领域
本发明涉及医药工程的药物制剂领域，尤其涉及一种粒径小且均一、分散性好，具有免疫与化疗双功能的载黄芩苷纳米制剂及其制备方法。
背景技术
近年来，虽然医药药品不断进步，但是中国传统中草药仍然在医院被广泛使用，也可以作为佐剂或主要的治疗剂来治疗疾病。黄芩(Scutellariae baicalensis Georgi.)的根是一种重要的中国大宗药材，常与其他药材结合被用作利尿剂、泻药、退热药、解热和抗恶性肿瘤药剂等。其中，黄芩苷是黄芩干燥根中提取的黄酮类化合物的主要组成成分，具有多方面药理作用，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎和抗癌等作用。最近，越来越多报道证明了黄芩苷具有潜在的抗肿瘤活性。虽然这些效用的机制尚未很好地被理解，先前也有报告表明黄芩苷具有控制癌细胞的生长，并诱导细胞凋亡的功效。迄今为止，有越来越多的研究表明，一些中药成分在低剂量下可以通过激活自身免疫系统功能，来攻击肿瘤细胞；然而，中药表现出的抗肿瘤药效呈剂量依赖性，高剂量才表现出对某些体内正常细胞的细胞毒作用。此外，黄芩苷的难溶性给黄芩苷的药效带来了许多缺陷，如在溶液中稳定性差、吸收差和生物利用度低等。为了克服这些限制，建立一种药物递送系统，例如纳米粒子、脂质体、微乳剂和聚合物植入装置等正在成为可行的替代方案之一，同时也可以改善黄芩苷生物利用度。
装载有各种治疗剂的纳米粒子作为药物载体，可以在血液中较长时间的循环，增加肿瘤细胞中的药物浓度，进而提高对肿瘤细胞的杀伤效果；另外，通过激活自身免疫系统实现对肿瘤细胞的清除，将有利于残余肿瘤细胞的彻底清除。此外，树突细胞(DC)是免疫系统中介导免疫反应的关键细胞，它们能够捕获和加工抗原，并将抗原与MHC复合物呈递到DC细胞表面，，诱导T细胞活化，从而构建内源性和适应性免疫应答反应。针对DC易于摄取颗粒型抗原的特点，将具有免疫激活功能的药物包埋装载到纳米颗粒内，有效提高DC的摄取能力，进而更有效地活化DC细胞。可降解聚合物聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)等是目前生物医药研究中的重要材料，具有良好的生物安全性和生物相容性，并且已被FDA批准用于药物递送和药物制剂组分；和铝盐佐剂疫苗相比，基于聚乳酸类材料的纳米制剂在疫苗递送研究中尤为瞩目，采用聚乳酸制备的纳米颗粒佐剂在促进抗原交叉提呈、增强Th1细胞免疫应答方面具有独特的优势，同时颗粒佐剂也能够显著提升疫苗的体液免疫应答。近几年，PLGA、PLA和PELA纳米制剂被开发作为药物递送系统，具有良好的生物相容性和生物可降解性、改善药物的溶解度、生物利用度高、可控制药物释放和良好的稳定性等优点。
疫苗所引起的免疫应答首先需要免疫细胞的活化，即B细胞和T细胞的活化。这两类细胞的活化从根本上来说都需要抗原提呈细胞(APC)发挥功能。而DC是主要的抗原提呈细胞之一，因此，针对DC设计的载黄芩苷纳米制剂，以期能够大大增强DC的活化水平，进而增强体内免疫应答。本发明所述的纳米制剂作用于递送黄芩苷至树突细胞(DC)和黑色素瘤(B16)细胞，载黄芩苷的聚乳酸纳米粒与DC共培养，研究了其对DC的免疫调节功能。与此同时，进行了载黄芩苷的聚乳酸纳米粒与B16细胞共孵育，通过细胞凋亡测定实验和细胞周期分析研究，考察其对黑色素瘤细胞的杀伤功能。这为开发集免疫活化与肿瘤杀伤于一体的治疗策略奠定了基础。
发明内容
本发明针对黄芩苷的药理作用及其理化特性设计了聚乳酸-聚羟基乙酸装载黄芩苷的纳米制剂，采用超声乳化结合溶剂挥发法制备了均一可控、粒径小、分散性好的可包埋装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂，提高其溶解性和生物利用度，实现载黄芩苷聚乳酸纳米制剂对抗原提呈细胞的活化作用和对黑色素瘤细胞的杀伤作用。
本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂，所述装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂具有粒径小且均一，分散性良好的特点；制备粒径为80-400nm的纳米粒，PDI为0.1-0.4，优选粒径为90-120nm,PDI小于0.15。
本发明中所述聚乳酸类纳米制剂优选粒径大小为90-120nm,例如可以是90nm、95nm、110nm、115nm、118nm或120nm。
当所述聚乳酸类纳米制剂粒径越小，越容易被细胞摄取，例如粒径为90-120nm时，纳米制剂被摄取量可能会越大。纳米制剂发挥其免疫与化疗的功能的可能性越大。
本发明中所述载黄芩苷纳米制剂粒径分散系数范围为0.1-0.4，例如可以是0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4，优选为小于0.15。
第二方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的集化疗与免疫疗法于一体的装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将聚乳酸类材料溶解于有机溶剂作为油相，将黄芩苷溶解于磷酸缓冲液(PBS)中作为内水相，将表面活性剂溶解于水中作为外水相；
(2)将内水相倒入油相中，在冰水浴条件下超声制备油包水型初乳液，将所述初乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相中，冰水浴条件下超声制备水包油包水型预复乳液，然后将预复乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相中，得到复乳液。
(3)将所述复乳液进一步溶剂挥发固化，得到装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂。
本发明所述的粒径均一、分散性好、集化疗与免疫疗法于一体的装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂的制备方法。具体步骤如下：
将聚乳酸类材料溶解于有机溶剂作为油相(O)，将黄芩苷溶解于PBS中作为内水相(W1)，将表面活性剂溶解于水中作为外水相1(W2)，将表面活性剂溶解于水中作为外水相2(W3)。将内水相倒入油相中，在冰水浴条件下超声制备油包水型初乳液(W1/O)，将所述初乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相(W2)中，冰水浴条件下超声制备水包油包水型预复乳液(W1/O/W2)，然后将预复乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相(W3)中，得到复乳液。将所述复乳液进一步溶剂挥发固化一定时间后，乳液经离心洗涤得到装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂。
本发明的步骤(1)中，所述聚乳酸类材料包括但不限于聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)等，优选为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)；所述聚乳酸类材料的浓度为2％-20％，优选为10％-20％。
所述聚乳酸类材料的分子量优选为10000-100000。
本发明的步骤(1)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的任意一种或其组合物，优选为二氯甲烷。
所述表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)、胆酸钠、乳化剂T-20(Tween20)等，优选为胆酸钠。
优选地，所述表面活性剂的浓度为0.5-10％，例如可以是0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、10％，优选为0.5-2.0％。
本发明的步骤(2)中，所述内水相和油相的体积比为1:5-1:20，例如可以是1:5、1:10、1:15、1:20等，优选为1:10。
优选地，所述外水相和油相的体积比为1:4-1:10，例如可以是1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10，优选为1:6-1:9。
本发明的步骤(2)中，所述初乳超声时间为20-80s，例如可以是20s、30s、40s、50s、60s、80s,优选为40s；
所述初乳超声强度为30％-70％，优选为50％，超声方式为脉冲式。
本发明的步骤(2)中，所述复乳超声时间为80-160s，例如可以是80s、100s、120s、160s，优选为120s；
所述复乳超声强度为30％-70％，优选为50％，超声方式为脉冲式。
步骤(3)中，所述固化方式为溶剂挥发法或溶剂扩散法。
本发明通过调整油相与水相的比例，并通过一定的初乳液制备方式，如超声等，使初乳液在纳米制剂形成过程中能够融合，形成内腔，包埋黄芩苷，与抗原提呈细胞DC共孵育后，与对照组相比显著提高其表面分子CD40、CD86、MHC类分子的表达，同时诱导出高水平的细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达。同时，该纳米制剂能在抗黑色素瘤细胞中发挥强有力的药效，体现了载黄芩苷纳米制剂的免疫与化疗的双重功能。
附图说明
图1是本发明所制备的集化疗与免疫疗法于一体的载黄芩苷纳米制剂结构示意图；
图2是载有黄芩苷的PLGA纳米制剂扫描电镜图与粒径分布图，其中，图2-A是实施例1制备的集化疗与免疫疗法于一体的载黄芩苷纳米制剂扫描电镜图；图2-B是现有的载有黄芩苷的PLGA纳米制剂粒径分布图；
图3是载有黄芩苷的PLGA纳米制剂在与抗原提呈细胞共孵育后，抗原提呈细胞共刺激分子CD40、CD86和表面标志分子MHCI、MHCII的表达水平。
图4是载有黄芩苷的PLGA纳米制剂在与抗原提呈细胞共孵育后，抗原提呈细胞分泌细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL12)和α-肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌量。
图5是载有黄芩苷的PLGA纳米制剂与黑色素瘤B16细胞共孵育后，B16细胞凋亡的情况；
图6是载有黄芩苷的PLGA纳米制剂与黑色素瘤B16细胞共孵育后，B16细胞周期阻滞情况。
具体实施方式
以下将结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细描述。
图1是本发明所制备的集化疗与免疫疗法于一体的载黄芩苷纳米制剂结构示意图。
实施例1
配制1.5％的聚乙烯醇(PVA)水相作为外水相(W2)，1％的PVA水相作为外水相(W3)，配置1mg/mL的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取0.4g的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于2mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把200μL溶解好的内水相加入2mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入12mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入18mL含1％PVA水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在300nm左右的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包埋率为28.5％，黄芩苷装载率为4.76μg/mg。
实施例2
配制1.5％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为26.7％，黄芩苷装载率为4.38μg/mg。
实施例3
配制1.5％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置1mg/mL的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸(PLA)溶于10mL的丙酮中，作为油相(O)，把1mL溶解好的内水相加入10mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入60mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入90mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备得到的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在160nm左右的均一聚乳酸(PLA)纳米制剂。黄芩苷包埋率为25.4％，黄芩苷装载率为5.16μg/mg。
实施例4
配制10％的乳化剂T-20(Tween-20)水相作为外水相(W2)，5％的Tween-20水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)溶于乙酸乙酯中，作为油相(O)，把200μL溶解好的内水相加入4mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入40mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入含5％Tween-20水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在400nm左右的均一聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)纳米制剂。黄芩苷包封率为34.3％，黄芩苷装载率为2.35μg/mg。
实施例5
配制1.5％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置1mg/mL的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入500μL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入2mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包埋率为19.8％，黄芩苷装载率为2.13μg/mg。
实施例6
配制1.5％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置1mg/mL的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入至2mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入20mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入含0.5％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包埋率为29.6％，黄芩苷装载率为4.35μg/mg。
实施例7
配制1％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，0.5％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含0.5％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备得到复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为21.7％，黄芩苷装载率为4.18μg/mg。
实施例8
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，0.5％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为25.8％，黄芩苷装载率为5.29μg/mg。
实施例9
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，0.5％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声20s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含0.5％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声80s，超声强度均为30％，制备得到复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在300nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为23.7％，黄芩苷装载率为4.98μg/mg。
实施例10
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，0.5％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含0.5％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为26.4％，黄芩苷装载率为4.38μg/mg。
实施例11
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，0.5％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声80s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含0.5％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声160s，超声强度均为70％，制备得到复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在80nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为16.7％，黄芩苷装载率为1.38μg/mg。
实施例12
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的乙酸乙酯中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为24.7％，黄芩苷装载率为4.20μg/mg。
实施例13
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的丙酮中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在120nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为23.7％，黄芩苷装载率为2.89μg/mg。
实施例14
配制2％的PVA水相作为外水相(W2)，1％的PVA水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％PVA水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在200nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为23.7％，黄芩苷装载率为2.89μg/mg。
实施例15
配制2％的PVA水相作为外水相(W2)，1％的PVA水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的丙酮中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％PVA水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在160nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为24.7％，黄芩苷装载率为3.73μg/mg。
实施例16
配制2％的PVA水相作为外水相(W2)，1％的PVA水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的乙酸乙酯中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％PVA水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在160nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为24.3％，黄芩苷装载率为3.69μg/mg。
实施例17
配制2％的Tween-20水相作为外水相(W2)，1％的Tween-20水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的乙酸乙酯中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％Tween-20水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在160nm左右的均一聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。黄芩苷包封率为24.7％，黄芩苷装载率为3.73μg/mg。
实施例18
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。如图2所示，PLGA纳米粒分散性好，PDI 0.103(图2-A)，粒径120nm(图2-B)，黄芩苷包封率为26.8％，黄芩苷装载率为5.36μg/mg。
实施例19
装载黄芩苷的PLGA纳米制剂免疫功能的研究。称取5mg/mL载黄芩苷纳米制剂悬浮于RPMI1640完全培养基中，与抗原提呈细胞(DC)共孵育，37℃培养箱中培养16h，搜集细胞上清用于细胞因子的测定，采用流式细胞术测定DC表面相关标志分子的表达。如图3所示，结果显示了与空白组和单纯黄芩苷组相比，载黄芩苷PLGA纳米制剂能够诱导DC细胞更高水平的CD40、CD86、MHC类分子的表达，并且在细胞免疫相关细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α表达水平上显示出比空白组和单纯黄芩苷组更高的分泌水平(图4)。
实施例20
装载黄芩苷的PLGA纳米制剂对黑色素瘤B16肿瘤细胞的化疗功能的研究。称取一定量载黄芩苷PLGA纳米制剂悬浮于DMEM完全培养基中，37℃细胞培养箱中与B16细胞共孵育48h，结果如图5所示，显示了黄芩苷能够有效杀伤B16细胞，而载黄芩苷PLGA纳米制剂在协载微量黄芩苷的情况同样对B16细胞具有显著的杀伤的效果；如图6所示，黄芩苷和载黄芩苷纳米制剂能够使B16细胞周期阻滞于G2/M期，这可能是B16细胞凋亡的关键因素。
实施例21
配制2％的胆酸钠水相作为外水相(W2)，1％的胆酸钠水相作为外水相(W3)，配置一定量的黄芩苷的PBS水溶液作为内水相(W1)，称取一定量的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶于1mL的二氯甲烷中，作为油相(O)，把100μL溶解好的内水相加入1mL油相中，冰水浴超声乳化制备油包水型初乳液(W1/O)，然后将其倒入6mL含胆酸钠水相(W2)中，冰水浴超声40s乳化制备得到预复乳液(W1/O/W2)，将预复乳液倒入9mL含1％胆酸钠水相(W3)中，冰水浴超声120s，超声强度均为50％，制备粒径小且均一的复乳液(W1/O/W2)，随后置于通风橱中搅拌固化过夜。固化的纳米制剂采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米制剂。扫描电镜图如图2所示，PLGA纳米粒分散性好，PDI值为0.103(图2-A)，粒径120nm(图2-B)，黄芩苷包封率为26.8％，黄芩苷装载率为5.36μg/mg。采用此纳米制剂与空白组合单纯黄芩苷分别对抗原提呈细胞DC和黑色素瘤B16细胞共孵育，结果显示出携载微量黄芩苷的PLGA纳米制剂能够诱导出更高的细胞免疫水平和对肿瘤细胞的杀伤功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂，其特征在于，所述装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂具有粒径小且均一，分散性良好的特点，制备粒径为80-400nm的纳米粒，分散性PDI值为0.1-0.4，优选粒径为90-120nm,PDI小于0.15。
2.如权利要求1所述的装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂，其特征在于，所述装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂包埋黄芩苷；
优选地，所述黄芩苷纯度为98％，包埋率为25％以上，装载率为5.0μg/mg以上。
3.如权利要求1-2所述的装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将聚乳酸类材料溶解于有机溶剂作为油相，将黄芩苷溶解于PBS中作为内水相，将表面活性剂溶解于水中作为外水相；
(2)将内水相倒入油相中，在冰水浴条件下超声制备油包水型初乳液(W1/O)，将所述初乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相(W2)中，冰水浴条件下超声制备水包油包水型预复乳液(W1/O/W2)，然后将预复乳液倒入含有一定量表面活性剂的外水相(W3)中，得到复乳液；
(3)将所述复乳液进一步溶剂挥发固化，得到装载黄芩苷的聚乳酸纳米制剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚乳酸类材料包括但不限于聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)等合成高分子聚合物，优选为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)；
所述聚乳酸类材料的浓度为2％-20％，优选为10-20％；
所述聚乳酸类材料的分子量优选为10000-100000。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中的任意一种或至少两种的混合物；优选为二氯甲烷；
所述表面活性剂为聚乙烯醇、胆酸钠、Tween20中的任意一种；所述表面活性剂的浓度为0.5-10％，优选为0.5-2.0％。
6.如权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述内水相和油相的体积比为1:5-1:20，优选为1:10；
所述油相和外水相的体积比为1:4-1:10，优选为1:6-1:9。
7.如权利要求3-6任一项所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述初乳超声时间为20-80s，优选为40s；
所述初乳超声强度为30％-70％，优选为50％，超声方式为脉冲式。
8.如权利要求3-7任一项所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复乳超声时间为80-160s，优选为120s；
所述复乳超声强度为30％-70％，优选为50％，超声方式为脉冲式；
步骤(3)中，所述固化方式为溶剂挥发法或溶剂扩散法。
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