TWI383806B - 以兩性團聯共聚物為基礎的複合相乳狀液 - Google Patents

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Description

以兩性團聯共聚物為基礎的複合相乳狀液 技術領域
本發明廣義而言係有關於乳狀液製劑配方，而更特別地係關於一種複合相乳狀液製劑配方。
在疫苗佐劑的臨床試驗評估中，乳化劑型佐劑具有生產容易和成本低廉的優勢。弗氏佐劑和ISA 51(ISA51)包含礦物油和親脂性乳化劑單油酸甘露聚糖甘(Mannide monooleate)，為具有可分散性抗原溶液和連續油相的油包水乳狀液。雖然科學家尚未完全了解佐劑的作用機制，但油包水型佐劑可提升疫苗的無毒性並延長免疫反應時間等特性已獲得肯定。然而若採用直徑過小的一次性注射針筒接種疫苗，會產生注射不易的缺點。加上其在注射部位造成的局部副作用，限制了疫苗佐劑應用於人體的可行性。有研究指出可將其重新分散於親水性乳化劑80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)的水相中，以改善上述疫苗的注射能力。但由於80係一脂質分散劑，且會攻擊細胞表面，因此具有毒性。據臨床前實驗指出，添加使用80所穩定的乳狀液通常比無佐劑配方疫苗具有更好的免疫效果，可惜的是其免疫副作用同時也會上升。
為了增加可應用於疫苗佐劑之安全乳化劑的數量，採用合成聚合物成為取代低分子界面活性劑(LMWS)的可能性選擇；因為其親水與親脂性團聯共聚物的尺寸以及相對位置，可簡易地藉由單體添加順序和數量進行調整，而使其具備不同界面活性劑之特性。以為例，該佐劑是一以鯊烯(squalene)為基礎的油包水乳狀液，而該乳狀液則是由微粒矽珠和非離子型團聯共聚物聚氧乙烯-聚丙二醇-聚氧乙烯(POE-POP-POE，又可稱為或)穩定結合而成。相較於以低分子界面活性劑進行乳化之製劑配方，佐劑能誘發更有效的免疫反應，然而由於該穩定劑具毒性，且不能被生物分解，因此該佐劑是否適合應運用於人體疫苗遞送系統仍未有定論。
迄今該項技藝仍需提出解決前述缺點及不適當性之方法，特別是有關提升做為疫苗佐劑之油包水乳狀液的親水性。
本發明係關於一種合成物，其組成成分為：
(a)　一含H2 O分子的連續水相；
(b)　一含油脂的油相；以及
(c)　一穩定結合介於油相與連續水相界面的兩性乳化系統，該乳化系統包括一種符合(A)p -(B)q -(C)r 化學式的團聯共聚物其中：p 、q 和r 皆為整數，而且：如果p 為0，則A必須不為羥基或反應官能基，而該團聯共聚物為兩團聯共聚物，其中(B)q 為親水基而(C)r 為疏水基；B和C各為重覆單元；如果p 大於1，則該團聯共聚物為三團聯共聚物，其(B)q 為親水基且(A)p 和(C)r 各為疏水基；疏水基(A)p 和(C)r 各為均聚物或異聚物；A、B和C各為重覆單元；重覆的A和C可以是相同或相異的單元；且其中q /(p +r )的比例夠高，以使團聯共聚物的親水親脂平衡(HLB)值大於10。
於本發明之一項具體態樣，前述之合成物分散於一磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，該合成物為水包油(O/W)型態之乳狀液，其水相由PBS所組成。
該油相可捉住或包覆一抗原及/或生物活性劑。而該連續水相則包含一抗原及/或生物活性物質。
於本發明之另一項具體態樣，上述合成物不需要置於有機溶劑中。
於本發明之另一項具體態樣，該油相包含一乳狀液，其成分含有：
(a)　一包含水分子之內水相，且分散於油相中；
(b)　一穩定結合介於內水相和油相界面的親脂性乳化系統，形成油包水(W/O)乳狀液；因此，該合成物為水包油-油包水複合相乳狀液。
於本發明之另一項具體態樣，該親脂性乳化系統至少含有一生理上可接受的乳化劑，該乳化劑係選自由單油酸甘露聚糖甘和山梨糖酯所組成的基團。
該水包油-油包水乳狀液製劑配方可含有，一溶於內水相及/或連續水相的抗原及/或生物活性物質。該抗原可以是一種去活化病毒，如H5N1病毒，或為細菌及/或一抗原蛋白或抗原融合蛋白。
於本發明之另一項具體態樣，該內水相包括一抗原及/或生物活性劑。
於另一方面，本發明係關於一種符合如下化學式的兩團聯共聚物：(A)p -(B)q -(C)r 其中：p 、q 和r 皆為整數，而且：如果p 為0，則A必須不為羥基或反應官能基，而該團聯共聚物為一種兩團聯共聚物，其中(B)q 為親水基而(C)r 為疏水基；B和C各為重覆單元；如果p 大於1，則該團聯共聚物為三團聯共聚物，其中(B)q 為親水基且(A)p 和(C)r 各為疏水基；疏水基(A)p 和(C)r 各為單質聚合物或異質聚合物；A、B和C各為重覆單元；重覆的A和C可以是相同或相異的單元；且其中q /(p +r )的比例夠高，以使團聯共聚物的親水親脂平衡(HLB)值大於10。
於本發明之一項具體態樣，該親水基(B)q 至少占團聯共聚物50%之比重。
於本發明之一項具體態樣，p 為0且A為甲氧基。
於本發明之另一項具體態樣，該團聯共聚物具有生物可吸收性。
於本發明之另一項具體態樣，該親水基(B)q 為一種線性共聚物。
於本發明之另一項具體態樣，該重覆單元B係選自由環氧乙烷、乙烯吡咯烷酮和丙烯醯胺所組成的基團。
於本發明之另一項具體態樣，該疏水基(A)p 和(C)r 各為聚酯共聚物。
於本發明之再另一項具體態樣，該疏水基(A)p 和(C)r 各為脂肪族聚酯。
於本發明之另一項具體態樣，重覆單元A和C各選自由羥基酸、內酯，及其化合物所組成的基團。
該羥基酸可選自由乳酸、6-羥基己酸、乙醇酸、蘋果酸單酯，及其化合物所組成的基團。
該內酯可選自由ε-己內酯、乳酸交酯、乙交酯、1,4-二氧雜環己-2-酮(para-dioxanones)，及其化合物所組成的基團。
於本發明之另一項具體態樣，該脂肪族聚酯係由二羧酸和二醇所組成之聚合物。
於本發明之另一項具體態樣，該疏水基團(A)p 和(C)r 各包括一聚合物，其係選自由以下化合物所組成之聚合物：
(a)　含有羥基酸之聚合物：聚乳酸交酯、聚乳酸、聚乳酸交酯乙交酯共聚物、聚乙交酯、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚蘋果酸、聚蘋果酸酯或聚乙醇酸。
(b)　含有內酯之聚合物：聚乳酸交酯-ε-己內酯共聚物、聚ε-己內酯或聚乙交酯-ε-己內酯共聚物；以及
(c)　含有羥基己酸之聚合物：聚乳酸-6-羥基己酸共聚物、或聚乙交酯-6-羥基己酸共聚物。
然而於本發明之另一具體態樣，該團聯共聚物係選自由聚(乙二醇)-團聯-聚(乳酸交酯-共-ε-己內酯)、聚(乙二醇)-團聯-聚乳酸交酯和聚(乙二醇)-團聯-聚(ε-己內酯)所組成之團聯聚合物。
本發明之此等其他方面由下列較佳具體態樣，結合下列圖示之說明而彰顯出，然而在不偏離該揭示內容之新穎概念的精神及範圍下，可於其中進行變更與修改。
所提供之圖式列舉說明本發明之一或多項具體態樣，其與下述詳細說明一起，係用以解釋本發明之創作原理。若可能，於圖式中使用相同參考編號，來引述實施例中之相同或類似元件。
在本發明所使用的特殊術語有其原本的意義，如下所用的某些特殊術語是提供熟悉該技藝者能更進一步了解本發明內容。為了方便起見，一些特殊術語將會使用斜體字或引號標示出來，但這些被標示出來的部分並不會影響到特殊術語本身的範圍或意義，就如同在本文中未被標示的文字一樣，也就是說同樣的事情會有一個以上的說法。本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
除非另有規定，本發明所涉及的科學和技術所用詞彙和一般普通技能所使用的詞彙相同，若在有所衝突的情況下，本發明將會給予名詞新的定義。
本發明所使用的“約略”、“大約”或“大概”廣義而言應意指，所給予數值或範圍之上下百分之二十，較佳是百分之十，且更佳地是百分之五的範圍內，在此所給予之數值數量為大約的意思，表示術語“約略”、“大約”或“大概”，並沒有明文強制規定。
本發明所使用的“免疫佐劑”，是指與病毒、細菌或合成之抗原共同投藥時用來增加免疫反應的物品。
本發明所使用的“生物可降解的”，是指分解的固體聚合物，即大分子的降解並分散於生物體內；但沒有證據顯示其分解後會被排出體外(本定義並不包括環境、真菌或細菌的降解)。生物可分解的聚合物會受到生物成分攻擊，所以有時候但並非必然的，該物質和大分子的完整性受到攻擊後降解成片段或其他副產品。這些片段會被帶離降解處，但不會被排出生物體外。
本發明所使用的“具生物可吸收性”，為可表現出大量降解並於生物體內再被吸收的固體聚合物。例如透過簡易地過濾降解副產品，或代謝活動等自然途徑而被消溶的聚合物。生物可吸收性指的是起始外來材料和大量降解副產品(低分子量化合物)被完全消溶，而沒有留下任何殘留副作用的一個概念。“生物可吸收性”一詞假設其消溶為一必然的表現(Dietmar W. Hutmacher(2000)“Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage”Biomaterials 21:2529-2543，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。
本發明所使用的“內酯(lactone)”為一種環狀酯，是在同一分子內的一個醇基(-OH)和一個羧基(-COOH)的縮合產物。其特徵為一個由兩個或兩個以上的碳原子和一個氧原子，以及一個緊接在兩個碳原子之間的酮基(=O)所組成的閉環狀原子團。“乳酸交酯”(lactide)則是乳酸的環狀酯，如一雙內酯。而“乙交酯”(glycolide)則為乙醇酸的環狀酯，亦為一雙內酯。
本發明所使用的“二羧酸”(dicarboxylic acids)，指的是由兩個羧酸官能基所取代的有機化合物，如丁二酸。
本發明所使用的“二醇”(diol)或“乙二醇”(glycol)，為包括兩個羥基(-OH基團)的化合物，如乙二醇。
本發明所使用的“羥基酸(hydroxy acid)”，指的是由一個羧酸官能基和一個羥基官能基所組成的有機化合物。
本發明所使用的“兩性分子化合物”，為任何同時帶有親水和疏水成分的有機化合物。
本發明所使用的“q /(p +r )的比例夠高”，指的是親水親脂平衡(HLB)值大於10且符合(A)p -(B)q -(C)r 化學式的團聯共聚物。其可促使一個油相分散於一個水相當中而形成一個水包油乳狀液。例如兩性團聯共聚物的HLB值可大於10、11、12、13、14、15、16、17、18、或接近20。
本發明所使用的“A必須不為反應官能基或反應基團”是指，A為任何一個不會在非保護基團發生反應的條件下進行反應的基團。在這樣的情況下，A基團會保護反應官能基，例如羥基或氨基，使其能順利發生聚合反應。
本發明所使用的“羥基保護基(hydroxy-protecting group)”，指的是通常在其後發生的反應中用來保護羥基的任何基團，包括烷氧基、醯基或烷基矽基團，如三甲矽基、三乙基矽基、第三丁基雙甲基矽基和類似的烷基或芳香基矽基，或者烷氧烷基基團，例如甲氧甲基、乙氧甲基、甲氧甲基、甲氧基乙氧甲基、四氫呋喃或四氫吡喃。而“被保護的羥基(protected-hydroxy)”，則是受到上述羥基保護基之一保護的羥基基團。“烷基”為直鏈或衍生的碳氫化合物或在異構形式中的1至10個碳原子，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基和戊基等。而“羥烷基”、“氟烷基”和“氘代烷基(deuteroalkyl)”則是被一個或一個以上羥基、氟基或氘基分別取代的烷基團。“醯基”是在異構形式中1至6個碳原子的烷醯基，或芳醯基，如由苯甲醯基基團取代之苯甲醯、或鹽-、氮-或烷基-，或是(烷基-O-CO-)型態的烷氧羰基基團，例如甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基等，或是雙羧酸醯基團，例如乙二醯基、丙二醯、丁二醯、戊二醯或己二醯。“芳基(aryl)”，指的是苯基-，或由一個烷基-、氮-或鹽-取代苯基的基團。烷氧基則是烷基-氧-基團。
本發明所使用的縮寫如下：1 H-NMR為質子核磁共振；APCs為抗原表現細胞群；BCA為蛋白質濃度分析法；ELISA為酵素免疫分析法；FDA為美國食品暨藥物管理局；GPC為凝膠層析法；HLB是親水親脂平衡值；IgG是免疫球蛋白G；ISA51則是油性佐劑ISA 51；LMWS為低分子界面活性劑；MALDI-TOF MS是基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀；MePEG5000 為聚乙二醇5000單甲基醚；Mn為數量平均分子量；Mw/Mn是相對分子質量分散度；OVA為卵白蛋白；O/W是水包油；PBS則為磷酸鹽緩衝液；PBS/ISA51則是磷酸鹽緩衝液被包覆於ISA51油劑的乳狀液；PEG-b -PCL是聚乙二醇聚ε-己內酯團聯共聚物；PEG-b -PLA是聚乙二醇聚乳酸交酯團聯共聚物；PEG-b -PLACL則是聚乙二醇聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物；PEG-b -PLACL/ISA51/PBS為使用聚乙二醇聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物所穩定的ISA51乳狀液並分散於磷酸鹽緩衝液當中；POE-POP-POE是聚氧乙烯-聚丙二醇-聚氧乙烯團聯共聚物；s.c.指的是皮下注射的；SnOct2 為辛酸亞錫；THF是四氫呋喃；TMB為四甲基聯苯胺；80是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯；W/O是油包水；W/O/W則為水包油-油包水。
判定乳化劑之親水親脂平衡(HLB)值即可了解其相對水相和油相親和力。一個含有低HLB值乳化劑的乳化系統，會對油相具有高親和力而產生一油包水型式的乳狀液。相對地，一個含有高HLB值的乳化系統，會對水相具有高親和力而產生一水包油型式的乳狀液。而當一個乳化系統含一個居中的HLB值，則可獲得一個水包油-油包水複合相乳狀液。這些參數顯著受到一個界面活性劑系統最佳化及其製備過程的影響。
若一個乳化系統包括一個或多個乳化劑，其HLB值的計算依據如下的方程式：
HLBmix =ΣXi x HLBi
X是界面活性劑i的重量比。
非離子型表面活劑的HLB值可依Griffin氏提出的方法計算。
HLB=20 x Mh /M
Mh 是分子中親水部分的分子量，而M則是整個分子的分子量。最親脂的分子HLB值接近0，而最親水的分子HLB值約為20。
非離子型共聚物的方程式則可表示為：
HLB共聚物 =20 x Wh /W共聚物
Wh /W共聚物 是聚合物主鏈親水部分的重量比，該數值得自數量平均分子量比例Mnh /Mn共聚物 。
一油包水乳狀液係以親脂性單油酸甘露聚糖甘為基礎，並包括一個不溶於水的油脂。該油脂為礦物油Markol(弗氏佐劑)、可代謝的礦物油Drakeol(ISA 51)或可代謝的非礦物鯊烯油(ISA 720)。則是以鯊烯為基礎的油包水乳狀液，並由微粒矽珠和非離子型團聯共聚物聚氧乙烯-聚丙二醇-聚氧乙烯(POE-POP-POE，又可稱為或)穩定結合而成。這些油包水乳狀液不容易以注射針直徑小的針筒施行注射，並且會在動物的注射部位導致局部副作用，因此限制了該乳狀液應用於人體的可能性。
本發明係關於提升油包水乳狀液親水性之製劑配方，例如一油性佐劑疫苗。我們以符合如下化學式的團聯共聚物設計了不同型態的乳狀液製劑配方：
(A)p -(B)q -(C)r
其中：p 、q 和r 皆為整數，而且：如果p 為0，則A必須不為羥基或反應官能基，而團聯共聚物為一兩團聯共聚物，其(B)q 為一個親水基而(C)r 為一個疏水基；B和C各為重覆單元；然而如果p 大於1，則該團聯共聚物為三團聯共聚物，其中(B)q 為一個親水基且(A)p 和(C)r 各為疏水基；疏水基(A)p 和(C)r 各為單質聚合物或異質聚合物；A、B和C各為重覆單元；重覆的A和C可以是相同或相異的單元。
其HLB值如果夠高，則團聯共聚物可穩定結合一介於油相和一個水相的界面，並促使油相可分散於水相中，而形成一個穩定的水包油乳狀液。特別是將輔以例如ISA51佐劑的油相疫苗、一油包水乳狀液，重新分散於磷酸鹽緩衝液中，以形成一水包油-油包水複合相乳狀液。
於本發明之一項具體態樣，q 為一個整數，而親水的(B)q 分子量約為550至10,000道爾頓，最好是介於2,000至8,000道爾頓，則q /(p +r )的比例夠高，親水的(B)q 即可占聚合物(A)p -(B)q -(C)r 主鏈百分之50至95的比重，而使團聯共聚物的HLB值介於10至19之間。最好親水的(B)q 能在主要的鏈型聚合物中占百分之70至95的比重，則HLB值可達14至19。
而q 和p +r 之間的比例，對於兩性大分子的HLB值十分重要。如果q /(p +r )不夠高，那麼大分子便無法溶解於水中。表A及表B列出了團聯共聚物的摩爾比、q /(p +r )及其HLB值(請見Huang et al.(2009)“Development of Multi-Phase Emulsions Based on Bioresorbable Polymers and Oily Adjuvant”Pharmaceutical Research 26(8):1856-1862；Huang et al.,(2004)Degradation and cell culture studies on block copolymers prepared by ring opening polymerization of ε-caprolactone in the presence of poly(ethylene glycol).J Biomed Mater Res 69A:417-427，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。在一個極端的例子中，一團聯共聚物的HLB值為20，主要的鏈型聚合物只有一個親水基，則共聚物並不具備兩性分子特性(請見Siao et al.,(2009)“Characterization and Emulsifying Properties of Block Copolymers Prepared from Lactic Acid and Poly(ethylene glycol)”Journal of Applied Polymer Science 114:509-516，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。
該油脂必須是無毒的、可代謝的、生理上可接受的，並且在儲存於4℃的狀態下能形成液態乳狀液。油脂係選自低毒性的礦物油、植物或動物油。該礦物油可以是直鏈礦物油，如Markol(弗氏佐劑)或Drakeol(ISA 51)。合成之碳氫化合物包括聚異丁烯和聚異戊二烯。合適的植物油則包括具生物可降解性和免疫能力的油酸型態不飽和油脂，例如花生油、橄欖油、芝麻油、大豆油、玉米油和棕櫚油等。而合適的動物油則需要達到同樣的免疫耐受性標準，例如鯊烷和鯊烯(、AS03、ISA 720、TiterMax)。
團聯共聚物(A)p 和(C)r 為疏水的線性聚酯基團，如脂肪族聚酯。脂肪族聚酯可由以下方式獲得：a)由羥基酸之自聚縮合反應而成(例如均聚物)，或由不同羥基酸之聚縮合反應形成(例如異聚物)；b)由內酯進行開環聚合反應；c)由二鹽基酸和二醇進行聚縮合反應。
羥基酸單體可選自乳酸、乙醇酸、6-羥基己酸、單酯蘋果酸，例如烷基或芳烷基單酯，或由蘋果酸和一個羥基化活性化合物合成的單酯，特別是一種疏水性的活性化合物；乳酸交酯(右旋-乳酸交酯、左旋-乳酸交酯、消旋-乳酸交酯和內消旋-乳酸交酯)、乙交酯、ε-己內酯和1,4-二氧雜環己-2-酮等。而疏水團聯共聚物(A)p 和(C)r 可以是由不同單酯經聚合反應形成的共聚物。
(A)p 和(C)r 鏈型聚合物的最佳長度可以被檢測。將共聚物加入含有不溶於水的二苯基己三烯螢光染色劑之磷酸鹽緩衝液(PBS)中，染色劑會溶解於聚合膠體粒子或聚集的親油核中。經超音波震盪和離心分離，本研究觀測到染料的紫外吸收值(356奈米波長處)顯著增強，顯示膠體粒子已形成。
本發明的聚合乳化劑展示其有別於其他乳化劑的特徵，即具有生物可降解和生物可吸收性。針對這些共聚物的降解研究顯示，聚合物當中的聚酯團聯部分(A)p 和(C)r 可經由水解被降解。其最終產物為羥基酸(或二酸及二醇)，具生物可吸收性。接下來的水解作用將釋放出聚合物當中親水的聚醚團聯(B)q ，即位於共聚物中間的基團。該相對低分子量(低於10,000)之聚合物具生物可吸收性，且可能可以被排出腎臟外。
製備水包油-油包水乳狀液需具備兩個重要因素：一含兩個步驟的準備過程和一個HLB值居中的乳化劑。Novartis公司生產的59乳化劑型佐劑(一種水包油次微粒乳狀液)，含有4.3%的鯊烯、0.5%的80(=15)和0.5%的85(= 1.8)，製備時使用單一步驟生產過程，以內壓為12,000psi的微粒流體化處理器處理過後，再以0.22-μm的濾膜過濾，以獲取微小、穩定的水包油次微粒乳狀液粒子。而GSK公司生產的AS03佐劑，含有2.5%的鯊烯、0.9%的80和2.5%的維生素E製備時需要兩個步驟，乳化保存液包括鯊烯、80和維生素B，注射前將其與大量抗原均勻混合，以形成一液狀水包油乳狀液。但其仍缺少一個HLB值居中的乳化系統。
在另一方面，本發明係關於一種製備複合相水包油-油包水乳狀液之方法，其可於複合相乳狀液中包埋以及/或包覆一抗原以及/或者一生物活性物質。該製備方法包括一均質(又可稱為乳化)步驟和一稀釋(或可稱為分散)步驟。在均質步驟中，一預先乳化的保存液包括一油脂和乳化劑，而所合成的團聯共聚物係做為親水性乳化劑，用以穩定結合油-水界面，而親脂性乳化劑則用來穩定結合水-油界面，以形成穩定且具等向性的水包油-油包水乳狀液。該水包油-油包水複合相乳狀液包括一乳化系統，而該系統具有其HLB值居中的合成團聯共聚物。該油滴可分散於一連續水相中，而其油-水界面係由團聯共聚物所穩定結合(HLB>>10)。此外，核中的油脂則包埋一水相，而被包埋的水-油界面係由親脂性乳化劑所穩定結合(HLB<<10)。
在稀釋(或分散)步驟中，上述預先乳化的保存液需經稀釋，即重新分散至水溶液中。該水溶液可以是一種單純的培養液，如PBS；或是包括抗原或生物活性物質，如胜肽、抗癌藥劑、荷爾蒙的培養液，或如包括抗生素或抗寄生蟲藥之生物活性劑的培養液。該抗原或生物活性物質可藉由溶解於油相或水相中而與複合相乳狀液結合。水溶性生物活性物質可溶解於水包油-油包水乳狀液的內水相及/或外水相當中。對於控制釋放製劑配方，在內水相中溶解和包覆一個抗原可達到保護抗原的效果。相對地，在外水相中溶解和包覆一抗原則有助於抗原的表達。
實施例
無意於限制本發明之範圍，以下將呈現根據本發明各種實施例之例舉性儀器、裝置、方法和其相關結果。應注意，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不以任何方式限制本發明的範圍。此外，在本文中所提出和披露的某些理論，無論對錯與否，只要該創作是根據本發明所實施，不需考慮任何特定的理論或行動計畫，其都應被限制在本發明的範圍之內。
實施例1
本實施例說明加入親水性聚合乳化劑於抗原溶液，可改變以ISA51做為佐劑之疫苗的親水性；該聚合物包括聚乙二醇聚乳酸交酯團聯共聚物(PEG-b -PLA，聚(乙二醇)-團聯 -聚乳酸交酯)、聚乙二醇聚ε-己內酯團聯共聚物(PEG-b -PCL，聚(乙二醇)-團聯 -聚(ε-己內酯))，及聚乙二醇聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物(PEG-b -PLACL，聚(乙二醇)-團聯 -聚(乳酸交酯-共-ε-己內酯))。選擇這些兩性團聯共聚物主要是因為其具備生物適合性及生物可吸收性；此外，這些乳狀液相關物理化學特性，可通過穩定度、油滴測試、粒徑分佈和卵白蛋白(OVA)體外釋放測試。此外，在OVA免疫評估實驗當中，於小鼠體內注射OVA抗原時佐以PEG-b -PLACL所穩定的ISA51製劑配方，已發現相較於無配方之OVA或傳統上輔以ISA51油性佐劑配方，該免疫小鼠被誘發的抗體反應優於上述兩者(Huang et al.(2009)“Development of Multi-Phase Emulsions Based on Bioresorbable Polymers and Oily Adjuvant”Pharmaceutical Research 26(8):1856-1862，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。
材料與方法 共聚物之合成與特性
2-乙基己酸亞錫(辛酸亞錫，SnOct2 )購自Sigma公司(聖路易市，密蘇里州,USA)。消旋-乳酸交酯(乳酸的一環狀二酯)購自Aldrich(Seelze,德國)並由乙酸乙酯使其再結晶。ε-己內酯亦購自Aldrich。聚乙二醇單甲基醚(MePEG5000 )購自Fluka(Buchs,瑞士)。所有的溶劑均符合分析等級。
PEG-b -PLACL係由乳酸交酯和ε-己內酯進行開環聚合反應，且以辛酸亞錫為催化劑、聚乙二醇單甲基醚為起始劑合成而來。其過程簡述如下，將預先決定好數量的聚乙二醇單甲基醚(2.1g)、乳酸交酯(0.58g)和ε-己內酯(0.47g)置於乾燥的圓底瓶內，並加入適量辛酸亞錫(30mg)於乾燥的甲苯(10mL)。聚合反應控制在140℃，並回流加熱24小時。再加入大量乙醇使聚合物進行沉澱作用，洗去未反應物。用同樣的方法以重量比為2/1的聚乙二醇單甲基醚/乳酸交酯，或聚乙二醇單甲基醚/ε-己內酯合成PEG-b -PLA和PEG-b -PCL。
然後以質子核磁共振光譜儀(1 H-NMR)和凝膠層析法(GPC)分析合成後的聚合物。1 H-NMR光譜圖由Varian公司的VXR 300MHz光譜儀(Varian,Palo Alto,California,USA)以含重氫的氯仿在室溫下做為溶劑進行分析記錄。GPC的裝置包括一個Waters 510高效液相層析儀幫浦、一個Waters 410微差折射率測定器、一個PLgel mixed-C 5μm 100管柱(7.5 x 300mm)串聯一個PLgel 3μm 100管柱(7.5 x 300mm)，並以四氫呋喃(THF)做為移動相，流速為每分鐘0.8mL。該數據以Polysciences出產的聚苯乙烯標準品進行分析。
使用共聚物穩定化之乳狀液
抗原溶液的製備，選擇以特定濃度的卵白蛋白(OVA,Grade V,Sigma,St. Louis,Missouri,USA)稀釋於磷酸鹽緩衝液中。將一個含有120mg聚合物和0.8mL的抗原水溶液，以及1.1mL的ISA51(ISA 51 F VG,SEPPIC,巴黎，法國)油性溶液，用PT 3100均質機以6000rpm均質5分鐘進行乳化作用。另外製備一個不含聚合物的PBS/ISA51乳狀液，其成份與方法為0.9mL的抗原溶液和1.1mL的ISA51，以8000rpm均質10分鐘。這些乳化製劑配方將做為物理化學特性測試之保存液，以進行穩定度、油滴測試、粒徑分佈和OVA體外釋放實驗。
穩定度測試分別將樣品存放於4℃和37℃的條件下，並在預先決定的時間點觀察其外觀。油滴測試是取一滴乳狀液(20μL)滴入燒杯內的水溶液中(200mL)進行測試。粒徑分佈則是以Brookhaven 90plus雷射粒徑儀(Brookhaven Instruments Limited,New York,USA)檢測。體外釋放實驗則採用反向透析管方法測試。將含OVA的製劑配方(每0.3mL含3mg)置入透析室中(孔徑0.2μm)，將該裝置浸入一內含2mL PBS的50mL離心管中，保持37℃。再於不同的時間點上，從透析室外的溶液抽吸100μL的樣品並回補PBS緩衝液。以蛋白質濃度分析(BCA)法，規律地監測卵白蛋白釋放情形(BCATM 蛋白分析套組,Pierce,Rockford,IL,USA)。
免疫實驗與ELISA酵素免疫分析法
在實驗開始進行之前，於國家實驗動物繁殖及研究中心(Taipei,Taiwan)取得五週齡的雌性近交系小鼠(BALB/c)，並先讓小鼠適應國家衛生研究院(NHRI,苗栗,台灣)實驗動物中心的環境。所有動物實驗之方法均獲得國家衛生研究院實驗動物中心之核可。首先以27G x 1/2”的注射針筒於小鼠皮下(s.c.;100μL)注射第一劑OVA無佐劑疫苗、或佐以PEG-b -PLACL/ISA51、或PBS/ISA51，然後在第2週時分別追加第2劑同成分的疫苗。為提升PEG-b -PLACL/ISA51的流動性，注射前先將100μL的乳狀保存液(見前材料與方法：穩定結合共聚物之乳狀液 )加入900μL的PBS當中，製成一只含5%油脂的PEG-b -PLACL/ISA51/PBS乳狀液。
於小鼠尾巴側邊靜脈取血，將收集到的血清存於零下30℃，進行抗體反應。接下來以酵素免疫分析法(ELISA)檢測血清中的OVA特異性抗體。簡要說明如下，取100μL的OVA(10μg/mL)和0.05M的碳酸鹽緩衝液(PH 9.6)置入96孔微量盤中。以4℃定溫培養一夜後，用含有0.05%20(Sigma,聖路易市,USA)的PBS清洗孔盤兩次，再加入含5%脫脂牛奶的PBS，以室溫放置2小時。再將從免疫動物身上取得的稀釋血清(起始稀釋率為1:50，然後以3倍連續稀釋)置入孔盤中，以室溫放置2小時。然後加入山羊抗鼠IgG抗體-HRP結合體(ICN,Cappel,Aurora,俄亥俄州,USA)，以含有四甲基聯苯胺(TMBTM ,Sure Blue,KPL,MD,USA)的培養液開始進行分析，再以2N硫酸中止反應。用ELISA酵素免疫分析儀讀取450nm波長處(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)。以最後稀釋溶液的倒數為基準，其效價為免疫前血清的2倍吸光率。測量同型抗體時，加入兔抗鼠IgG1抗體-HRP結合體(,CA,USA)，或兔抗鼠IgG2a抗體-HRP結合體(,CA,USA)的適度(1:2,000)稀釋液100μL。統計顯著性(p<0.005)由Student氏雙側t-檢定測量對數轉對值。
結果與討論 共聚物的設計與特性
AB-型態兩團聯共聚物含有一個聚醚團聯共聚物(PEG)和一個聚酯團聯共聚物，是由乳酸交酯及/或ε-己內酯以聚乙二醇單甲基醚做為起始劑、辛酸亞錫做為催化劑，形成開環聚合反應合成而來。表1概括表示三個團聯共聚物之分子特徵。在本研究中，聚乙二醇單甲基醚(MePEG)的分子量為5,000，其初始親水/親脂比例為2/1，是從富含聚乙二醇(PEG)降解產品中所選出既有聚合物高親水性，又具備生物可吸收性的折衷選擇。事實上，PEG為一水溶性共聚物，特別是低分子量(<10,000道爾頓)的PEG能經由過濾被排出腎臟外。親脂性團聯共聚物係由美國FDA認可的脂肪族聚酯-PLA和PCL。其具備顯著的降解特性，而且可在生物體內再度被吸收。而PLA所擁有的可變式鏈型立體規則性可用來調節其降解率。此外，聚ε-己內酯(PCL)降解產物的酸度係數相對高於聚乳酸交酯乙交酯之產物(在24℃狀態下，ε-羥基己酸為4.8、乳酸和乙醇酸則為3.8)，因此在長時間控制遞送過程中，PCL可以較好地維持蛋白質分子的完整性。而親脂端選用聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物(PLACL)則具快速降解性；此外由於其所具備的無結晶特性，使其對聚合物基質和油性溶液有很好的親和力。而做為催化劑的辛酸亞錫在生物醫學和治療應用方面均已獲得美國FDA的認可。
乳醯、己醯基和氧乙烯單元，或稱[LA]/[CL]/[OE]的摩爾比係由質子核磁共振光譜儀測得的質子共振積分；測得的質子信號分別為PLA共聚物5.2ppm、PCL共聚物4.1ppm、PEG共聚物3.6ppm。數量平均分子量係依如下方程式計算：Mn=MnPEG +MnPLA/CL =5000+72 x 5000/44 x[LA]/[OE]+114 x 5000/44x[CL]/[OE]，OE、LA和CL的分子量分別為44、72和114。而非離子型共聚物PEG-b -PLA、PEG-b -PCL和PEG-b -PLACL的親水親脂平衡(HLB)值則以Griffin氏提出的方程式計算：
WPEG ：W共聚物 為聚合物主鏈中親水端的比重，係得自MnPEG/ Mn共聚物 。最親脂性的共聚物其HLB值接近0，而最親水的共聚物其HLB值約為20。根據該方程式計算，三個共聚物皆得出高HLB值(HLBPEG- b -PLA 為14.4、HLBPEG- b -PCL 為14.0、HLBPEG- b -PLACL 為15.0)，亦即共聚物皆具高親水性。
由凝膠層析法(GPC)檢測出PEG-b -PLA、PEG-b -PCL和PEG-b -PLACL具單一模式及狹小的分子量分佈(表1)，顯示其不具低分子量產物。而由GPC計算的數量平均分子量高於以1 H-NMR計算之數目。可能是因為相較於聚苯乙烯標準品，親水的PEG以及/或者親脂性的PLA、PCL和PLACL團聯共聚物之水動力體積有所變化。
使用共聚物穩定之乳狀液的製備
為了提升輔以乳狀液佐劑的疫苗力價，本實驗利用PEG-b -PLA、PEG-b -PCL和PEG-b -PLACL等乳化劑來穩定介於油性佐劑ISA51和抗原溶液的界面。共聚物溶解於抗原溶液的水相組成，與ISA51的油相以均質機進行乳化作用。乳化後的製劑配方從上到下皆呈白色並具備等向性。
穩定度測試分別於4℃和37℃的狀態下進行，用來模擬平常儲存和注射後的條件。所有乳狀液在4℃下保持穩定，且可維持數星期無相分離。而PEG-b -PLA/ISA51和PEG-b -PCL/ISA51在存放兩週後，發生10%的水解離；但除此之外，沒有再發生其他水解離情況。而同型的乳狀液可藉由振盪混合進行重新成形。此外，在同樣的儲存條件下放置一個月後，PBS/ISA51乳狀液約有10%的表層油脂發生解離。PEG-b -PLACL/ISA51乳狀液至少可放置六個月，沒有發生相分離。而在37℃的條件下觀察60天後，PEG-b -PCL/ISA51和PEG-b -PLACL/ISA5乳狀液狀態穩定，無相分離發生。而PBS/ISA51乳狀液在3天後，大約有10%的表層油脂發生解離(圖1a)。一週後，乳狀液中30%的表層油脂和底部的水溶液明層(30%)發生解離。相分離發生在第60天，顯示乳狀液的結構已經打開。PEG-b -PLA/ISA51乳狀液在存放長時間後其外觀上的改變與PBS/ISA51類似。
乳狀液的親水性則分別以油滴測試和雷射光散射分析測試(圖2a)。在圖2a中，一乳化的PBS/ISA51油滴(如圖2a插圖箭號所示)持續漂浮在水溶液表面上達24小時。而在雷射光散射技術下並無法檢測到其粒子粒徑。然而，當乳狀液重新分散於油性溶液ISA51時，在光學顯微鏡底下觀測到粒徑分佈1μm的均勻粒子分佈。另一方面，每一個使用共聚物穩定的ISA51油滴(如圖2b插圖箭號所示)在水相中只能停留數秒，便擴散於水溶液中，表示其所具備的高親水性(圖2b)。而從雷射光散射分析結果顯示，PEG-b -PLA、PEG-b -PCL和PEG-b -PLACL皆為適合穩定油性ISA51與水溶液界面的乳化劑，並產出分佈狹小的奈米微粒(圖2d與表1)。典型的例子當中，可觀察到兩種不同尺寸的粒子，分別為500nm和100nm(見圖2d)。該粒子模擬天然抗原尺寸，使其更有利於抗原表現細胞群(APCs)的吸收，有助於誘導更有效的免疫反應。而以聚乙二醇單甲基醚進行均質作用後並沒有改善ISA51乳狀液的親水性。其油滴漂浮在表層而沒有擴散至水溶液中，顯示出在聚合物主鏈當中只有聚乙二醇(PEG)承載短親脂性單元具備乳化特性(見圖2c)。
在親水性方面，相較於無佐劑的卵白蛋白(OVA)或輔以PBS/ISA51佐劑的OVA抗原，利用PEG-b -PLA、PEG-b -PCL或PEG-b -PLACL共聚物所穩定的ISA51乳狀液對於親水性的OVA蛋白呈現不同的控制釋放作用，如圖1b所示。無佐劑配方的OVA在一開始的30小時內觀察到快速的釋放現象，有50%以上的OVA被釋放到外面的PBS培養液中。而輔以PEG-b -PLA的ISA51乳狀液於同樣的時間點當中，觀察到上述類似狀況，釋放了不到30%的OVA。然後釋放速率持續增加，直到透析裝置內外的蛋白質釋放濃度達到平衡。相對地，油性的PBS/ISA51乳狀液對OVA表現出良好的包覆效果，因此親水的OVA蛋白可緩慢地釋放超過500小時。在複合的控制釋放機制下，使用PEG-b -PCL-或PEG-b -PLACL穩定的ISA51乳狀液所包覆的親水性生物活性物質(或抗原)，將會從核心油脂向表層被釋放出來，但同時也會發生較小程度的降解，以至乳狀液結構被打開。
如圖2a所示，油性佐劑ISA51只包括具低HLB值的乳化劑(單油酸甘露聚糖甘202的HLB值只有2.6，其疏水端204朝油相，而親水端206則朝著水向)。經親水性與體外釋放測試顯示，PBS/ISA51乳化劑具一連續油相，其分散相則為水溶液(如圖2a)。另一方面，添加共聚物穩定的ISA51系統包括親水共聚物208和單油酸甘露聚糖甘202兩個界面，而形成一種水包油-油包水(W/O/W)複合相乳狀液(如圖2b)。在這樣的情況下，油滴可分散於連續水相(即由聚合物穩定的乳化劑208)當中，而核心油脂亦包覆了一水相(由單油酸甘露聚糖甘202所穩定住，見圖2b)。經聚合物穩定之乳化粒子，在特定及長時間情況下，可做為抗原與抗原表現細胞群之間的傳遞或體和媒介。
有關乳狀液的穩定度，疫苗乳化製劑配方必須在體外和注射後的儲存期間均維持其穩定度。一般普遍認為，乳狀液油滴若具微小粒徑與均勻分佈性，較具穩定度。然而這些參數顯著受到乳化過程和界面活性劑系統最佳化的影響。因此，在含有鯊烯和單油酸甘露聚糖甘的油性佐劑ISA 720當中，加入諸如甘胺酸或二甘胺酸等輔劑，可在平日儲存時和注射後等條件下，提升其穩定結合乳狀液之能力。另一方面，有兩項具人體疫苗運用潛力的乳化劑型佐劑，分別為(出自Novartis公司)和AS03(出自GlaxoSmithKline)。係由親水的80乳化劑和一親油的85(山梨糖醇酐三油酸酯)合成產生，而AS03則合成自80和維生素E。在目前的研究中顯示，採用PEG-b -PLA所穩定的ISA51乳狀液可保持或降低油性佐劑ISA51內部的穩定度。然而經均化作用的PEG-b -PLC-和PEG-b -PLACL-水溶液，及含油相的單油酸甘露聚糖甘(如ISA51)，無論在平常的儲存或注射後的保存條件下，均極具穩定結合乳化粒子之潛力。
小鼠免疫實驗
為了評估使用共聚物穩定之乳狀液於疫苗佐劑實際應用的潛力，本實施例於近交系小鼠皮下接種OVA抗原，同時分別以無配方、或輔以PBS/ISA51、或輔以PEG-b -PLACL/ISA51/PBS等三種製劑配方，進行抗體測試實驗。最後一項製劑配方中油性佐劑ISA51只占5%的比例(詳見材料與方法：免疫作用與ELISA酵素免疫分析法 )。
如圖3所示，相較於只有OVA抗原的無佐劑配方，輔以PBS/ISA51-或PEG-b -PLACL/ISA51/PBS-佐劑之血清，其IgG、IgG1和IgG2a抗體效價皆有顯著提升。而且輔以PEG-b -PLACL/ISA51/PBS-佐劑和PBS/ISA51-製劑配方的OVA皆可誘發出同樣程度之抗體效價；即PEG-b -PLACL/ISA51/PBS亦可達到PBS/ISA51之佐劑效果。本研究嘗試研究含有聚合物之水溶液對於OVA抗原免疫作用的增強效果，結果顯示該溶液無法達到佐劑效果，經誘發的OVA抗原特異性抗體與無配方者程度相同(該數據未顯示於本研究中)。此外本實驗亦觀察到在小鼠皮下接種五週後，PEG-b -PLACL/ISA51/PBS乳狀液即被生物體所吸收；而PBS/ISA51乳狀液仍滯留於原注射部位。除此之外，在實驗動物身上並沒有出現副作用。
通常疫苗抗原在注射後可被抗原表現細胞群(APCs)直接吸收，或與B細胞表面的抗體結合。但只有被APCs捉住的抗原才能發生一系列連鎖免疫反應。該途徑與抗原的特徵有緊密關聯，但亦可經由佐劑影響其作用。然而雖然乳化劑型佐劑已於數十年來受到廣泛運用，但因為對於其膠體分散複雜性、注射後乳狀液穩定度和免疫反應機制等作用仍缺乏了解，因此佐劑是否具有免疫抗原提升效果至今仍未有定論。在本實施例中，油包水乳狀液(例如PBS/ISA51)的佐劑效果，推論在於經乳狀液的儲存作用，使其可以長時間逐漸釋放抗原。而水包油-油包水乳狀液(例如PEG-b -PLACL/ISA51/PBS)，即使只含5%的油性佐劑ISA51，其所誘發的抗體反應，顯著高於無配方的OVA抗原。推論水包油-油包水乳狀液不僅在油性佐劑ISA51中可具儲存效果，亦能提升抗原表現。此外，經改良之水包油-油包水乳狀液有助於提高其注射能力；相對於由同一種油脂製備而成的油包水型態疫苗，基本上還能減少注射後發生的局部副作用。
兩性團聯共聚物含有重量百分濃度達70wt%的親水性共聚物PEG，以及30wt%的親油性共聚物PLA、PCL或PLACL；共聚物係由MePEG5000 做為起始劑，並以乳酸交酯和/或ε-己內酯團經開環聚合反應合成。該共聚物皆可做為親水乳化劑以改變疫苗佐劑ISA51的親水性，因此在注射前，可將包覆抗原之乳化劑重新分散於PBS溶液中，而得到一個穩定且可以進行注射的水包油-油包水乳狀液奈米粒子。免疫分析結果顯示，即使PEG-b -PLACL/ISA51/PBS製劑配方只有5%的油脂，仍保有ISA51所具備的佐劑效用。這些結果有助於單劑預防藥物之研究與治療用疫苗的發展，以及如改良肌肉注射、經皮膚或黏膜給藥等免疫途徑。
實施例2
本實施例闡述以PEG和PLA合成的兩團聯與三團聯共聚物及其特性。兩團聯共聚物(PLA-PEG)和三團聯共聚物(PLA-PEG-PLA)，係由乳酸水溶液與甲氧基或二羥基聚乙二醇直接進行聚縮合反應形成。不同於以往文獻所闡述，過去製備團聯共聚物時會添加含重金屬且對細胞有害的催化劑，本研究進行的聚合反應無添加任何催化劑，因此增加了最終合成產物的生物適合性。合成的共聚物以MALDI-TOFMS、GPC和1 HNMR等方法進行分析。相異於一般聚合物中的膠體粒子或奈米球體，提供基質或媒介以包覆生物活性劑；本研究試圖探究兩性分子聚合物是否能(像界面活性劑)扮演一輔助角色，穩定結合油/水界面，使候選生物活性物質等能附著於其表面，或被包覆於核心油脂內。以含有聚合物之水溶液和油性鯊烯進行均質作用，研究其乳化特性。進行穩定度、粒徑分佈、卵白蛋白(OVA)體外釋放實驗，以分析乳狀液。為了使其具備生物適合性，因此選擇毒性低且已在臨床試驗上被廣於應用的鯊烯做為核心油脂(Siao et al.,(2009)“Characterization and Emulsifying Properties of Block Copolymers Prepared from Lactic Acid and Poly(ethylene glycol)”Journal of Applied Polymer Science 114:509-516，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。
共聚物的合成
該乳酸係購自TEDIA公司(Fairfield,OH)，為一85至90%水溶液。聚乙二醇2000甲基醚(MePEG2000 )和聚乙二醇2000(diOHPEG2000 )係購自Fluka(Buchs,Switzerland)，這些材料在使用時並未另加純化，所有的溶劑均符合分析等級。
聚乳酸聚乙二醇兩團聯共聚物係以乳酸與MePEG2000 進行聚縮合反應所合成，無添加催化劑。其過程簡述如下，將10g的MePEG2000 和10g的乳酸水溶液置於一圓底瓶中。本研究所進行的聚合反應係以蒸餾法將乳酸水溶液在140℃下作用24小時，即以一減壓濃縮機R-210(Buchi Labortechnik AG,瑞士)和真空幫浦V-700(Buchi Labortechnik AG)所組成的系統進行作用，該產物以大量的乙醇進行沉澱還原。然後以丙酮為溶解劑、乙醇為非溶劑，連續溶解/沉澱循環進行兩次純化，以消除低分子量副產物。所得到的產物其產率約達25wt%。PLA-PEG-PLA三團聯共聚物可依相同的程序，以diOH-PEG2000 代替MePEG2000 進行合成。將該產物置於冷乙醇(＜10℃)當中沉澱過濾，而其產率約達30wt%。
測量
MALDI-TOG MS質譜圖係由公司的MALDI micro MXTM 質譜儀(Milford,MA)搭配氮氣雷射(337nm)進行記錄。所有的光譜記錄在12kV加速電壓下的反射模式中完成，照射目標製備如下，以0.1%的三氟醋酸(Riedel-de,Seelze,Germany)加入乙腈/水混合劑，比例為50/50(v/v)；然後加入α-氫基-4-羥基桂皮酸(Sigma,Steinheim,德國)做為基質，再以三氟醋酸鈉(Na-TFA,Fluka)做為摻雜劑。將樣品溶液點在MALDI樣品盤中，風乾後進行分析。而凝膠層析法(GPC)的操作裝置包括一個單相幫浦(高效液相層析儀(HLPC)Model 510)、一個折射檢測器(410微差折射率測定儀)和二個串聯在一起的管柱，其中一個是PLgel 5-μm mixed-C分離管柱(孔徑100-,7.5×300mm,Polymer Laboratories,Ltd.,Shropshire,英國)，另一個是PLgel 3-μm分離管柱(100-pore size,7.5×300mm)。以四氫呋喃(THF)做為移動相，流速為每分鐘0.8mL。該數據以Polysciences出產的聚苯乙烯標準品進行分析(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)。而質子核磁共振光譜的記錄是在室溫下透過Varian VXR 300-MHz光譜儀(Varian,Palo Alto)，以二甲基亞風(Aldrich,Steinheim,德國)和四甲基矽烷分別做為溶劑及化學位移的參考值。
穩定結合共聚物之乳狀液
將含有共聚物之水溶液[以120mg的聚合物溶解於0.8mL的磷酸緩衝溶液(PBS)中]和1.1mL的鯊烯(Sigma,Steinheim,德國)，用PT3100均質機(Kinematica AG,Lucerne,瑞士)以6000rpm振盪5分鐘。該乳化製劑將做為物理化學特性實驗之保存液。
為模擬日常與投藥後的儲存條件，將乳狀液分別置於4℃和37℃的條件下進行穩定度測試，並觀察其外觀。為了研究乳狀液的粒徑分佈，將預先乳化的保存液重新分散於PBS溶液中，再以Brookhaven 90 Plus雷射粒徑儀(Brookhaven Instruments Limited,紐約)進行雷射光散射分析測量。體外釋放實驗則以反向透析管方法測試。將含有OVA(該蛋白質係取自雞卵蛋白，Grade V,Sigma；每0.3mL含3mg)的配方置入透析室中(孔徑0.2μm,Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)，再將該裝備浸入一內含2mL PBS的50mL離心管中，保持37℃。在不同的時間間隔中，從透析室外的培養液抽吸100μL的樣品並回補PBS緩衝液。以蛋白質濃度分析(BCA)法規律地監測卵白蛋白的釋放情形(BCATM 蛋白質分析套組,Pierce,Rockford,IL)。
結果與討論
圖4表示團聯共聚物的合成與化學結構。PLA-PEG兩團聯共聚物係合成自乳酸與單甲基聚乙二醇的聚縮合反應，形成一個由親水基PEG和親脂基PLA所構成的共聚物。而三團聯共聚物PLA-PEG-PLA係合成自乳酸與兩羥基聚乙二醇的聚合反應。通常PLA聚合物是由乳酸交酯(乳酸的交酯)開環或乳酸以縮合聚合反應所合成。後者為一低成本且直接的PLA聚合物合成方式，其途徑會產生含低分子量寡聚體。合成共聚物之分子特性綜述於表2。
以MALDI-TOFMS檢測之PLA/PEG團聯共聚物特性
以質譜儀測量合成聚合物的分子量(MW)。透過該技術可研究共聚物的分子結構及化學成分。圖5a-5b分別表示PLA-PEG及MePEG2000 的MALDI-TOF MS光譜。圖5a顯示MePEG2000 的光譜，其44個質量單元表現出相對應的波峰，並與PEG單體的分子量一致(氧乙烯(OE)單元=44.03g/mol)。次要的波峰則代表元素的同位素。MePEG2000 的分子量涵蓋1200-2800g/mol、Mn =1970，Mw /Mn =1.05。乳酸水溶液與MePEG2000 進行縮合反應後(140℃，24小時，無催化劑)；其聚合物的分子量分佈變為1600-3200g/mol、Mn =2370及Mw /Mn =1.03(圖5b)，顯示乳醯單體與高分子起始劑MePEG之結合。在PLA-PEG的MALDI-TOF MS光譜上並未發現MePEG的信號特徵，表示沒有接上PLA的MePEG2000 已在純化時被移除。而在MePEG2000 和PLA-PEG的光譜上，氧乙烯(OE)和乳醯(LA)的數量只能藉由主要波峰的分子量檢測(x和y，個別地)。質譜中的每個主要波峰對應一聚合物(分子結構表示於圖4中)，該聚合物包含氧乙烯單元和乳醯單元(MW=72.06)，末端基團(一個甲基和一個羥基，MW=32.03)和鈉離子(MW=22.99，基於Na-TFA)。
MWMePEG =x (44.03)+32.03+22.99
MWPLA-PEG =x (44.03)+y (72.06)+32.03+22.99
例如，在PLA-PEG光譜中介於2030到2100m/z間的五個主要聚合物(圖5b)分別表示如下：
MWPLA-PEG=2032,x=40,y=3
MWPLA-PEG=2048,x=42,y=2
MWPLA-PEG=2064,x=44,y=1
MWPLA-PEG=2076,x=41,y=3
MWPLA-PEG=2092,x=43,y=2
為證實共聚物的分子量和分子結構相互關聯之推測，相同的方法也用在三團聯共聚物PLA-PEG-PLA的分析上。質譜上的每個主要波峰，如圖6所示，相對應於一種共聚物，其中含氧乙烯單元、乳醯單元、末端基團的一個氫和一個羥基與鈉離子：
MWdiOH-PEG2000 =x (44.03)+18.02+22.99
MWPLA-PEG-PLA =x (44.03)+y (72.06)+18.02+22.99
例如，在PLA-PEG-PLA的光譜中介於2010到2080m/z間的四個主要聚合物(圖6b)，分別表示如下：
MWPLA-PEG-PLA =2018,x =40,y =3
MWPLA-PEG-PLA =2035,x =42,y =2
MWPLA-PEG-PLA =2050,x =44,y =1或x =26,y =12
MWPLA-PEG-PLA =2062,x =41,y =3
MWPLA-PEG-PLA =2078,x =43,y =2或x =25,y =13
透過MALDI光譜計算重覆單元和末端基團的質量後，我們可以區分出兩團聯和三團聯共聚物的分子結構。非離子PLA/PEG兩團聯或三團聯共聚物的HLB值依據Griffin的方程式陳述如下：
HLBPLA/PEG =20 x(WPEG /WPLA/PEG )
WPEG /WPLA/PEG 為聚合物主鍵土親水部分的重量比，得自Mn PEG /Mn PLA/PEG 。最親脂性部分的HLB值趨近於0，而最親水部分則達20。根據此方程式，得到高HLB值(HLBPLA-PEG =16.6和HLBPLA-PEG-PLA =16.4)，表示這兩個共聚物具有高親水性。然而由MePEG2000 及由diOH-PEG2000 所起始的共聚物之間並沒有顯著的差異。
以GPC及 1 H-NMR檢測之分子量
GPC凝膠層析法是一種以分子水動力體積做為基礎的分離技術。以一已知的分子量製作校正曲線，相較後即可計算出樣品的相對分子量。表2表示了以PEG所起始之PEG-PLA團聯共聚物的分子特性。將乳酸鏈加入預聚物PEG後其平均分子量便呈現上升。PLA-PEG和PLA-PEG-PLA的凝膠層析色譜圖顯示單一模式及狹小的分子量分佈，表示其不含殘留的低分子量產物。而從1 H-NMR檢測結果顯示，該低分子量產物為未發生反應的乳酸以及/或者富乳醯的產物。由GPC檢測結果計算出來的數量平均分子量，高於以MALDI-TOF MS和1 H-NMR計算之數目(表2)。可能是因為相較於聚苯乙烯標準品，親水的PEG及/或PLA團聯共聚物之水動力體積有所變化。
乳醯和氧乙烯單元，或[LA]/[OE]的摩爾比，係由質子核磁共振光譜儀測得的質子共振積分；其質子信號分別為PEG共聚物3.6ppm和PLA共聚物1.5ppm。而3.3ppm的波峰則代表甲基群的氫，亦表現在MePEG2000 和PLA-PEG的質子核磁共振光譜上。該共聚物的數量平均分子量(Mn)係依如下方程式計算：
Mn (NMR)=Mn PEG +Mn PLA =2000+72 x 2000/44 x([LA]/[OE])
OE和LA重覆單元的分子量分別為44和72；而PEG的平均分子量為2000，係由廠商提供之數據。
兩性團聯共聚物的乳化特性
為了證明PLA-PEG或PLA-PEG-PLA是否可以做為乳化劑，以含有共聚物之水溶液和鯊烯進行均質作用，形成一具備等向性的乳化製劑配方。將該乳狀液儲存於4℃時，其穩定度可持續數週。兩週後發生5%的水解離，但除此之外沒有再發生其他水解離情況。而同型的乳狀液可藉由振盪混合重新成形。此外，本實驗觀察到以PLA-PEG-和PLA-PEG-PLA-結合的乳狀液存在些微差異。以鯊烯和MePEG2000 或diOH-PEG2000 進行均質作用，無法穩定鯊烯/水界面。其表示即使在聚合物PLA-PEG或PLA-PEG-PLA主鏈當中只有一短小的PLA單元，該團聯共聚物即可表現出兩性分子特性。
以乳狀液粒徑分佈與體外OVA釋放實驗，檢測合成乳狀液的分散特性，並了解共聚物在乳化製程中的情況。將乳狀液重新分散於PBS溶液中，以雷射粒徑儀分析其粒徑分佈。典型的油包水乳狀液油滴會漂浮於水溶液表面上，而其粒徑在雷射光散射技術下無法被偵測。相反地，一個水包油乳狀液油滴在水相中只能停留數秒便擴散至水中。動態的雷射光散射分析顯示，PLA-PEG或PLA-PEG-PLA係為一適於鯊烯/水乳狀液的乳化劑，並能在PBS中產出分佈狹小的奈米粒子。表3表示以PLA-PEG和PLA-PEG-PLA為基礎的鯊烯乳狀液之物理化學特性。圖7表示在不同製劑配方下的OVA逐漸釋放情況。無佐劑配方的OVA在開始觀察的50小時內出現快速釋放現象，有80%以上的OVA被釋放到外面的PBS培養液中。至於PLA-PEG/鯊烯或PLA-PEG-PLA/鯊烯乳狀液的OVA釋放時間較晚，但其蛋白質很快就被釋放出來。從觀測到的外觀顯示，乳狀液保持穩定狀態，惟實驗超過200小時後，置於37℃條件下的瓶底溶液發生5%水解離。界面活性劑和乳化劑一樣，均可藉由HLB值測定其對水相或油相的相對親和力。親脂性乳化劑對油相具高親和力，可形成油包水乳狀液。反之，親水乳化劑則對水相具高親和力，形成水包油乳狀液。而這顯著受到界面活性劑系統與乳化過程最佳化的影響。本實驗的雷射光散射分析和體外釋放實驗結果指出，具高HLB值的共聚物可形成一穩定的水包油乳狀液。此外，以PLA-PEG-和PLA-PEG-PLA-所結合的乳狀液之間並不存在顯著的差異。
用於疫苗或蛋白質遞送系統的可降解性脂肪族聚酯，大多呈現為可被注射之微膠囊或可被植入之系統等形態。但要成為上述系統需經有機溶劑與複雜的製備過程，而且可能在抗原(病毒或蛋白質)被包覆時造成抗原等的變性。該系統還需要具備高分子量(通常>100,000Da)聚合物，需藉嚴謹的聚合反應條件才能形成(極端的溫度、壓力和有毒的催化劑)。在本研究中穩定的鯊烯/水乳狀液，係取自含PEG的PLA寡聚體，該寡聚體做為乳化劑，過程中無添加任何穩定劑。候選的生物活性劑可附著於表面或被包覆於核心油脂內。該乳狀液具高親水性，因此將乳狀液重新分散於PBS時，可獲得奈米微粒。此外，該設計聚合物的製備過程中無添加催化劑。且該乳化製劑配方不含有機溶劑。這些特徵顯示其在生物活性劑的局部傳遞發展，特別是疫苗候選株的傳遞與抗癌治療的應用上，很可能具有其發展潛力。
結論
具高HLB值的PLA/PEG兩團聯和三團聯共聚物，在無催化劑的條件下，由乳酸水溶液和甲氧基PEG或二羥基PEG進行直接聚縮合反應所合成。MALDI-TOF MS的分析結果可供計算重複單元和末端基團的分子量，因而區分出兩團聯和三團聯共聚物的分子結構。以含有聚合物之水溶液和鯊烯進行均質作用，其所合成出來的共聚物可做為一親水乳化劑，以形成穩定的水包油乳化奈米微粒。以PLA-PEG-與PLA-PEG-PLA-穩定結合的乳狀液之物理化學特性，諸如其穩定度、粒徑分佈和乳狀液的型態，只有些微差異。這些製劑配方可望被應用於預防和治療性疫苗候選株與抗癌藥物的遞送系統。
實施例3
本實施例說明以一乳化劑型兩性共聚物組成不同型態的疫苗製劑配方，該共聚物為聚乙二醇聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物(PEG-b-PLACL，聚(乙二醇)-團聯-聚(乳酸交酯-共-ε-己內酯))。該親水團聯為聚乙二醇(PEG)，其具有可利用性、水溶性和高生物合適性。而可降解的脂肪族聚酯，特別是聚乳酸交酯(PLA)和聚ε-己內酯(PCL)已在美國FDA的許可下於醫學與藥物遞送系統中受到廣泛地應用。而其核心油脂鯊烯不同於礦物油，係為天然產物並具可代謝性。在油相中做為輔劑的85，則已獲得人體疫苗應用的許可。PLA所具備的可變式鏈型立體規則性及其物理特性，有助於調整降解率。聚ε-己內酯(PCL)降解產物的酸度係數相對高於聚乳酸交酯乙交酯之產物(在25℃狀態下，ε-羥基己酸為4.8、乳酸和乙醇酸則為3.8)，因此在長時間控制遞送過程中，PCL可以較好地維持蛋白質分子的完整性。而親脂性的聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物(PLACL)則具有快速降解特性；此外由於其所具備的無定形特性，使其對聚合物基質和油性溶液有很好的親和力。此外，乳狀液的許多特性，已通過諸如穩定度、油滴測試、光學顯微鏡觀測和抗原卵白蛋白(OVA)體外釋放實驗等測試。為了解新型乳化製劑配方疫苗的免疫抗原提升效果亦檢測了免疫小鼠的B細胞與T細胞反應((Huang et al.,(2009)“Formulation and Immunological Evaluation of Novel Vaccine Delivery Systems Based on Bioresorbable Poly(ethylene 5 glycol)-block-poly(lactide-co-ε-caprolactone”J Biomed Mater Res Part B:Appl Biomater 90B:832-841，其內容係完整地以引用方式納入本文作為參考)。
材料與方法 共聚物的合成與特性
PEG-b -PLACL係由乳酸交酯(出自Aldrich)和ε-己內酯(出自CL,Aldrich)進行開環聚合反應，以SnOct2 (辛酸亞錫，Sigma)為催化劑，並以MePEG(聚乙二醇5000單甲基醚，Fluka)為起始劑合成而來。其過程簡述如下，將預先決定好數量的聚乙二醇單甲基醚(2.1g)、乳酸交酯(0.58g)和ε-己內酯(0.47g)置於乾燥的圓底瓶內，並加入適量辛酸亞錫(30mg)在乾燥的甲苯(10mL)中。聚合反應控制在140℃，並回流加熱24小時。該產物之產率為75wt%。合成後以質子核磁共振光譜儀(1 H-NMR)和凝膠層析法(GPC)分析聚合物。1 H-NMR光譜圖在室溫下由Varian公司的VXR 300MHz光譜儀(Varian,Palo Alto)以含重氫的氯仿做為溶劑進行分析記錄。乳醯、己醯基和氧乙烯單元，或[LA]/[CL]/[OE]的摩爾比，係由質子核磁共振光譜儀測得的質子共振積分；測得的質子信號分別為PEG共聚物3.6ppm、PLA共聚物5.2ppm及PCL共聚物4.1ppm。而數量平均分子量(Mn)之基礎係為聚乙二醇(PEG)之Mn(Mn=5000道爾頓)並依如下方程式計算：
MnPEG-b-PLACL =5000+72 x 500000/44x[LA]/[OE]+114 x 5000/44 x[CL]/[OE]
OE、LA和CL重覆單元的分子量分別為44、72和114。而非離子型共聚物PEG-b -PLACL的親水親脂平衡(HLB)值則以Griffin氏提出的公式計算：
HLBPEG-b-PLACL =20(WPEG /WPEG-b-PLACL )
WPEG /WPEG-b-PLACL 為聚合物主鏈親水端的比重，係得自MnPEG /MnPEG- b -PLACL 。
在GPC裝置方面，包括一個Waters 510高效液相層析儀幫浦、一個Waters 410微差折射率測定器、一個PLgel mixed-C 5μm 100管柱(7.5 x 300mm)串聯一個PLgel 3μm 100管柱(7.5 x 300mm)，並以四氫呋喃(THF)為移動相，流速為每分鐘0.8mL。該數據以Polysciences生產的聚苯乙烯標準品進行分析。從PEG-b -PLACL和MePEG5000 的GPC色譜圖觀測到單一模式及狹小的分子量分佈(粒徑分佈係數為1.1)，顯示高分子起始劑完整發揮了起始作用。
共聚物PEG-b -PLACL水溶液中的膠體粒子顯示該共聚物具有兩性特徵。經染色劑溶解性實驗與雷射光散射分析即可進一定確認。簡要概述過程如下，將5mg的共聚物加入含不溶於水的二苯己三烯螢光染色劑(DPH,Sigma)PBS緩衝液1mL中，染色劑會溶解於聚合膠體粒子或聚集的親油核中。經超音波震盪和離心分離，我們發現到染料的紫外吸收值(356波長處)顯著增強，顯示了膠體粒子的合成。粒徑分佈實驗係由Brookhaven 90 plus雷射粒徑儀(Brookhaven Instruments Limited)進行檢測。
以共聚物為基礎的乳狀液
將一溶解於抗原溶液(內含OVA的PBS緩衝液0.8mL)的PEG-b -PLACL水溶液(120mg)，及含鯊烯或鯊烯/85混合劑(比例為85/15v/v)之油相1mL，用PT 3100均質機(Kinematica AG,瑞士)以6000rpm振盪5分鐘均勻乳化。此外，一個無界面活性劑、含PBS/鯊烯/85的聚合乳狀液另以8000rpm振盪10分鐘。這些乳化製劑配方將做為物理化學特性測試之保存液，包括穩定度、油滴測試、顯微鏡外觀測試與OVA體外釋放實驗等。穩定度測試將樣品存放於4℃處條件下，並在預先決定的時間點(2週、1個月、3個月、6個月、1年)進行觀測。油滴測試係將一滴乳狀液(20μL)放入燒杯內的水溶液中(200mL)進行測試。顯微鏡外觀測試中，將乳狀液(100μL)重新分散於連續相(900μL)當中，並以Olympus DP70型號的顯微鏡進行觀測。粒徑分佈則是以雷射光散射技術檢測。體外釋放實驗則採反向透析管方法測試。將含OVA的製劑配方(每0.3mL含3mg)置入透析室(孔徑0.2μm)，將該裝置浸入一內含2mL PBS的50mL離心管中，保持37℃。再於不同的時間點上，從透析室外的培養液抽吸100μL的樣品並與100μL的新鮮PBS緩衝液相互置換。然後以蛋白質濃度分析(BCA)法規律地監測OVA的釋放情形(BCATM 蛋白分析套組,Pierce)。
小鼠免疫實驗
在實驗開始進行之前，於國家實驗動物繁殖及研究中心(Taipei,Taiwan)取得五週齡的雌性近交系小鼠(BALB/c)，並先讓小鼠適應國家衛生研究院(NHRI,Miaoli,Taiwan)實驗動物中心的環境。所有動物實驗方法均獲得國家衛生研究院實驗動物中心之核可。於實驗進行中的第0、2、4週，以27G x 1/2”的注射針筒於小鼠皮下(s.c.;100μL)分別注射第一劑0.5μg的OVA無佐劑疫苗、或佐以PEG-b -PLACL/鯊烯製劑配方、或佐以PEG-b -PLACL/鯊烯/85、或磷酸鋁懸浮液(磷酸鋁懸浮液每劑150μg)。為了提升PEG-b -PLACL/鯊烯和PEG-b -PLACL/鯊烯/85製劑配方的流動性，注射前先將100μL的備用乳狀液(見前材料與方法：以共聚物為基礎的乳狀液 )加入900μL的PBS當中，製成一油脂只占5%的製劑配方。以收集到的血清與脾細胞分別檢測其B細胞與T細胞反應。
IgG與同型抗體之免疫性
為了測定B細胞反應，從小鼠尾巴側邊靜脈取血，檢測前先將收集到的血清存於零下30℃。接下來以酵素免疫分析法(ELISA)檢測血清中的OVA特異性抗體。簡要概述如下，取100μL的稀釋OVA(10μg/mL)和0.05M的碳酸鹽緩衝液(Ph 9.6)置入96孔微量盤中。以4℃定溫培養一夜後，用含有0.05%20(Sigma)的PBS清洗孔盤兩次，再加入含5%脫脂牛奶的PBS，以室溫放置2小時。將從免疫動物身上取得的稀釋血清(起始稀釋率為1:50，然後以3倍連續稀釋)置入孔盤中，以室溫放置2小時。然後加入山羊抗鼠IgG抗體-HRP結合體(ICN,Cappel)，以含有四甲基聯苯胺(TMB,Sure BlueTM ,KPL,MD,USA)的培養液開始進行分析，再以2N硫酸中止反應。用ELISA酵素免疫分析儀讀取450nm波長處(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。每個樣品的數據皆使用一曲線擬合計算指數函數，而效價以稀釋溶液之倒數為基準，即免疫前血清2倍吸光率之光學密度函數。測量同型抗體時，加入兔抗鼠IgG1抗體-HRP結合體(,CA)，或兔抗鼠IgG2a抗體-HRP結合體(,CA)的適度(1:2,000)稀釋液100μL。統計顯著性(p<0.005)由Student氏雙側t-檢定測量對數轉對值。
T細胞免疫反應
為測定T細胞反應，於追加疫苗一週後，將小鼠脾細胞以無菌方式移至內含1mL培養液(cRPMI)的低溫微量高速離子機中，該培養液成分有RPMI 1640(SAFC,Kansas)、2mM的右旋-麩醯胺，並補充25Mm的HEPES緩衝液(Gibco,Invitrogen,NY)、0.05mM的2-硫氫乙醇、10%熱去活化胎牛血清(FBS,HyClone,Perbio)和1%抗生素。用注射器和細胞篩子(BD,Biosciences)磨碎脾細胞以取得細胞懸浮液。將細胞懸浮液置入50mL的離心管，以1000rpm離心分離5分鐘。為了移除紅血球，將細胞沉澱物重新懸浮於5mL的ACK lysis緩衝液中，置於室溫1分鐘後，再以20mL的RPMI中止反應，然後離心沉澱5分鐘。以cRPMI清洗細胞沉澱物兩次後，將其重新懸浮於5mL的cRPMI中。用血球計數器計算細胞數後以台盼藍染色法進行檢測，在96孔微量盤接種cRPMI中的2 x 105 個細胞，單孔容積達200μL。以2.5μg HA/mL去活化病毒NIBRG-14病毒液或無病毒液疫苗刺激三重複細胞。並以刀豆凝集素A(Con A,5μg/mL,Sigma)誘發最大增殖反應。將96孔微量盤置於37℃及含5% CO2 的空氣條件下定溫培養4天。於培養期間的最後16小時，在細胞懸浮液中加入1μCi的氚化甲基胸腺核苷(Perkin Elmer,MA)以檢測細胞增殖情況。最後依照原廠(R&D Systems,Abingdon)指示之說明步驟，以ELISA分析儀檢測懸浮物中的γ-干擾素(IFN-γ)和介白素-4(IL-4)。
結果 共聚物的設計及以共聚物為基礎的乳狀液
兩性團聯共聚物含重量百分濃度達75wt%的親水性共聚物PEG，及25wt%的親油性共聚物PLACL，其分子量為7000道爾頓，粒徑分佈係數為1.1，HLB值則為15；該共聚物係由乳酸交酯和ε-己內酯團經開環聚合反應合成，並以MePEG為起始劑，SnOct2 為催化劑。由於膠體粒子在聚合水溶液中產生自締合，遂確定了PEG-b -PLACL具兩性分子特性。經雷射光散射分析結果顯示，其聚合膠體粒子具備單一模式的粒徑分佈，平均尺寸為18.2正負0.4nm。經免疫抗原研究，聚合水溶液並不具佐劑效果，因其所誘發的抗原(OVA)特異性抗體與無製劑配方者程度相同(該數據未顯示於本研究中)。
為了提升疫苗力價，以做為乳化劑的兩性共聚物組成不同的乳化製劑配方；即將聚合水溶液與Squalene(鯊烯)或鯊烯/85進行均化作用。表4列出以生物可吸收性共聚物PEG-b -PLACL和不同油脂組成的不同製劑配方之物理化學特徵。乳化製劑配方由上到下皆呈白色並具備等向性(圖8b)。而圖8(c)則呈現乳狀液於4℃狀態下的穩定狀態。PEG-b -PLACL/鯊烯/85乳狀液的穩定度可維持一年，沒有產生相分離。而PBS/鯊烯/85乳狀液的穩定度在一個月後，約有10%的表層油脂發生解離。至於水性和-油性比例各半(5/5w/w)的乳狀液PEG-b -PLACL/鯊烯，其穩定度在同樣的條件下於兩週後發生20%的水解離，但除此之外，沒有再發生其他水解離情況。而同型的乳狀液可在同樣的條件下以均化作用或振盪混合重新成形。若於PEG-b -PLACL/鯊烯乳狀液中增加鯊烯的比例，使其水/油比例達3/7w/w，則能提高其穩定度，製成穩定的乳狀液，存放一年內不會發生相解離。
乳狀液的分散型態可透過油滴測試、顯微鏡觀測和體外釋放實驗檢測。在油滴測試下可觀察到乳狀液的連續相。PBS/鯊烯/85乳狀液的油滴可於水溶液表面上漂浮24小時(圖9a)。而PEG-b -PLACL/鯊烯乳狀液的油滴則只能在水相中維持1.5小時，隨後便擴散於水溶液中(圖9b)，與PEG-b -PLACL/鯊烯/85乳狀液的油滴測試結果相近。該實驗結果顯示，內含親油性乳化劑85的PBS/鯊烯/85乳狀液具高親油性，而PEG-b -PLACL/鯊烯及PEG-b -PLACL/鯊烯/85則因為含有一親水性聚合乳化劑，使其形成一親水性乳狀液。
在分散相呈現擁擠狀態的乳狀液油滴可於光學顯微鏡下被觀測到。而其粒徑分佈則需將乳狀液重新分散於連續相當中，再以顯微鏡和雷射粒徑儀進行測量。如圖10a所示，PEG-b -PLACL/鯊烯乳狀液非同質粒子具兩種不同的粒徑分佈。本實驗觀測到的兩種粒子尺寸分別為10μm和1μm。而將PEG-b -PLACL/鯊烯/85重新分散於PBS緩衝液時，則可從光學顯微鏡觀測到小於1μm的同質微粒(圖10b)。經雷射光散射分析，顯示一單一模式的粒徑分佈，其平均尺寸為457.7正負25.8nm。該粒子模擬天然抗原尺寸，介於1~10μm的穩定粒子極易被抗原表現細胞群(APCs)吸收，有助利誘發免疫反應。
不同製劑配方之體外蛋白質釋放實驗
圖11表示不同配方下的OVA逐漸釋放圖示：(-x-)表示無配方，(○)表示PEG-b -PLA水溶液，(□)表示PEG-b -PLACL/鯊烯水包油乳狀液，(△)表示PEG-b -PLACL/鯊烯/85水包油-油包水乳狀液，而(●)則表示PBS/鯊烯/85油包水乳狀液。無佐劑配方的OVA在開始觀察的50小時內出現快速釋放現象，有80%以上的OVA被釋放到外面的PBS培養液中。至於PEG-b -PLACL/鯊烯聚合水溶液釋放時間較晚，但其蛋白質很快就被釋放出來。在同樣的時間條件下，PEG-b -PLACL/鯊烯/85釋放不到50%的OVA。然後釋放速率持續增加直到透析裝置內外的蛋白質釋放濃度達到平衡。PBS/鯊烯/85乳狀液對OVA表現出良好的儲存效果，因此親水的OVA蛋白質可緩慢地釋放超過200小時。
圖11b為經過200小時實驗後的製劑配方照片。PBS/鯊烯/85乳狀液發生相分離。而以PEG-b -PLACL為基礎的乳狀液及其底部水溶液明層則保持穩定。在本實驗一開始被包覆在乳狀液裡的蛋白質(即OVA)皆被釋放出來，顯示聚合乳化油性乳狀液所包覆的親水性生物活性物質(或抗原)，藉由擴散作用從核心油脂向表層被釋放出來，但同時也會發生較小程度的降解，至乳狀液結構被打開。
小鼠免疫抗原性實驗
經各項物理化學特徵分析實驗顯示，多種乳狀液提供了不同的微粒粒徑與抗原控制釋放機制，因此在特定及長時間情況下，乳化微粒可以做為抗原與抗原表現細胞群之間的傳遞載體和媒介。為評估以聚合物為基礎的乳化劑型佐劑之生物應用性，進一步檢測以不同製劑配方於近交系小鼠皮下接種OVA後之反應。表5呈現小鼠對輔以不同佐劑的OVA製劑配方之B細胞反應。進行免疫作用後，無佐劑配方組於第2週的1:50血清稀釋中，沒有出現抗原特異性抗體IgG反應，而第4週的血清效價則小於104 。相較於無佐劑配方組，加入PEG-b -PLACL/鯊烯、PEG-b -PLACL/鯊烯/85或磷酸鋁配方的OVA抗原組，其血清中的IgG抗體效價，以及同型的IgG1與IgG2a抗體效價都呈現顯著提升(p<0.05)。在IgG反應方面，PEG-b -PLACL/鯊烯/85製劑配方的幾何平均效價在第4週時，相較於無配方之疫苗為19.9、相較於PEG-b -PLACL/鯊烯製劑配方則為2.4、而相較於磷酸鋁製劑配方則為6.3。在免疫後的10週內，PEG-b -PLACL/鯊烯/85和磷酸鋁製劑配方所誘發的血清抗體皆十分顯著。而抗體反應最顯著者出現於PEG-b -PLACL/鯊烯/85製劑配方組；而磷酸鋁製劑配方組的效價則在免疫後初期的第2和第4週出現統計顯著性結果。免疫抗原性的增加可能與微粒粒徑有關，也可能是/或者來自其載體/儲存作用。
近交系小鼠於皮下接種3次劑量為0.5μg的OVA(第0,2,4週)。血清樣品係取自小鼠血液，而其抗體效價則以ELISA測量。該數據來自每組5隻小鼠血清幾何平均效價及95%信賴區間值。
a P <0.05：於同一時間點下相較於無佐劑配方之OVA疫苗。
b P <0.05：於同一時間點下相較於磷酸鋁製劑配方之OVA疫苗。<50表示在一開始的1:50稀釋液中無測得數據。
於體外以OVA抗原再次刺激細胞後，檢測脾細胞的T細胞增殖與細胞激素反應結果。圖12a表示於免疫作用後，無配方之OVA疫苗因為抗原劑量較低，其抗原特異性增殖反應並不顯著；因此OVA/PBS組的刺激指數只稍高於臨界值。然而當OVA疫苗加上以聚合物為基礎的乳狀液或被磷酸鋁吸附後，其所誘發的T細胞增殖反應便非常顯著。從圖12b可看出於體外以OVA再次刺激脾細胞後，在搭配了PEG-b -PLACL/鯊烯-和PEG-b -PLACL/鯊烯/85-製劑配方的小鼠脾細胞懸浮物中，測得非常顯著的γ-干擾素(IFN-γ)，此為一重要的協助T細胞(Th1)細胞激素。此外，在無配方OVA組當中則測得了同樣程度或程度較低的介白素-4，即另一類協助T細胞(Th2)細胞激素。
討論
要在特定及長時間的條件下傳遞抗原，必須輔以不同的乳化劑型佐劑或特定的界面活性劑。做為乳化劑的界面活性劑所具備的HLB值，可表示其對水相與油相溶液之親和力。本研究的油滴測試和體外釋放實驗顯示，含有一個低HLB值(HLBSpan 85 =1.8)乳化劑的鯊烯/85油性溶液，可形成一油包水(W/O)乳狀液。另外，含有高HLB值乳化劑的PEG-b -PLACL/鯊烯系統，則可形成一個水包油(O/W)乳狀液。而PEG-b -PLACL/鯊烯/85乳狀液係由兩種乳化劑組成，因而形成一種水包油-油包水(W/O/W)複合相乳狀液(圖13)。從乳狀液穩定度來看，粒子的粒徑較小及其粒徑分佈具同質性的油滴較為穩定，而這顯著受到界面活性劑系統與乳化過程最佳化的影響。將PEG-b -PLACL-水溶液與85-油相進行均化作用後，可於平日儲存與注射後的條件下，穩定結合乳化粒子。
共聚物在微粒遞送系統中可扮演不同的角色。而其中最直接參與系統的角色，即為微粒子的建立提供其所需的基質或媒介。可降解的PLG、PLA和PCL共聚物被應用在疫苗或蛋白質遞送用途，最常呈現為可被注射之微膠囊或可被植入之系統等形態。但要成為上述系統需經有機溶劑與複雜的製備過程，而且可能在抗原(病毒或蛋白質)被包覆時造成抗原等的變性。該系統還需要具備高分子量(通常>100,000Da)聚合物，需藉嚴峻的聚合反應條件才能形成(極端的溫度、壓力和有毒的催化劑)。但是兩性團聯共聚物，例如：聚(乙二醇)-團聯-聚(硫化丙烯)-團聯-聚(乙二醇)，聚(乙二醇)-團聯-聚氧丙烯-團聯-聚(乙二醇)(Pluronic或Poloxamers)，可做為聚合物、去油溫敏水凝膠或界面活性劑，而成為應用於疫苗遞送系統中的乳狀液(如TiterMax)。相較於以OVA做為抗原的其他製劑配方，以共聚物乳化劑做為基礎的配方不僅具有穩定度，還可誘發有效的體疫免疫及細胞免疫反應。但由於其毒性與非生物可降性，在人體疫苗遞送應用上還未有定論。本實驗亦嘗試研究共聚物水溶液或以共聚物為基礎的乳狀液，對於骨髓樹突狀細胞的啟動及抗原表現功能，以了解作用中的生物製劑互動與免疫機制。本研究結果顯示以PEG-b -PLACL為基礎的製劑配方對樹突狀細胞並不具活性(該數據未顯示於本研究中)。這些製劑配方或許不能做為樹突狀細胞的免疫刺激佐劑，然而仍可以應用於疫苗遞送系統當中。
據了解，我們是第一個針對合成兩性與生物可吸收性共聚物進行研究，並將其做為穩定結合水/油相界面乳化製劑的團隊。該乳化疫苗遞送系統有多項優於傳統疫苗佐劑之特點。首先，合成共聚乳化劑再現性高，而其疏水-親水平衡狀態可經由單體數量進行調整，而使乳化劑具備多種特徵。再者，不同於磷酸鋁吸附抗原的方式，該乳化系統可包覆住抗原或將其附著於表面，而且注射前的乳化製劑保存液可儲存於室溫或室溫以下的環境條件中。在製備PEG-b -PLACL以及/或者85乳化遞化系統時並不需要具備酸性條件，因為上述兩者皆為非離子型乳化劑。第三，含有可降解性疏水團聯共聚物的生物可吸收性共聚乳化劑，可表現出大量降解並能在生物體內再被吸收。第四，本研究中用來合成共聚物之原料皆十分容易購得，並經常被應用在治療用途中。該製劑配方易於製備，過程中並不需要特別複雜的步驟或特殊器具，因此成本相對低廉。此外不同於聚合物微膠囊的是，應用共聚乳化遞送系統時不需要有機溶劑。第五，在疫苗遞送系統中的水包油-油包水乳狀液只含5%的油脂成分(請見材料與方法：小鼠免疫實驗 )，相較於以同種油脂製成的油包水疫苗，其注射能力已顯著提高且能降低局部副作用的產生。最後，從免疫的角度看來，加入以PEG-b -PLACL為基礎的乳化劑後，製劑配方的OVA抗原特異性抗體效價、T細胞增殖與IFN-γ干擾素反應皆有顯著提升(p<0.05)。這些結果有助於生物活性劑局部遞送之研究發展，特別有助於疫苗候選株遞送系統的應用。
結論
為了提升疫苗力價，本研究採用一生物可吸收的三成分兩團聯共聚物PEG-b -PLACL做為乳化劑，並使共聚水溶液與鯊烯或鯊烯/85混合劑進行均化作用後，形成一水包油-油包水複合相乳狀液。新型的聚合乳化製劑配方具高親水性，因此含有乳狀液的OVA抗原保存液在注射前可被重新分散於PBS當中，使其成為具有粒徑介於1至10μm之均勻粒子的液態乳狀液(其油脂成分只含5%)。在特定且長時間的條件下，該乳化粒子可以做為生物活性劑和抗原表現細胞群之間的載體或媒介，並有效提升其免疫性。這些製劑配方未來可望應用於預防與治療用疫苗佐劑；或應用於單劑多價疫苗發展與改良肌肉注射或皮下接種的傳統給藥途徑。
實施例4
本研究以一生物可吸收性三成分兩團聯共聚物聚乙二醇聚乳酸交酯-ε-己內酯團聯共聚物(PEG-b -PLACL)為基礎，發展出一水包油-油包水複合相乳狀液型疫苗遞送系統，PELC。在該乳狀液中含有PEG-b -PLACL親水性乳化劑及85疏水性乳化劑，以穩定結合水/鯊烯界面，形成一穩定、均質的奈米乳化劑。而於小鼠免疫抗原性實驗中以OVA做為抗原，檢測結果顯示，在加入輔以PELC的製劑配方後，抗原特異性抗體效價、T細胞增殖反應和γ-干擾素(IFN-γ)分泌皆顯著提升。該途徑未來有可能進一步應用於預防及治療疫苗系統當中。為了因應於一短時間內製備大流行流感疫苗之需求，本研究亦試圖以添加PELC的製劑配方來增加疫苗效力。本實驗採用的單劑疫苗係由去活化H5N1病毒輔以PELC佐劑。
材料與方法 疫苗的製備
本實驗所使用的疫苗係出自英國國家生物製劑標準與管制所(NIBSC)的福馬林去活化全病毒疫苗NIBRG-14。該疫苗為重組流感H5N1病毒疫苗株，其突變HA和NA蛋白係取自高致病性禽流感病毒株A/Vietnam/1194/2004，再於狗腎臟上皮細胞株(MDCK)培養形成。福馬林去活化疫苗以0.1%福馬林於37℃下培養24小時。而HA則以單向免疫擴散法(SRD)進行檢測。H5N1疫苗候選株製備過程另做說明。
佐劑的製備
如前文所述，該兩團聯共聚物PEG-b -PLACL係由乳酸交酯和ε-己內酯以開環聚合反應合成而來。該團聯共聚物由重量百分濃度達75wt%的親水性共聚物PEG，及25wt%的親油性共聚物PLACL組成，其親水親脂平衡(HLB)值為15，分子量為7000道爾頓。而PELC乳化劑型疫苗遞送系統則是由PEG-b -PLACL、鯊烯和85組成。製備過程簡言之，即將含有PEG-b -PLACL的水溶液(以120mg共聚物溶於0.8mL的PBS緩衝液)和含鯊烯及85(比例為85/15v/v)的混合油劑1.1mL，用PT 3100均質機(Kinematica AG,瑞士)以6000rpm均質5分鐘乳化均勻。將乳化製劑配方儲存於4℃的環境中。注射前，製備以PELC為佐劑的疫苗，將200μL的PELC乳狀保存液加入1800μL的大量疫苗中。然後以顯微鏡(Olympus DP70)和雷射光散射技術(Brookhaven 90 plus雷射粒徑儀，Brookhaven Instruments Limited)分析乳狀液油滴粒徑分佈情況。
小鼠免疫實驗
在實驗開始進行之前，於國家實驗動物繁殖及研究中心(台北，台灣)取得五週齡的雌性近交系小鼠(BALB/c)，並先讓小鼠適應國家衛生研究院(NHRI,苗栗，台灣)實驗動物中心的環境。為研究單劑H5N1流感疫苗力價，以肌肉注射方式為小鼠分別接種輔以PELC或單純只有HA抗原(0.5μg或5μg)的疫苗。再收集血清及組織，以觀察B細胞和T細胞反應。血清樣品取自免疫小鼠，抗體效價則以酵素免疫分析法(ELISA)、血球凝集抑制試驗和病毒中和實驗進行測量。
ELISA酵素免疫分析法
以ELISA酵素免疫分析法檢測血清中的NIBRG-14特異性抗體反應。實驗內容簡述如下，於96孔微量盤中加入100μL已稀釋的去活化病毒(1μg/mL)，在室溫下定溫培養一夜。以含有0.05%20(Sigma)的PBS緩衝液清洗96孔微量盤一次，再加入含1%牛血清白蛋白的PBS，於室溫下放置2小時。將取自免疫小鼠的稀釋血清(起始稀釋率為1:1000，然後以2倍連續稀釋)加入96孔微量盤，在室溫下放置2小時。再清洗一次後，加入山羊抗鼠IgG抗體-HRP結合體(ICN Cappel,1:5000)，於室溫下放置30分鐘。進行分析時加入培養液2,20-次偶氮基-di(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTSPeroxidase,KPL)，在室溫下作用20分鐘並避免接觸光源。然後以ELISA分析儀(Thermo Multiskan分光光度計,Vantaa,芬蘭)讀取405nm波長處。測量次級抗體時，以100μL的兔抗鼠IgG1抗體-HRP結合體(AbD Serotec,Kidlington,UK,1:5000)，或兔抗鼠IgG2a抗體-HRP結合體(AbD Serotec,Kidlington,UK,1:2000)取代抗鼠IgG抗體。其效價係以最終稀釋溶液倒數為基準，表現出免疫前血清的2倍吸光率。
血球凝集抑制(HI)滴定試驗
血球凝集抑制試驗即檢測特定抗流感抗體對於被流感病毒HA感染的火雞紅血球(RBCs)血球凝集素之抑制能力。以熱作用移除非特異性凝集抑制劑後，加入破壞紅血球受器酵素。完成預先處理後，將血清樣品(起始稀釋率為1:10，再以2倍連續稀釋)與4個流感病株的血球凝集素單元進行定溫培養。然後加入火雞紅血球，並記錄凝集抑制作用。血清效價為最高稀釋液的倒數，顯示完整的血球凝集抑制(HI)作用。其血清保護率(SPR,%)係免疫小鼠效價比例，大於或等於40。
病毒中和試驗
以濃度200 TCID50(50%組織細胞感染量)的NIBRG-14病毒，及初始稀釋率為1:40並以兩倍稀釋的小鼠血清，在96孔微量盤中混合後進行定溫培養。再於37℃及5% CO2 的條件下以MDCK細胞株單層培養該病毒與血清混合液。中和效價為最高血清稀釋倍數之倒數，即96孔微量盤中半數被200 TCID50 H5N1感染的MDCK細胞病毒已被中和。感染性係以實驗第4天的急性細胞毒性判定，而效價則是以Reede-Muench方法計算。
統計分析
統計顯著性(p<0.005)係由Student氏雙側t-檢定測量對數轉換值計算得來。
T細胞免疫實驗
據研究顯示，免疫作用後第7至14天為最適合檢測流感特異性T細胞增殖反應的時間點。本研究以免疫作用後第12天做為實驗終點。在免疫作用後第12天以無菌方式將小鼠脾臟細胞移至含1mL的RPMI-1640培養液(cRPMI)(SAFC,Kansas,USA)和2Mm左旋-麩醯胺之試管中，並加入25Mm的HEPES緩衝液(Gibco,Invitrogen,NY,USA)、0.05mM的2-硫氫乙醇、10%熱去活化胎牛血清(FBS;HyClone/Perbio)、100μg/ml的鏈黴素和100U/ml的青黴素。用細胞篩子和注射器活塞磨碎脾細胞，取得細胞懸浮液。將細胞懸浮液置入50mL的管柱，以1000rpm離心分離5分鐘。為了移除紅血球，將細胞沉澱物重新懸浮於5mL的RBK溶解緩衝液(150mM NH4 Cl、1mM KHCO3 及pH 7.3的EDTA 0.1mM,Biolegend,CA)當中，於室溫下培養1分鐘。然後以20mL的RPMI-1640中止反應，再離心沉澱5分鐘。以cRPMI清洗細胞沉澱物兩次後，將其重新懸浮於5mL的cRPMI中。用血球計數器計算細胞數後再以台盼藍染色法進行檢測，在96孔微量盤接種cRPMI中的2 x 105 個細胞，單孔容積達200μL。用無OVA或10μg/mL的OVA刺激三重複細胞。此外，以刀豆凝集素A(Con A,5μg/mL,Sigma)做為正向控制樣品，將96孔微量盤於37℃條件下，含5% CO2 的潮濕空氣中定溫培養5天。在培養期間的最後16小時，於細胞懸浮液中加入1μCi的氚化甲基胸腺核苷(Perkin Elmer,MA)，檢測細胞增殖情況。最後依照原廠(R&D Systems,Abingdon)指示之說明步驟，以ELISA分析方法檢測懸浮物中的γ-干擾素(IFN-γ)和介白素-4(IL-4)。
結果 添加PELC之去活化流感病毒製劑配方
輔以PELC配方的流感疫苗候選株係由一去活化病毒體與一預先乳化的PELC保存液(請見材料與方法：佐劑的製備 )所組成。注射前先將PELC保存液和去活化病毒體均勻混合，以形成均質粒子。尺寸介於200至400nm的粒子粒徑分佈(圖14)，符合了奈米乳狀液之定義。值得關注的是，曾有研究指出具上述奈米尺度之粒子易於被抗原表現細胞群所吸收，亦即有助於誘發有效的免疫反應。
檢測近交系小鼠的NIBRG-14特異性抗體反應
為評估施打單劑疫苗後之免疫作用及其是否能誘發保護性抗體反應，以肌肉注射方式為小鼠分別接種輔以PELC，或只有去活化NIBRG-14病毒疫苗，劑量各為0.5μg或5μg HA。表6顯示以肌肉注射單劑H5N1去活化病毒疫苗後，免疫小鼠被誘發的NIBRG-14特異性IgG、IgG1及IgG2a抗體反應。抗原特異性抗體反應記錄於表6中。結果顯示，無論是施打0.5μg或5μg的HA抗原疫苗組，輔以PELC佐劑配方後所誘發的特異性抗病毒抗體IgG、IgG1及IgG2a效價，均顯著高於無配方組(P<0.05)。而輔以PELC佐劑配方的去活化病毒疫苗在給藥後的第4週還表現出另一優勢：輔以PELC佐劑配方的0.5μg去活化病毒HA抗原疫苗組所誘發的IgG抗體效價，高於無配方之5μg去活化病毒HA抗原疫苗組之表現。在同一時間點上，無配方之5μg去活化病毒HA抗原疫苗組所誘發的效價為輔以PELC佐劑配方(0.5μg)抗原疫苗組的十分之一。
抗血清的血球凝集抑制活動
血球凝集抑制(HI)試驗係最常被用來檢測流感疫苗效力的實驗方法。本實驗以火雞紅血球與免疫小鼠血清進行混合及定溫培養，然後測定其HI活動。表7顯示以肌肉注射單劑H5N1去活化H5N1病毒疫苗，及輔以PELC佐劑配方之疫苗在免疫小鼠所誘發的HI抗體反應。在接種單劑疫苗後，接種無配方之0.5μg去活化病毒HA抗原疫苗的小鼠血清HI幾何平均效價(GMT)在第2及第4週分別為6和9。其最高GMT值出現在第12週的59及第26週的33。當無配方之去活化病毒HA抗原疫苗劑量達5μg時，其HI效價在第2、4、8週稍有提升。然而劑量0.5μg及5μg的HA抗原疫苗組所誘發的HI效價並無統計顯著性差異(P~1)。而輔以PELC佐劑配方的去活化病毒疫苗所誘發的HI效價則高於無配方之疫苗(P<0.05)。即使輔以PELC佐劑配方的去活化病毒HA抗原疫苗組劑量只有0.5μg，其所誘發的HI效價仍顯著高於無配方之5μg去活化病毒HA抗原疫苗組。此外，無配方之去活化病毒HA抗原疫苗組的血清保護率表現在實驗過程中未曾達到100%。但是輔以PELC的疫苗組，無論劑量為0.5μg或5μg，均極易表現出100%的血清保護率。結果顯示，輔以PELC佐劑配方的去活化流感病毒疫苗，其抗體反應表現顯著優於無配方之疫苗。
抗血清的病毒中和(VN)活動
病毒中和試驗為常見的疫苗誘發免疫力實驗。如表8所示，提高無佐劑配方的抗原劑量時，其中和抗體效價亦稍有提升。但加入PELC佐劑配方的抗原疫苗，其中和抗體效價出現非常顯著的提升。中和抗體效價表現最佳者，係由輔以PELC佐劑的5μg HA抗原疫苗組所誘發。從血球凝集抑制(HI)效價表現來看，輔以PELC佐劑配方的去活化病毒抗原疫苗之病毒中和(VN)能力，與其佐劑活性相為互補。因此，輔以PELC佐劑的去活化病毒抗原疫苗可誘發足夠且持續的抗體保護作用。值得注意的是，即使輔以PELC佐劑配方的去活化病毒HA抗原疫苗組劑量只有0.5μg，其所誘發的抗體效價、HI效價及病毒中和活動，均顯著高於無配方的去活化病毒抗原疫苗。實驗結果顯示，加入PELC製劑配方的去活化病毒疫苗不但可以降低抗原劑量，亦可提升疫苗對人體的保護能力。
輔以PELC配方抗原的T細胞增殖與細胞激素反應
本實驗進一步檢測輔以PELC佐劑配方之抗原是否能提升T細胞反應。在小鼠肌肉注射PBS或PELC中的去活化病毒0.5μg後第12天，從小鼠脾細胞取得單細胞懸浮液，再以去活化病毒於體外重新刺激4天。圖15A顯示在接種疫苗後，無佐劑配方的病毒並沒有誘發出顯著的抗原特異性增殖反應。被誘發的刺激指數(SI)，為有抗原組的每分鐘測量值(cpm)平均數相較於無抗原組的cpm之比率；有抗原組的SI僅稍高於控制組。然而，加入PELC佐劑配方的疫苗可誘發出顯著的T細胞增殖反應，且其SI值達到無配方組的2倍。此外，在PELC佐劑配方組的脾細胞懸浮液中所測得的γ-干擾素(IFN-γ)和介白素-4(IL-4)亦顯著高於無配方組(圖15B)。IFN-γ為病毒特異性殺手T細胞淋巴球(CTL)活動中一重要的協助T細胞(Th1)細胞激素；而IL-4則為另一常見的協助T細胞(Th2)細胞激素。因此輔以PELC配方的抗原可能可以增加其對人體的保護能力，並同時提升Th1及Th2反應。實驗結果顯示，PELC未來或許能在抗大流行流感的單劑免疫疫苗中扮演重要角色。
討論
根據輔以磷酸鋁的H5N1流感疫苗研究指出，在施打第一劑疫苗後仍需追加第二劑，才能使其產生對抗異質或同質病毒株的保護作用。而不論是否增加磷酸鋁佐劑，劑量介於0.001至3.75μg的HA抗原在注射後所誘發的病毒中和抗體效價均低於可測量值之標準。但追加施打同劑量之疫苗後，其抗體效價與病毒中和抗體效價皆會明顯上升。此外據文獻指出，以去活化病毒進行兩次疫苗免疫作用後，無論施打劑量0.2μg或2μg的HA抗原，其所誘發的抗體保護作用無統計顯著性差異。而有、無輔以磷酸鋁佐劑之疫苗的表現也沒有明顯的差別。另有文獻指出，施打兩次輔以磷酸鋁佐劑，且劑量為1.5μg的H2N2去活化病毒HA抗原疫苗所能誘發的抗體反應，相當於劑量達15μg之無配方HA抗原疫苗之抗體反應。而本實驗結果則顯示，施以單劑量PELC佐劑配方之病毒抗原疫苗可同時誘發顯著的病毒中和抗體反應，且其HI與VN實驗均表現出劑量依隨效應。而無配方組並沒有出現劑量依隨效應。在誘發抗體反應的持續時效方面，無論是否輔以PELC佐劑配方，其結果無顯著差異。在兩組疫苗中，IgG效價的最高峰出現在免疫作用後的第8週，然後出現波動起伏，並自第26週起微幅下降。此外，HI與VN抗體反應的高峰則出現在第12週，然後自第26週開始下降。實驗結果顯示，輔以PELC佐劑之疫苗在預防大流行流感的疫苗應用上十分具有潛力。由於輔以PELC配方之疫苗不但可降低抗原劑量，加上單劑疫苗之特性亦減少追加疫苗之需求；因此其所具備的免疫效果與高效性將有助於解決疫苗短缺之困境。
由於水包油乳狀液可於注射部位快速誘發出顯著的免疫能力，因此在人體疫苗的應用上其效果優於磷酸鋁佐劑。此外近期的臨床研究也指出，輔以水包油乳狀液的H5N1疫苗所誘發之血清轉化及交互中和效價，均高於無佐劑或輔以磷酸鋁配方之疫苗的表現。然而儘管水包油乳狀液具有上述優點，可是親水性乳化劑80卻會攻擊細胞表面且具有毒性。因此，同樣屬於親水性且另具多項優勢的乳化劑PEG-b -PLACL可做為取代80的替代方案。首先，PEG-b -PLACL係合成自經美國FDA認可之聚乙二醇、聚乳酸交酯和聚ε-己內酯，可望通過各項安全檢測。此外，相較於小分子乳化佐劑配方，聚合乳化劑通常可形成更穩定的乳狀液，且具有更好的人體與細胞免疫反應能力。最後，可降解的乳化劑在一般儲存條件下可與乳狀液粒子穩定結合，並能在注射後自行分解。這些特徵顯示輔以PEG-b -PLACL乳化劑型佐劑之疫苗，將可望展現其安全與效力等特性。
美國有關諮詢委員會在近十多年來關注到，老年人在施打流感疫苗後所誘發的抗體反應有漸趨下降的態勢。一般亦認為年長者較容易受到流感病毒傳染。近來研究發現疫苗接種的有效性與其是否能誘發Th1細胞激素，亦即γ-干擾素，有顯著關聯。但研究也指出老年人的免疫反應會由Th1轉移至Th2，即介白素-4；加上由於老化使其殺手T細胞淋巴球活動力下降，均是年長者較易受到傳染的原因。因此，藉由疫苗的接種提升其γ-干擾素的誘發能力，被認為是幫助老年人降低流感傳染率的重要對策。在這樣的前提下，PELC可做為有效的佐劑選擇；因為該佐劑配方可顯著刺激抗原特異性T細胞增殖和γ-干擾素的分泌。此外，相較於無配方之病毒抗原疫苗，輔以PELC佐劑配方組正向調控了小鼠脾細胞中的γ-干擾素和介白素-4，同時增加IgG1與IgG2a的抗體反應。但該佐劑配方疫苗對於Th1或Th2免疫反應的轉移效果並不顯著(詳見表6及圖15B)。實驗結果意味，輔以PELC配方的抗原可望顯著提升疫苗候選株的免疫抗原性。目前該實驗尚持續研究輔以PELC製劑配方之疫苗遞送系統，與免疫刺激性佐劑，如CpG寡去氧核苷酸，以期更有效地調控免疫反應與Th1/Th2平衡作用。綜上所述，本研究結果顯示，輔以PELC佐劑的0.5μg HA抗原疫苗組所誘發的HI與VN效價明顯優於無配方之5μg HA抗原疫苗組。如果可以發展出一輔以佐劑、且低抗原量的全病毒流感疫苗，那麼在同樣的生產條件下將可有效增加疫苗劑量。此外，輔以PELC佐劑的0.5μg HA抗原疫苗組亦表現出T細胞增殖、γ-干擾素與介白素-4分泌增加的效果，顯示該疫苗製劑配方或許有助於提升老年人的免疫保護效果。綜觀上述實驗結果，PELC可望被用於大流行流感疫苗的實際應用中並有效降低抗原的使用量。
前述對於本發明較佳實施例之描述，僅為用以說明及敘述的目的，而非用用限制本創作。熟悉該技藝者將可體會本創作可能使用於很多形式、結構和材料的修改。
所選擇及描述之具體態樣與實施例，係為解釋本發明之原理及其實際的應用，以使熟悉該項技藝者能夠應用本發明及各種實施態樣，且能依其所預期的特別用途進行各種適合之修改。其他具體實施例在不脫離本發明之精神及範圍下，對於熟悉該項技藝者是顯而易知的。因此，本發明之範圍應由後附申請專利範圍所界定，而非受限於前述的說明及實施例。
於本發明說明中引用及論述某些參考文獻，其可包括專利案、專利申請案及各種公開文獻。此等參考文獻之引用及論述僅用以闡明本發明之說明，而非認可此類文獻係屬本發明內容之“先前技藝”。所有於本說明書中引用及論述之參考文獻，係完整地以引用方式納入本文，並且在一定程度上，每個參考資料均各別地被引用至參考文獻中。
圖1(a)為存於37℃時的乳狀液外觀，而圖(b)則為以生物可吸收性聚合物和油性佐劑ISA51為基礎的乳狀液製劑配方之逐漸釋放卵白蛋白圖示。(-x-)表示無配方，(○)表示PEG-b -PLA/ISA51，(□)表示PEG-b -PCL/ISA51，(△)表示PEG-b -PLACL/ISA51，而(●)則表示PBS/ISA51。帶有卵白蛋白(OVA)的製劑配方(每0.3mL含3mg)置放於37℃、含2ml PBS的離心管透析室中。以蛋白質濃度分析(BCA)法規律地監測卵白蛋白的釋放(以標準牛血清白蛋白溶液取得校正曲線，讀取紫外可見光光譜儀562nm波長處)。該數據取自三個樣本的平均值與標準差。
圖2則表示以ISA51為佐劑的疫苗與(c)一生物可吸收性聚合物(a)穩定結合前和(b)結合後之概要圖示。ISA51含有親脂性的單油酸甘露聚糖甘，由於其具高親油性而形成一油包水乳狀液。在抗原溶液中與親水乳化劑PEG-b -PLA、PEG-b -PCL或PEG-b -PLACL穩定結合後，原來具油性的ISA51佐劑疫苗之親水性顯著提高，因此包覆著抗原的乳狀保存液可以在PBS中重新分散，而獲得一(d)粒徑分佈小於1μm的均質微粒乳狀液。
圖3則表示免疫小鼠對不同佐劑配方的OVA特異性抗體反應。在第0週和第2週對近交系小鼠(BALB/c)皮下接種0.5μg的OVA。由血液中取得血清並以ELISA酵素免疫分析法測量抗體效價。該數據為幾何平均效價與標準誤差(每組5隻小鼠)。*P <0.005：對比無OVA配方的小鼠樣品，時間點皆與上述實驗內容相同。
圖4(a)-4(b)為(a)兩團聯共聚物PLA-PEG和(b)三團聯共聚物PLA-PEG-PLA之合成圖示。
圖5(a)和5(b)分別為MePEG2000 和PLA-PEG的MALDI-TOF質譜圖。
圖6(a)-6(b)分別為diOH-PEG2000 和PLA-PEG-PLA的MALDI-TOF質譜圖。
圖7為以PLA-PEG和PLA-PEG-PLA為基礎的鯊烯乳狀液體外OVA釋放圖示。帶有OVA的配方(每0.3mL含3mg)置放於37℃、含2mL PBS的離心管透析室中。以BCA法規律地監測卵白蛋白的釋放情況，並以標準牛血清白蛋白溶液取得校正曲線，以紫外可見光光譜儀讀取562nm波數處。該數據取自三個樣本的平均值與標準誤差。(-x-)表示無配方，(○)表示PEG-PEG/鯊烯，(△)表示PLA-PEG-PLA/鯊烯。
圖8(a)和(b)分別為共聚物與油性乳狀液以6000rpm振盪5分鐘(a)之前和(b)之後的照片；而圖8(c)則為該乳狀液於4℃狀態下保存兩個月後的外觀。共聚物在抗原培養水溶液中的重量百分濃度為13wt%，而水/油性溶液的比例則為5/5w/w。由左而右依序分別為(i)PEG-b -PLACL/鯊烯，(ii)PEG-b -PLACL/鯊烯/85，(iii)PBS/鯊烯/85。
圖9(a)-9(b)為乳狀液製劑配方的油滴測試結果照片，(a)為PBS/鯊烯/85而(b)為PEG-b -PLACL/鯊烯。
圖10(a)-10(b)分別為共聚乳化製劑配方(a)PEG-b -PLACL/鯊烯及(b)PEG-b -PLACL/鯊烯/85在顯微鏡下的外觀及其雷射光散射分析圖。
圖11(a)為不同製劑配方下的OVA逐漸釋放圖示。(-x-)表示無配方，(○)表示PEG-b -PLA水溶液，(□)表示PEG-b -PLACL/鯊烯水包油乳狀液，(△)表示PEG-b -PLACL/鯊烯/85水包油-油包水乳狀液，而(●)則表示PBS/鯊烯/85油包水乳狀液。帶有OVA的配方(每0.3mL含3mg)置放於37℃、含2mL PBS的離心管透析室中。以BCA分析法規律地監測OVA的釋放，並以標準牛血清白蛋白溶液(2,1,0.5,0.25,0.125mg/mL)取得校正曲線，以紫外可見光光譜儀讀取562nm波數處。該數據取自三個樣本的平均值與標準誤差。
圖11(b)為上述圖11(a)實驗後的製劑配方照片。
圖12(a)-12(b)，表示在輔以佐劑或無佐劑的不同配方下，其OVA免疫的小鼠脾臟細胞之(a)T細胞增殖和(b)細胞激素釋放反應。(i)為控制組；(ii)無佐劑配方；(iii)PEG-b -PLACL/鯊烯；(iv)PEG-b -PLACL/鯊烯/85；(v)為磷酸鋁。BALB/c小鼠在第0週於皮下接種0.5μg的OVA抗原，並在第2和第4週再次追加，最後一次接種隔一週後，從每組兩隻小鼠取得並製備脾細胞懸浮液以測定其細胞激素，以有OVA抗原(10mg/mL)或無抗原等條件各培養5天。其刺激指數(SI)為有抗原對比無抗原者每分鐘測量值平均數(c.p.m.)之比例。該結果為其平均值與標準誤差(n=3)。如果SI指數大於2則可確認T細胞增殖。此外，從三重複培養物中收集懸浮物後，以ELISA分析細胞激素γ-干擾素(IFN-γ)和介白素-4(IL-4)。細胞激素釋放數值為OVA刺激減去單純的培養液。
圖13為一水包油-油包水複合相乳狀液之圖示。PEG-b -PLACL/鯊烯/85包含PEG-b -PLACL和85兩種乳化劑，因而形成一水包油-油包水複合相乳狀液。其油滴測試可分散於連續水相中，但核心油脂仍可包覆一內水相。
圖14表示以PELC為配方的流感疫苗具均質微粒，其粒徑約為200至400nm。右下方之矩形圖可表示微粒之粒徑分佈。
圖15A表示以去活化病毒H5N1或輔以PELC配方免疫小鼠後，其脾細胞中T細胞增殖情況。以肌肉注射近交系小鼠單劑0.5μg的HA抗原，在免疫作用12天後，從每組三隻小鼠取得脾細胞懸浮液，並以0.25μg的HA/mL抗原刺激或單獨使用培養液培養4天。其刺激指數(SI)為有抗原對比無抗原者每分鐘測量值平均數(c.p.m.)之比例。該數據為其平均值與標準差(n=3)。如果SI指數大於3則可確認T細胞增殖。
圖15B表示脾細胞的細胞激素反應。懸浮物取自圖15A表示的實驗之三份培養物中，並以ELISA分析細胞激素γ-干擾素(IFN-γ)和介白素-4(IL-4)。該數據為平均值與標準誤差(n=3)。

Claims (16)

  1. 一種合成物，其組成成分包括：(a)一含H2 O分子的連續水相；(b)一含油脂的油相；以及(c)一用來穩定結合介於油相與連續水相界面的兩性乳化系統，該乳狀系統包括一團聯共聚物，而該共聚物符合如下化學式(A)p -(B)q -(C)r 並且：p 、q 和r 皆為整數，而且：如果p 為0，則該團聯共聚物為一兩團聯共聚物，其中(B)q 為一個親水基而(C)r 為一個疏水基；B和C各為重覆單元；如果p 大於1，則該團聯共聚物為三團聯共聚物，其中(B)q 為一個親水基且(A)p 和(C)r 各為疏水基；疏水基(A)p 和(C)r 各為單質聚合物或異質聚合物；A、B和C各為重覆單元；重覆的A和C可以是相同或相異的單元；且其中重覆單元B係選自由環氧乙烷、乙烯吡咯烷酮和丙烯醯胺所組成的基團；該疏水基(A)p 和(C)r 各為脂肪族聚酯，各選自由羥基酸、內酯，及其組合物所組成的基團；且該親水基(B)q 占團聯共聚物(A)p -(B)q -(C)r 主鏈比重大於50 wt%，以使該團聯共聚物的親水親脂平衡(HLB)值大於10。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述的合成物，其中該連續水相內包括一抗原及/或一生物活性物質。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該油相可包埋或包覆一抗原及/或一生物活性物質。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該油相包括一種包含如下條件之乳狀液：(a)一包含水分子之內水相，且分散於油相中；以及(b)一穩定結合介於內水相和油相的親脂性乳化系統，以形成一油包水(W/O)乳狀液；因此該合成物為水包油-油包水型態之複合相乳狀液。
  5. 根據申請專利範圍第4項所述之合成物，該親脂性乳化系統至少含有一種生理上可接受的乳化劑，而該乳化劑係選自由單油酸甘露聚糖甘和山梨糖酯所組成的基團。
  6. 根據申請專利範圍第4項所述之合成物，其可包含一溶於內水相及/或連續水相的抗原及/或生物活性物質。
  7. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該團聯共聚物具備生物可吸收性。
  8. 根據申請專利範圍第1項之合成物，其中該親水基(B)q 為線性 共聚物。
  9. 根據申請專利範圍第1項之合成物，其中該羥基酸係選自由乳酸、6-羥基己酸、乙醇酸、單酯蘋果酸，及其組合物所組成的基團。
  10. 根據申請專利範圍第1項之合成物，其中該內酯係選自由ε-己內酯、乳酸交酯、乙交酯、1,4-二氧雜環己-2-酮，及其組合物所組成的基團。
  11. 根據申請專利範圍第1項之合成物，其中該疏水基團(A)p 和(C)r 各包括一種選自由以下化合物所組成之聚合物：(a)含有羥基酸之聚合物：聚乳酸交酯、聚乳酸、聚乳酸交酯乙交酯共聚物、聚乙交酯、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚蘋果酸、聚蘋果酸酯或聚乙醇酸；(b)含有內酯之聚合物：聚乳酸交酯-ε-己內酯共聚物、聚ε-己內酯或聚乙交酯-ε-己內酯共聚物；以及(c)含有羥基己酸之聚合物：聚乳酸-6-羥基己酸共聚物、或聚乙交酯-6-羥基己酸共聚物。
  12. 根據申請專利範圍第1項之合成物，該團聯共聚物係選自由聚(乙二醇)-團聯-聚(乳酸交酯-共-ε-己內酯)(poly(ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-ε-caprolactone))、聚(乙二醇)-團聯-聚乳酸交酯(poly(ethylene glycol)-block-polylactide)和聚(乙二醇)-團聯-聚(-ε-己內酯)(poly(ethylene glycol)-block-poly(ε-caprolactone))所組成之團聯共聚物。
  13. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該團聯共聚物之 HLB值介於14~19之間。
  14. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該油相之粒徑分佈介於100nm~10μm。
  15. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該親水基(B)q分子量約為550至10,000道爾頓。
  16. 根據申請專利範圍第1項所述之合成物，其中該親水基(B)q分子量約為2,000至8,000道爾頓。
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