JP7033582B2 - 薄肉シェル型ポリマーナノ粒子及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は生物活性剤をカプセル化するためのポリマーナノ粒子に関する。

背景
ポリマーナノ粒子は、薬物送達のような数々の分野において、活性薬剤すなわち積荷の、担体としての幅広い用途を有している。しかし、大きな水性の内部を備えたナノ粒子を作出する難しさは、親水性巨大分子の積荷のカプセル化を伴うそれら粒子の用途を著しく限定している。

既存のポリマーナノ粒子は一般に、親水性の積荷のカプセル化のための水性の内側コア空間をほとんど又は全く備えていない固体である。ポリマーのシェルで構成されたいくつかの中空ポリマーナノ粒子が開発されているが、それらの粒子は様々な欠点、例えばサイズの制限、望ましくないシェル厚及びシェル強度、並びに積荷カプセル化の効率の悪さを有している。

上記欠点のない、生物活性剤を送達するための新たな担体を開発する必要がある。

概要
本発明は生物活性剤をカプセル化するためのポリマーナノ粒子に関する。予想外なことに、本発明のポリマーナノ粒子は、装荷量（loadings）の多いある種の生物活性剤について高いカプセル化効率を示す。

本発明の一態様は、生物活性剤をカプセル化するためのポリマーナノ粒子である。該ポリマーナノ粒子は、（ｉ）不透水性のポリマーシェルと、（ｉｉ）該ポリマーシェルによって包まれ、かつ生物活性剤を含有している１以上の水性コアとを備えている。ポリマーシェルは２５ｎｍ未満（例えば、８～２０ｎｍ）の厚さを有し、ポリマーナノ粒子は３０～６００ｎｍ（例えば、３０～４０ｎｍ及び１００～６００ｎｍ）の外径を有する。

一例において、ポリマーナノ粒子は１００ｎｍを超える外径を有し、水性コアは、ポリマーナノ粒子の外径の７０％を超える（例えば、＞８０％の）直径を有する。
一般に、ポリマーナノ粒子は、８４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又はそれ以上の浸透圧抵抗を有する。

本発明のポリマーナノ粒子は、様々な生物活性剤をカプセル化するために使用可能である。生物活性剤の例としては、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ又は環状ジＧＭＰ）、造影剤、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、及びこれらの組み合わせが挙げられる。生物活性剤は、２０％を超える（例えば、＞３０％及び＞４０％の）カプセル化効率を有することができる。

さらに本発明の範囲内には、疾患を治療する方法がある。該方法は、投与を必要とする対象者に、その疾患を治療するための生物活性剤をカプセル化している上記のポリマーナノ粒子を投与することを含む。

本発明によってさらに対象とされるのは、上述のポリマーナノ粒子を調製する方法である。該方法は、下記のステップ、すなわち、（ｉ）ポリマーを溶媒に溶解させてポリマー溶液を形成するステップと、（ｉｉ）生物活性剤を含有する第１の水性溶液中でポリマー溶液を分散により乳化させて乳剤を形成するステップと、（ｉｉｉ）そのようにして形成された乳剤を第２の水性溶液中で流体分散（fluidic dispersion）により乳化させてポリマーナノ粒子を得るステップと、（ｉｖ）そのようにして得られたポリマーナノ粒子を収集するステップとを含む。ポリマーが無極性のセグメント及び極性の末端基を含むことが重要である。また、流体分散はマイクロフルイダイザーを使用することにより制御された方式で行なわれる。

典型的には、上記調製方法で使用される溶媒は無極性溶媒である。溶媒の例としては、限定するものではないが、ジクロロメタン、ベンジルアルコール、酢酸エチル、クロロホルム、及び任意のモル比の前記溶媒を含有する混合物が挙げられる。

第１及び第２の水性溶液はそれぞれ、その溶液の酸性度及び粘度を調節するための可溶化された分子、すなわちモジュレータを含有する極性溶液であってもよい。モジュレータの例としては、限定するものではないが、リン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、スクロース、デキストラン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

本発明の詳細については以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的及び利点は、いくつかの実施形態についての以下の図面及び詳細な説明から、並びに添付の特許請求の範囲からも明白となろう。

核酸及びタンパク質についてのポリマーナノ粒子のカプセル化効率を示す図。 細胞取込み及びｓｉＲＮＡ‐ＧＦＰを用いた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のノックダウンを示す図。 免疫刺激のためのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストのカプセル化及び制御放出に対するポリマーナノ粒子の効果を示す図。 リンパのサイトカインを増強すると同時に全身性サイトカインを最小限にする際の、ＳＴＩＮＧアゴニストを装荷したナノ粒子について示す図。 抗原／ナノ粒子の結合を介したナノ粒子ワクチンの調製について示す図。 そのようにして調製されたナノ粒子ワクチンの評価について示す図。 細胞性免疫応答に対するナノ粒子ワクチンの効果の評価について示す図。 生物活性剤を装荷された多数の水性コアを含んでいる薄肉シェル型のポリマーナノ粒子を示す図。

詳細な説明
本明細書中に詳細に開示されるのは、生物活性剤、例えば治療薬又はワクチンをカプセル化するためのポリマーナノ粒子である。

医薬及びワクチンのナノテクノロジーは、新規な治療薬及びワクチン製剤の開発に対して多大な影響を及ぼしてきた。薬剤開発において、ナノ担体は、薬物の治療指数を改善する正確な薬物送達を可能とし、副作用を低減し、かつ多剤の相乗効果を促進する。ワクチン開発では、ナノ粒子は、抗原性標的のリンパ性輸送を改善し、多価抗原提示を可能とし、かつ抗原／アジュバント会合を容易にすることにより、抗原性標的の潜在能力を増強することができる。広範囲なナノ粒子研究にもかかわらず、親水性かつ巨大分子の積荷のカプセル化にはかなりの難題が残っている。本発明は、生物活性剤、例えば親水性かつ巨大分子の積荷をカプセル化することができるポリマーナノ粒子に関心を寄せるものである。

ナノ粒子は、薄いポリマーシェル及び該ポリマーシェルによって包まれた１以上の水性コアを含んでいる。
典型的には、ポリマーシェルは、無極性のセグメント及び極性の末端基を含む両親媒性ポリマーから形成される。無極性のセグメントの例としては、限定するものではないが、ポリ乳酸、ポリ乳酸‐グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、及びポリウレタンが挙げられる。ＰＬＧＡは、任意の乳酸対グリコール酸モル比を有することができる（例えば、５０：５０又は７５：２５のＰＬＧＡ）。極性の末端基は、負の電荷を有する基、正の電荷を有する基、双性イオン基、又は中性の基であってもよい。負の電荷を有する基の例としては、カルボン酸、コハク酸、及びスルホン酸が挙げられる。正の電荷を有する基の例としては、アミン及びアミジンが挙げられる。双性イオン基の例としては、カルボキシベタイン及びスルホベタインが挙げられる。中性の基の一例は糖である。

例示のポリマーシェルは、無極性のセグメントとしてのポリ乳酸‐グリコール酸共重合体と、極性の末端基としてのカルボン酸とを含有するポリマーから形成される。
本明細書中に記載されるポリマーナノ粒子は、２５ｎｍ以下の厚さを有する欠損の無いポリマーシェルを備えたポリマー製の中空ナノ粒子プラットフォームであってもよい。該中空ポリマーナノ粒子は、典型的には３０～６００ｎｍの外径を有する。

シェルの厚さを最小限にすることにより、ポリマーナノ粒子は、積荷の装荷量を最大限にすることが可能な大きな水性の内部空間を備えて形成可能である。外径が１００ｎｍを上回る粒子については、水性の内部空間は、粒子の外径の少なくとも８０％の直径を有することも可能であるし、大きな総体積を有する多数のコンパートメントからなるものであってもよい。親水性の色素及び核酸が高効率でカプセル化されることが、相補結合する分子の非存在下において、薄肉シェル型の中空ナノ粒子を用いて実証される。薄肉シェル型のナノ粒子は浸透ストレスに強いことが実証されるが、これは欠損の無い完全な不透水性のポリマーシェルに起因する特徴である。本発明のポリマーナノ粒子は、薬物送達及びワクチン開発を含む様々な分野において生物活性剤を送達するために使用可能である。

ポリマーナノ粒子、特にポリ乳酸‐グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）のような生分解性かつ生体適合性のポリマーで構成されているものは、生体適合性、生分解性、及び合成融通性を含む該ポリマーの多数の特徴から、ナノメディシンの研究において大きな注目を浴びてきた。しかしながら、該ポリマーの本来的な疎水性が原因で、ＰＬＧＡに基づくナノ粒子は、臨床では水に不溶な化合物の送達に限定されてきた。ポリマーナノ粒子内への親水性かつ巨大分子の積荷のカプセル化は、ポリマーが親水性かつ巨大分子の積荷（例えばｓｉＲＮＡ）を担持するための水性のコア空間をほとんど又は全く備えていない固体のナノ球体を形成する傾向があるために、依然として難題のままである。

巨大分子のカプセル化がウイルスの形態の天然ナノ微粒子では一般的であることを考えると、理想的なナノ担体は、生物活性分子のパッケージングのために大量の含水物を包み込む薄肉シェルを有するべきであることが想定される。薄肉シェルはさらに、確実な積荷のカプセル化を可能にするために、欠損が無くかつ不透水性であることが好ましい。

さらに本発明が対象とするのは、医学的状態を治療するための、上述のポリマーナノ粒子を使用する方法である。医学的状態の例としては、限定するものではないが、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、又は感染症が挙げられる。

本明細書中で詳細にさらに開示されるのは、上記ポリマーナノ粒子を調製する方法である。
概して、薄肉シェル型の中空ナノ粒子は、両親媒性ポリマーであってその末端における極性の対比が大きいポリマーを使用した二重乳化プロセスに基づいて調製される。より具体的には、積荷を含んだ水相を音波分散下で乳化させて乳剤を形成するためにまず、カルボキシル基を末端とするＰＬＧＡのジクロロメタン（ＤＣＭ）中の溶液が使用される。こうして形成される乳剤はその後、外側の水相中で流体分散（fluidic dispersion）を使用して乳化される。

二重乳化プロセスにおいて、ポリマー濃度及び分散力を調整すること、あるいは規定の長さ及び際立った極性のポリマーを使用することにより、上述の調製方法は、３０～６００ｎｍ、例えば３０～４０ｎｍ及び１００～６００ｎｍの外径を備えた中空ポリマーナノ粒子を提供することができる。

ナノ粒子は、水‐油‐水型の二重乳化プロセスに基づいて調製され、溶媒系に溶解されたポリマーがまず、水相を乳化するのに使用される。乳剤はその後、第２の水相によって乳化される。内側及び外側の水相は、任意の極性溶液、例えば水、酢酸、及びエタノールであってもよい。水相は、溶液の酸性度及び粘度を調節するための可溶化された分子を含有し、該分子としてリン酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムが挙げられる。一実施形態において、水は、貧溶媒としてナノ粒子の調製に使用される。

本発明のポリマーナノ粒子を調製するための上述の水‐油‐水型の二重乳化方法は、２つの重要な特徴、すなわち、（ｉ）異なる相の間での乳化は、界面活性剤、例えば、ビタミンＥ‐Ｄ‐αトコフェロールポリエチレングリコールスクシナート及びポリビニルアルコールを使用することよりも、極性の対比がもともと大きいポリマー（カルボキシル末端基を備えたＰＬＧＡ）によって達成され、このことがポリマーシェルの厚さを最小限にする乳化能力を増強し、かつ界面活性剤材料の使用を伴うことなく高い商品価値を有するということと、（ｉｉ）油相の均質化と、カプセル化された積荷の内側水相中への保持との平衡を保つために、第２の乳化プロセスについてマイクロフルイダイザー又は音波処理のいずれかを使用する制御された流体分散とを有する。

上記方法によって調製されるポリマーナノ粒子は、薬物送達、セラノスティクス、及びワクチン開発の用途のためのプラットフォーム技術としての役割を果たす。該粒子は、小分子、ペプチド、核酸、及びタンパク質を含む広範な種類の生物活性剤の送達を促進して、同剤の治療的効力を増強することができる。薄肉シェル型のポリマー中空ナノ粒子は、生物活性剤、例えば、限定するものではないが小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、造影剤、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、及び前記のものの任意の組み合わせをカプセル化するために使用可能である。該プラットフォームの表面は、任意選択で、長期循環型薬物送達、標的型薬物送達、及び抗原送達のような様々な用途のために、機能性の構成部分、例えば小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、造影剤、ナノ粒子を用いて装飾されることが可能である。

さらに詳述しなくとも、当業者であれば、上記説明に基づいて本発明を最大限利用することができると考えられる。したがって、以降の具体的な実施例は、単に例示のために過ぎず、本開示の残りの部分を一切どのようにも限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書中で引用された全ての文献は参照により本願に組込まれる。

ポリマーナノ粒子の調製
薄肉シェル型のポリマーナノ粒子を以下のステップを含むプロトコルに従って生産した。

１． ＤＣＭ中に１０ｍｇ／ｍＬのカルボキシ末端ＰＬＧＡポリマーを調製するステップ。
２． 生物活性剤を含有している５０ｕＬの内側水相を５００ｕＬのＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液中に乳化させて第１の乳剤を形成するステップ。５０％の音波処理振幅で３０秒間、連続的にプローブ音波処理を行う。

３． 第１の乳剤を５ｍＬの水性溶液中に乳化させ、該混合物を、マイクロフルイダイザーを使用して制御された流体剪断の下で分散させて第２の乳剤を形成するステップ。
４． 第２の乳剤にさらに３０ｍＬの水性溶液を加え、溶媒を３５℃で蒸発させるステップ。

５． 換気フード内で３時間にわたりＤＣＭを蒸発させて溶液を得るステップ。
６． ２２ｋＧで３５分間の超遠心分離処理により溶液から粒子を分離するステップ。
７． 粒子を所望の溶液中に再分散させるステップ。

ポリマーナノ粒子の特性解析及びカプセル化
上述のステップを使用することにより、１１０．９ｎｍの平均直径を備えた中空のポリマーナノ粒子を調製した。粒子のシェル厚の統計平均は、ナノ粒子トラッキング解析によって得られたパラメータに基づいて導き出された。結果として生じたナノ粒子の総ポリマー重量、ＰＬＧＡ密度、及び数に基づいて、ナノ粒子が統計平均で１６．５ｎｍのシェル厚を有していることが算定された。予想外なことに、ある種のポリマーナノ粒子は４０ｎｍ未満の直径を有していた。

薄肉シェル型の中空ナノ粒子は、不透水性のポリマーシェルにより浸透圧に抵抗性であることが見出された。試験では、親水性の食紅をカプセル化している１００ｎｍの中空ナノ粒子を、水から３×ＰＢＳまでの溶液中に懸濁させたが、浸透圧モル濃度の差異（０～８５０Ｏｓｍｏ／ｋｇ）は、中空ナノ粒子がその積荷を放出する原因にはならなかった。それぞれの溶液中で１０分間のインキュベーションの後、ナノ粒子を３０，０００ｇ、５分間の遠心分離処理でペレット化し、結果として生じたペレットは、同様の赤みがかった色を呈し、粒子中の親水性色素の保持を示していた。吸光度法に基づく放出された色素についての上清の調査では、検出可能なシグナルが示されなかった。この研究から、２０ｎｍ未満の薄いポリマーシェルを有するにもかかわらず、中空ナノ粒子は、該粒子を浸透ストレスに対して抵抗性とする欠損の無いシェルを有することが示される。

薄肉シェル型の中空ナノ粒子のシェルが流体ではなく固体であったことをさらに実証するために、シェルを破壊するための機械的ストレスに中空ナノ粒子を供した。クライオＥＭによる視覚化では、破壊された中空ナノ粒子が観察された。破壊された中空ナノ粒子の観察像は、機械的な摂動を受けると小胞の再編成を行うポリマーの小胞とは対照的に、固体のシェルを備えた中空球を示した。この固体のポリマーシェルは、既知の中空ナノ構造体では観察されなかった不透水性及び浸透圧抵抗性をもたらした。

薄肉シェル型のポリマーナノ粒子プラットフォームの卓越した特徴は、その大きな水性の内部空間を用いて大量の親水性の積荷をカプセル化する、その収容能力である。薄肉シェル型の中空ナノ粒子を、いくつかの生物活性剤、例えばｓｉＲＮＡ及び免疫アジュバントの環状ジＧＭＰなどをカプセル化するために用いた。予想外なことに、高いカプセル化効率が、様々な長さスケールの親水性内容物、例えば小分子（例えば、スルホｃｙ５、環状ジＧＭＰ、及び環状ｃＧＡＭＰ）、ペプチド（例えば、オボアルブミンペプチドＯＴＩ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）又はＯＴＩＩ（ＡＡＨＡＥＩＮＥＡ））、核酸（例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ、及び２０ｍｅｒのｓｉＲＮＡ）、並びにタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）などについて達成され、これらはその化合物の溶解限度内で３０％を上回る効率でのカプセル化に成功した。例えば、ｓｉＲＮＡは５０％の効率でカプセル化されてナノ粒子１ｍｇ当たり約１ｎｍｏｌの最終装荷量を生じ、また環状ジＧＭＰは３７％の装荷効率でカプセル化された。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ遺伝子のサイレンシングは、ｓｉＲＮＡを装荷された薄肉シェル型の中空ナノ粒子を使用して観察された。

実施例１： 親水性の巨大分子を用いたポリマーナノ粒子のカプセル化
２つの親水性の巨大分子、すなわち核酸（色素で標識された２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ）及びタンパク質（色素で標識されたＢＳＡ）についてのポリマーナノ粒子のカプセル化効率を評価するためにアッセイを実施した。

図１のＡ～Ｄは、核酸及びタンパク質についてのポリマーナノ粒子のカプセル化効率を示している。
Ａ： 空のナノ粒子（左）、色素で標識されたＤＮＡを装荷したナノ粒子（中央）、色素で標識されたウシ血清アルブミンを装荷したナノ粒子（右）を、超遠心分離処理によってペレット化した後に観察したもの。特有の色が付いたペレットは、ＤＮＡ及びＢＳＡタンパク質のカプセル化の成功を示している。

Ｂ： クライオＥＭによって視覚化された空のナノ粒子。
Ｃ： クライオＥＭによって視覚化された、ＤＮＡを装荷したナノ粒子。
Ｄ： クライオＥＭによって視覚化された、ＢＳＡタンパク質を装荷したナノ粒子。ナノ粒子内部の非常に粒子の大きいテクスチャを通して、有効なＤＮＡ及びタンパク質の装荷を観察することが可能であった。

この研究では、核酸及びタンパク質の有効なカプセル化が、色素で標識された２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ（図１Ａ；中央）及び色素で標識されたＢＳＡ（図１Ａ；右）を使用して実証された。ナノ粒子をペレット化すると、該粒子ペレットは、空のナノ粒子の白色のペレット（図１Ａ；左）とは対照的に黄色に着色されている（黄色がかったＦＡＭ色素標識を示す）ことが見出された。蛍光定量化により、ナノ粒子が予想外にも核酸及びタンパク質についてそれぞれ４２％及び３５％のカプセル化効率を示したことが分かる。

核酸及びタンパク質の有効なカプセル化について、クライオＥＭを使用してさらに視覚化した。空の粒子はその水性コアにおいて無模様で一様なテクスチャを示したが（図１Ｂ）、ＤＮＡを装荷した粒子（図１Ｃ）及びＢＳＡを装荷した粒子（図ＩＤ）は、クライオＥＭにおける濃縮された生物内容物の特性である、非常に粒子の大きいテクスチャを示した。本実施形態についての８ｍＭのＤＮＡ及び５０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡという装荷濃度に基づくと、ＤＮＡを装荷したナノ粒子は約３５００個のＤＮＡ分子を含有し、ＢＳＡを装荷したナノ粒子は約２６０個のタンパク質を含有していた。重要なことであるが、核酸及びタンパク質のそのような高い装荷量は従来達成されていなかった。実際、既知のＰＬＧＡ系のナノ製剤は一貫して非常に貧弱な核酸カプセル化を示し、装荷量を高めるためには核酸の負電荷を中和するためにポリカチオン性ポリマーを使用しなければならなかった。例えば、シャイ（Shi）ら、アンゲヴァンテ・ケミー・インテルナチオナール・エジチオン英語版（Angew Chem Int Ed Engl）、２０１１年、第５０巻、第３１号、ｐ．７０２７－３１、及びウッドロー（Woodrow）ら、ネイチャー・マテリアルズ（Nature Materials）、２００９年、第８巻、第６号、ｐ．５２６－５３３を参照されたい。

上述したこれらの結果から、本発明の薄肉シェル型ポリマーナノ粒子がその本来の溶解状態において親水性の巨大分子について高いカプセル化効率（すなわち高い装荷効率）を予想外にも示したことが分かり、薄肉シェル型の中空ナノ粒子の利点及び独自性が明らかである。

実施例２： ＲＮＡ干渉のための細胞へのｓｉＲＮＡの送達に対するポリマーナノ粒子の効果
ＲＮＡ干渉のための細胞へのｓｉＲＮＡの送達に対するポリマーナノ粒子の効果を評価するためにアッセイを実施した。

図２のＡ～Ｃは、ｓｉＲＮＡ‐ＧＦＰを用いた細胞取込み及びＧＦＰのノックダウンを示す。
Ａ： Ｈｅｌａ細胞による２４時間のスルホＣｙ５ ＮＰの取込み及びＤＡＰＩを用いた核の染色。画像は共焦点顕微鏡によって得られた。

Ｂ： 様々な処理後の細胞におけるＧＦＰシグナル。Ｈｅｌａ‐ＧＦＰ細胞を、ｓｉＲＮＡ‐ＧＦＰ‐ＮＰ（１００、３００及び１０００ｕｇ／ｍｌ ＰＬＧＡ）で２４時間処理した。リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを用いてトランスフェクションされた細胞、及び空のＮＰとともにインキュベーションされた細胞は対照としての役割を果たした。

Ｃ： ２４時間処理におけるｓｉＲＮＡ‐ＧＦＰ‐ＮＰの用量応答。ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡへと逆転写した。ＧＦＰのｍＲＮＡレベルをｑＲＴ‐ＰＣＲによって計測し、グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。

この研究において、ナノ粒子プラットフォームは、ＲＮＡ干渉のために細胞にｓｉＲＮＡを首尾よく送達することが実証された。細胞内のナノ粒子の内在化を追跡するために、スルホＣｙ５を装荷したＰＬＧＡナノ粒子を使用して細胞取込み実験を最初に実施した。Ｈｅｌａ細胞をスルホＣｙ５ ＮＰで２４時間処理し、核をＤＡＰＩで染色し、画像を共焦点顕微鏡によって得た。２４時間のインキュベーションの後、スルホＣｙ５ ＮＰは細胞に取り込まれて細胞質に蓄積した（図２Ａ）。次に、ｓｉＲＮＡを装荷したナノ粒子が標的遺伝子の発現を特異的にノックダウンできたかどうかを、Ｈｅｌａ‐ＧＦＰ細胞で試験した。ＧＦＰ配列に対するｓｉＲＮＡを薄肉シェル型のポリマーナノ粒子中にカプセル化し、細胞とともに２４時間及び７２時間混合した。ＲＮＡｉＭａｘリポフェクタミンによってｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、陽性対照としての役割を果たした。表示された時点において、細胞を蛍光顕微鏡によって撮像し（図２Ｂ）、次に全ＲＮＡをトリゾール（Trizol）試薬によって抽出した。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとし、ＧＦＰのサイレンシングをｑＲＴ‐ＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。ＧＦＰのｍＲＮＡレベルは、リポフェクタミンによるトランスフェクションを用いると２４時間後に５％までノックダウンされた。１００、３００、及び１０００ｕｇ／ｍｌのナノ粒子で処理された細胞は、それぞれ７０％、３０％、及び４％への、ＧＦＰのｍＲＮＡレベルの用量依存的な低減を示した（図２Ｃ）。高濃度のナノ粒子は、良く知られた市販製品のリポフェクタミンと同様のノックダウン効率を示した。重要なことに、細胞毒性現象は、ｓｉＲＮＡ‐ＧＦＰ‐ＮＰで処理された細胞では最も高濃度の１０００ｕｇ／ｍｌ ＰＬＧＡ量でも観察されず、このプラットフォームの優れた安全性が示された。

これらの結果から、ポリマーナノ粒子がＲＮＡ干渉のための細胞へのｓｉＲＮＡの送達について高い効率を示したことが分かる。
実施例３： リンパ節における免疫刺激のためのインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストのカプセル化及び制御放出に対するポリマーナノ粒子の効果
リンパ節における免疫刺激のためのＳＴＩＮＧアゴニストのカプセル化及び制御放出に対するポリマーナノ粒子の影響を評価するためにアッセイを実施した。

図３のＡ～Ｅは、免疫刺激のためのＳＴＩＮＧアゴニストのカプセル化及び制御放出に対するポリマーナノ粒子の効果を示している。
Ａ： アジュバントを装荷した薄肉シェル型の中空ナノ粒子の調製。

Ｂ： ナノ粒子トラッキング解析により計測されるようなナノ粒子の大きさ。
Ｃ： グラジエントＨＰＬＣによって実証されるような環状ジＧＭＰのカプセル化。
Ｄ： 薄肉シェル型の中空ナノ粒子のクライオＥＭによる視覚化。

Ｅ： 積荷の放出についての研究から、ｐＨを感知して引き起こされるナノ粒子の放出プロファイルが明らかとなった。
この研究では、本発明のプラットフォームをワクチン開発に適用した。ナノ粒子ワクチンの調製における主な技術的難関は、ナノスケールの基材上に抗原及びアジュバントを確実に関連付けることにある。例えば、ブラノン‐ペパス（Brannon-Peppas）ら、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Adv Drug Deliv Rev）、２００４年、第５６巻、第１１号、ｐ．１６４９－５９、及びリマ‐テノリオ（Lima-Tenorio）ら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（Int J Pharm）、２０１５年、第４９３巻、第１－２号、ｐ．３１３－２７を参照されたい。この技術的難関を克服するために、薄肉シェル型のポリマー中空ナノ粒子を、生分解性ポリマーすなわちＰＬＧＡを使用する高密度の機能的積荷のパッケージングに使用した。

より具体的には、直径１００～２００ｎｍの中空の粒子を、二重乳化プロセスを使用して調製した（図３Ａ及び図３Ｂ）。該粒子は、ＳＴＩＮＧアゴニストアジュバントである環状ジＧＭＰ（ｃｄ‐ＧＭＰ）を約４０％の効率で効率的にカプセル化したが（図３Ｃ）、これは、核酸及び親水性の積荷がナノ粒子プラットフォーム中にカプセル化するのは困難であることで有名であるので、注目すべきことである。この高いカプセル化効率は、１個のナノ粒子当たりおよそ２，０００個のＳＴＩＮＧアゴニスト分子をもたらした。ポリマーナノ粒子を基にしたＳＴＩＮＧアゴニストのナノ製剤は報告されていない。クライオＥＭによる調査から、これらの中空ナノ粒子の中の大きな内部コアが明らかとなり、このコアがｃｄ‐ＧＭＰの高い装荷効率の原因であった（図３Ｄ）。細胞内送達されると、中空ナノ粒子の薄いポリマーシェルは酸性のｐＨが引き金となって内部の内容物を急速に放出した（図３Ｅ）。

これらの結果は、薄肉シェル型のポリマーナノ粒子が合成ワクチンの有効な調製を可能にしたことを指し示している。
実施例４： リンパサイトカインを増強すると同時に全身性サイトカインを最小限にすることに関するＳＴＩＮＧアゴニストが装荷されたナノ粒子の評価
リンパサイトカインを増強すると同時に全身性サイトカインを最小限にすることに関して、ＳＴＩＮＧアゴニストが装荷されたナノ粒子を評価するためにアッセイを実施した。

図４のＡ～Ｆは、リンパサイトカインを増強すると同時に全身性サイトカインを最小限にすることに関しての、ＳＴＩＮＧアゴニストが装荷されたナノ粒子を描写している。
Ａ： ｃｄ‐ＧＭＰナノ粒子及び遊離ｃｄ‐ＧＭＰとともにインキュベーションした後のマウス樹状細胞株におけるＴＮＦ‐αの誘導。

Ｂ： 同じマウス樹状細胞株におけるＩＬ‐６の誘導。
Ｃ： マウス樹状細胞株におけるＩＦＮ‐βの誘導。
Ｄ： 遊離分子の形態及びナノ粒子製剤中の等用量のｃｄ‐ＧＭＰとともにインキュベーションした際のＪＡＷＳＩＩの活性化。

Ｅ： 遊離ｃｄ‐ＧＭＰ又はナノ粒子ｃｄ‐ＧＭＰのフットパッド注射後４８時間におけるリンパ節ＩＦＮ‐βの定量化。
Ｆ： 遊離ｃｄ‐ＧＭＰ及びナノ粒子ｃｄ‐ＧＭＰのフットパッド注射後における全身性ＴＮＦ‐αのレベル。

ｃｄ‐ＧＭＰを装荷したナノ粒子による免疫活性化について、マウス樹状細胞株ＪＡＷＳＩＩを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでまず調べた。遊離ｃｄ‐ＧＭＰ又はｃｄ‐ＧＭＰナノ粒子のいずれかとともに２４時間インキュベーションした後、培養上清を、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、及びＩＦＮ‐βのレベルを定量化するためのＥＬＩＳＡ分析用に収集した。遊離ｃｄ‐ＧＭＰ製剤と比較して、ナノ粒子製剤は、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、及びＩＦＮ‐βの産生をより有効に引き起こした（図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃ）。細胞上のＣＤ８０発現も、等用量の遊離ｃｄ‐ＧＭＰに比べてナノ粒子製剤とともにインキュベーションしたときに増強された（図４Ｄ）。ナノ粒子は、ナノ担体による細胞内送達の増大に起因して、ＳＴＩＮＧアゴニストのアジュバント活性を約３０倍増強することが観察された。遊離の環状ジ‐ヌクレオチドは容易には細胞膜を透過することはできず、かつその細胞質ゾルの標的に容易には接近できないと推測することが可能である。ナノ粒子カプセル化がなされると、細胞取込みが粒子エンドサイトーシスによって増強され、その後の細胞内放出はｃｄ‐ＧＭＰが細胞質ゾルに入るのを容易にし、これによりその免疫を強化する効果が増強される。

ｃｄ‐ＧＭＰナノ粒子による免疫強化についてさらに、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで遊離ｃｄ‐ＧＭＰと比較した。フットパッド注射の４８時間後に、膝窩の流入領域リンパ節をＩＦＮ‐βの定量化のために収集した。ナノ粒子製剤はリンパ節において著しく高いレベルのＩＦＮ‐βを誘導することが観察されたが（図４Ｅ）、このことは適切なＴ細胞成熟にとって重要である。加えて、反応原性の指標であるＴＮＦ‐αの全身レベルも、遊離ｃｄ‐ＧＭＰ及びｃｄ‐ＧＭＰナノ粒子のフットパッド投与後にモニタリングした。ナノ粒子はＴＮＦ‐αの著しく低い血清中レベルを生じることが観察されたが、これはリンパ系におけるナノ粒子の分布を反映している。他方、遊離ｃｄ‐ＧＭＰは血清中ＴＮＦ‐αレベルの上昇を引き起こし、かつこれらの小分子は血流中へと自由に拡散することも考えられる（図４Ｆ）。

これらの結果は、ＳＴＩＮＧアゴニストを装荷したナノ粒子がリンパ節を標的とした免疫強化のためのリンパサイトカインを有効に増強したことを示している。
実施例５： ナノ粒子ワクチンの調製及び評価
抗原／ナノ粒子結合を介してナノ粒子ワクチンを調製し、かつそのようにして調製されたナノ粒子ワクチンを評価するためにアッセイを実施した。

図５のＡ～Ｆは、抗原／ナノ粒子結合を介したナノ粒子ワクチンの調製を示している。
Ａ： 官能化されたナノ粒子と抗原との間の自発的結合によるウイルス模倣型ナノ粒子ワクチンの調製。

Ｂ： ＢＣＡアッセイによる抗原含量の定量化。
Ｃ： 動的光散乱により計測されるような抗原コンジュゲーション前後のナノ粒子の大きさ。

Ｄ： タンパク質コンジュゲーション前後の、ナノ粒子でカプセル化されたｃｄ‐ＧＭＰの定量化。
Ｅ： 抗原コンジュゲーションの後のナノ粒子のクライオＥＭによる視覚化。

Ｆ： ウイルス抗原に対する免疫金染色は、ナノ粒子上への抗原コンジュゲーションの成功を立証している。
ｃｄ‐ＧＭＰを装荷した薄肉シェル型のポリマーナノ粒子を使用して、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ）用に、ＭＥＲＳ‐ＣｏＶスパイクタンパク質のレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いてナノ粒子ワクチンを調製した。無血清に順化させたＳｆ２１昆虫細胞でＲＢＤを発現させ、抗ＭＥＲＳ‐ＣｏＶ ＲＢＤポリクローナル抗体及び抗‐Ｈｉｓ抗体を使用してウェスタンブロット法により確認した。３５ｋＤａのＲＢＤタンパク質の純生成物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーのＨｉｓトラップカラムによる精製の後に得ることができる。抗原／ナノ粒子結合を可能にするために、ｃｄ‐ＧＭＰを装荷したナノ粒子を、マレイミド末端を有する表面リンカーを備えて最初に調製したが、該リンカーは利用可能なチオール基との共有結合を自然に形成するものであった（図５Ａ）。精製されたＲＢＤタンパク質をその後、ジスルフィド結合を遊離チオールへと還元する穏やかな還元剤（トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン）で処理した。還元されたＲＢＤタンパク質をその後、マレイミドで官能化されたナノ粒子とともに温和な混合の下で４時間混合した。ＲＢＤがコンジュゲートしたナノ粒子を、３０，０００×ｇでの遠心分離処理により遊離タンパク質から分離した。ナノ粒子を収集すると、ＢＣＡアッセイにより、結果として生じたナノ粒子が抗原投入量の約２０％を含有する（１粒子当たり約２０個のタンパク質抗原に相当する）ことが明らかとなった（図５Ｂ）。動的光散乱は、ナノ粒子がタンパク質コンジュゲーションの後に直径が１５０ｎｍから１７９ｎｍへと増大したことを示し（図５Ｃ）、粒子の全体的な流体力学的大きさを増大させる抗原／粒子結合の成功が示唆された。

図６のＡ～Ｃは、上述のナノ粒子ワクチンの評価を示すものである。
Ａ： ワクチン評価のためのワクチン接種スケジュール。
Ｂ： 追加免疫のワクチン接種後２週間である３５日目における、抗ＲＢＤ ＩｇＧ全体の力価の定量。

Ｃ： ３５日目における抗ＲＢＤ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの力価の定量。
抗原特異的なＩｇＧ抗体応答を評価し、遊離ｃｄ‐ＧＭＰと混合した遊離抗原及びＭＦ５９と混合した遊離抗原を含めた他のワクチンナノ粒子と比較した。マウスに、上述の様々なワクチンナノ粒子を０日目及び２１日目に接種し、すべての免疫化マウスの血清を３５日目にＥＬＩＳＡ分析用に収集した（図６Ａ）。予想外なことに、合成ナノ粒子は全ての群の中で有意に高いレベルの抗体力価を引き起こした（図６Ｂ）。注目すべきは、Ｔｈ１免疫応答の指標であるＩｇＧ２ａのレベルもナノ粒子の接種後に増大したことである（図６Ｃ）。

この結果は、ナノ粒子プラットフォームが、体液性応答を高めるのに優れた利点を示すナノ粒子ワクチンの調製を可能にしたことを実証している。
実施例６： ＣＤ８抗原及びＳＴＩＮＧアゴニストを同時にカプセル化しているナノ粒子の、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導についての評価
ＣＤ８抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）及びＳＴＩＮＧアゴニストを同時にカプセル化しているポリマーナノ粒子の、抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答の促進に対する効果を評価するためにアッセイを実施した。

図７のＡ～Ｃは、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド及びＳＴＩＮＧアゴニストを同時にカプセル化しているポリマーナノ粒子の、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答の促進に対する効果を示している。

Ａ： ＳＩＮＮＦＥＫＬペプチド及びＳＴＩＮＧアゴニスト（ｃｄ‐ＧＭＰ）を同時にカプセル化しているナノ粒子。
Ｂ： ナノ粒子による免疫化後７日目におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の細胞数頻度。

Ｃ： 様々な用量のｃｄ‐ＧＭＰを含有するナノ粒子を用いた免疫化後の多機能性（ＩＦＮｇ＋ＴＮＦ＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞の定量化。
ポリマーナノ粒子によって誘導される抗原特異的な細胞性免疫を評価するために、３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＯＶＡ２５７‐２６４ Ｈ２‐Ｋｂ拘束性ペプチドであるＳＩＩＮＦＥＫＬ（マウス１匹当たり８μｇ）及び様々な量のｃｄ‐ＧＭＰ（マウス１匹当たり０．４、２、又は１０μｇ）を含有するナノ粒子（図７Ａ）を用いて皮下投与経路で免疫化した。マウスを免疫化の７日後に安楽死させ、細胞内サイトカイン染色によりＣＤ８＋Ｔ細胞応答を分析するために脾臓を採取した。ナノ粒子により、ｃｄ‐ＧＭＰ用量依存的に抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生が誘導されることが観察された（図７Ｂ）。更に、より大量のｃｄ‐ＧＭＰを投与されているマウスほど、より大きい多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図７Ｃ）。

これらの結果は、本発明のポリマーナノ粒子が抗原特異的なＴ細胞免疫の促進において高い効力を発揮したことを示している。上記結果はさらに、積荷のカプセル化を、ナノ粒子中でペプチド及び核酸を様々な量で組み合わせることにより調節することもありうることを実証している。

実施例７： 生物活性剤が装荷された多数の水性コアを備えた薄肉シェル型のポリマーナノ粒子の調製
２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡが装荷された多数の水性コアを備えた薄肉シェル型のポリマーナノ粒子を調製するためにアッセイを実施した。

図８は、ポリマーの薄肉シェルによって包み込まれた多数の水性コアを備えた薄肉シェル型のポリマーナノ粒子を示している。各々のコアには濃い粒状のテクスチャを示すＤＮＡが装荷された。

薄肉シェル型のポリマーナノ粒子の内部の水性コアの数を、上述の第１及び第２の乳剤の形成時に分散の程度を制御することにより調節可能であることが分かった。多数の水性コアを含有するナノ粒子を調製するために、マイクロフルイダイザーにおける流体圧力を、単一の乳剤小滴当たり多数の水相を備えているより大きな水／油／水型乳剤を提供するように低減した（２０００ｐｓｉ（１３．７９ＭＰａ））。溶媒蒸発に続いて、クライオＥＭによる視覚化から、多数の水性コアを含有している薄肉シェル型のポリマーナノ粒子が示された（図８）。各々の水性コアは、厚さ２０ｎｍ未満のポリマーの薄肉シェルによって包まれていた。ＤＮＡを用いたカプセル化が行われたポリマーナノ粒子のクライオＥＭ像から、水性コア各々の中の濃い粒状のテクスチャが明らかとなったが、これは積荷のカプセル化の成功を示している（図８）。

この結果は、本発明のポリマーナノ粒子が多数の水性コアを有し、その各々が生物活性剤をカプセル化していることを実証している。
その他の実施形態
本明細書中に開示された特徴はすべて、任意の組み合わせで兼備されることができる。本明細書中に開示された特徴はそれぞれ、同一、等価、又は類似の目的に役立つ別の特徴に置き換えることができる。よって、そうでないことが特に明示されないかぎり、開示された特徴はそれぞれ、包括的な一連の等価又は類似の特徴の一例にすぎない。

上記の説明から、当業者は本発明の本質的特性を容易に確認することが可能であり、かつ、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び状況に本発明を適応させるために本発明の様々な変更及び改変を行うことが可能である。例えば、本発明の化合物に構造上類似している化合物を作製し、オピオイド受容体に対する該化合物の調節活性について、及びオピオイド受容体に関連する状態の治療について、スクリーニングすることも可能である。よって、他の実施形態も特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (20)

1. 生物活性剤をカプセル化するためのポリマーナノ粒子であって、
   不透水性のポリマーシェルと、
   該ポリマーシェルによって包まれた１以上の水性コアであって、各々が生物活性剤を含有している１以上の水性コアとを含んでなり、前記ポリマーシェルが２５ｎｍ未満の厚さを有し、前記ポリマーナノ粒子が３０～６００ｎｍの外径を有し、
   前記ポリマーシェルは、無極性のセグメント及び極性の末端基を含むポリマーで形成されており、
   前記無極性のセグメントはポリ乳酸‐グリコール酸共重合体であり、
   前記極性の末端基はカルボン酸である、ポリマーナノ粒子。
2. 前記ポリマーシェルは８～２０ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
3. 前記ポリマーナノ粒子は４０ｎｍ未満の外径を有する、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
4. 前記ポリマーナノ粒子は１００ｎｍを超える外径を有する、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
5. 前記水性コアは、前記ポリマーナノ粒子の外径の７０％を超える直径を有する、請求項４に記載のポリマーナノ粒子。
6. 前記水性コアは、前記ポリマーナノ粒子の外径の８０％を超える直径を有する、請求項５に記載のポリマーナノ粒子。
7. 前記ポリマーナノ粒子は、８４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又はそれ以上の浸透圧抵抗を有する、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
8. 前記生物活性剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、造影剤、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、及びこれらの組み合わせで構成される群から選択される、請求項１に記載のポリマーナノ粒子。
9. 前記生物活性剤は、２０％を超えるカプセル化効率を有する、請求項８に記載のポリマーナノ粒子。
10. 前記生物活性剤は、３０％を超えるカプセル化効率を有する、請求項９に記載のポリマーナノ粒子。
11. 前記生物活性剤は、４０％を超えるカプセル化効率を有する、請求項１０に記載のポリマーナノ粒子。
12. 前記生物活性剤はｓｉＲＮＡ又は環状ジＧＭＰである、請求項８に記載のポリマーナノ粒子。
13. 疾患を治療するための医薬の製造における、生物活性剤をカプセル化しているポリマーナノ粒子の使用であって、該ポリマーナノ粒子は、不透水性のポリマーシェルと、該ポリマーシェルによって包まれた１以上の水性コアであって、各々が生物活性剤を含有している１以上の水性コアとを備え、前記ポリマーシェルが２５ｎｍ未満の厚さを有し、前記ポリマーナノ粒子が３０～６００ｎｍの外径を有し、
    前記ポリマーシェルは、無極性のセグメント及び極性の末端基を含むポリマーで形成されており、
    前記無極性のセグメントはポリ乳酸‐グリコール酸共重合体であり、
    前記極性の末端基はカルボン酸である、使用。
14. 前記ポリマーシェルは８～２０ｎｍの厚さを有し、前記ポリマーナノ粒子は１００ｎｍを超える外径を有する、請求項１３に記載の使用。
15. 前記疾患は、心血管疾患、がん、自己免疫疾患、又は感染症である、請求項１３に記載の使用。
16. 前記生物活性剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、造影剤、無機ナノ粒子、有機ナノ粒子、及びこれらの組み合わせで構成される群から選択される、請求項１３に記載の使用。
17. 前記生物活性剤はｓｉＲＮＡ又は環状ジＧＭＰである、請求項１６に記載の使用。
18. 請求項１に記載のポリマーナノ粒子を調製する方法であって、
    ポリマーを溶媒に溶解させてポリマー溶液を形成するステップと、
    生物活性剤を含有する第１の水性溶液中で前記ポリマー溶液を分散により乳化させて乳剤を形成するステップと、
    そのようにして形成された乳剤を第２の水性溶液中で流体分散により乳化させてポリマーナノ粒子を得るステップと、
    そのようにして得られたポリマーナノ粒子を収集するステップと
    を含んでなり、前記ポリマーが無極性のセグメント及び極性の末端基を含み、前記流体分散がマイクロフルイダイザーを使用することにより制御された方式で行なわれることを特徴とする方法。
19. 前記溶媒は、ジクロロメタン、ベンジルアルコール、酢酸エチル、クロロホルム、及びこれらの組み合わせで構成される群から選択される無極性溶媒である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第１及び第２の水性溶液はそれぞれ、リン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、スクロース、デキストラン、及びこれらの組み合わせで構成される群から選択されるモジュレータを含有する、請求項１８に記載の方法。

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