TWI663991B - 薄殼聚合物奈米粒子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種聚合物奈米粒子，其外直徑之尺寸為30-600nm，且含有厚度少於25nm且不透水的聚合物殼、一或多個由該聚合物殼封閉之含水核，以及包覆於每一該一或多個含水核中的生物活性劑。本發明亦揭露一種製備該聚合物奈米粒子之方法及一種使用其治療疾病之方法。

Description

薄殼聚合物奈米粒子及其用途
聚合物奈米粒子在諸如藥物傳送之許多領域中作為活性劑之載體(即運送劑(cargo))具有廣泛之應用。然而，製造具大型含水內部之奈米粒子的困難性明顯限制了其涉及包覆親水性巨分子運送劑之應用。
現有聚合物奈米粒子通常為實心體，具有極少或無用於親水性運送包覆之內部含水核空間。已開發數種由聚合物殼組成之中空聚合物奈米粒子，但其等具有各種缺點，例如：尺寸限制、殼厚度及強度不符需求、及運送包覆效率不佳。
據此，存在開發一種用於傳送生物活性劑但不具上述缺點之新型載劑之需要。
本發明係關於用於包覆生物活性劑之聚合物奈米粒子。出乎預料地，本發明之聚合物奈米粒子證實用於某些具高裝載之生物活性劑之高包覆效率。
本發明之一態樣係用於包覆生物活性劑之聚合物奈米粒子。該聚合物奈米粒子包括：(i)不透水之聚合物殼及(ii)由該聚合物殼封閉 且包含該生物活性劑之一或多個含水核。該聚合物殼之厚度少於25nm(例如：8-20nm)，且該聚合物奈米粒子具有30-600nm(例如：30-40nm及100-600nm)之外直徑。
在一實例中，該聚合物奈米粒子之外直徑大於100nm且該含水核的直徑大於該聚合物奈米粒子之外直徑之70%(例如：>80%)。
一般而言，該聚合物奈米粒子之滲透阻力為840mOsm/kg或更高。
本發明之聚合物奈米粒子可用於包覆各種生物活性劑。生物活性劑之實例包括：小分子、胜肽、蛋白質、核酸(例如：siRNA或環狀di-GMP)、顯影劑、無機奈米粒子、有機奈米粒子、及其組合。該生物活性劑之包覆效率可大於20%(例如：>30%及>40%)。
一種治療疾病之方法亦屬於本發明之範疇。本方法包括向有需求之受試者施予上述包覆用於治療疾病之生物活性劑之聚合物奈米粒子。
本發明進一步涵蓋製備上述聚合物奈米粒子之方法。該方法包括以下步驟：(i)將聚合物溶於溶劑中以形成聚合物溶液，(ii)藉由將該聚合物溶液分散於包含生物活性劑之第一水溶液中來乳化以形成乳液，(iii)藉由將所形成之乳液流體分散在第二水溶液中來乳化以獲得聚合物奈米粒子，並(iv)收集所獲得之聚合物奈米粒子。重要的是該聚合物包含非極性區段及極性末端基。再者，藉由使用微流體均質機以受控方式進行流體分散。
一般情況下，用於以上製備方法之溶劑係非極性溶劑。該溶劑之實例包括(但不限於)：二氯甲烷、苯甲醇、乙酸乙酯、氯仿、及含有任 何莫耳比例之上述溶劑的混合物。
每一該第一及第二水溶液係可為極性溶液，其含有溶解分子(即調配物)以調節該溶液之酸度及黏度。該調配物之實例包括(但不限於)：磷酸鈉、碳酸氫鈉、Tris-HCl、蔗糖、聚葡糖及其組合。
在以下說明中提出本發明之細節。從以下圖式與數個具體實施例之實施方式，以及從隨附申請專利範圍也將明白本發明之其他特徵、目的、與優點。
第一圖描述用於核酸及蛋白質之聚合物奈米粒子之包覆效率。
第二圖描述細胞吸收及以siRNA-GFP靜默綠色螢光蛋白質(GFP)之效用。
第三圖描述聚合物奈米粒子對用於免疫刺激之干擾素基因刺激蛋白(STING)促效劑之包覆及受控釋放的效應。
第四圖描述載有STING促效劑奈米粒子增強淋巴結細胞激素同時最小化全身細胞激素之效用。
第五圖描述經由抗原/奈米粒子耦合以製備奈米粒子疫苗。
第六圖描述對於所製備之奈米粒子疫苗之評估。
第七圖描述針對該奈米粒子疫苗對細胞免疫反應之影響之評估。
第八圖描述含有多個裝載有生物活性劑之含水核之薄殼聚合物奈米粒子。
本文詳細揭露一種用於包覆一生物活性劑(例如治療劑或疫苗)之聚合物奈米粒子。
藥物及疫苗奈米技術對新型治療及疫苗配方之開發已有很大之影響。在醫藥開發上，奈米載體能達成精確藥物傳送以改善藥物治療指數、降低副作用、並促進多藥協同作用。在疫苗開發上，藉由改善其淋巴傳輸、達成多價抗原呈現、及促進抗原/佐劑結合，可加強奈米粒子的抗原免疫激活之能力。現今奈米粒子針對包覆親水性及巨分子運送劑方面仍然存在明顯之挑戰。本發明涉及能包覆生物活性劑(例如：親水性及巨分子運送劑)之聚合物奈米粒子。
該奈米粒子含有薄聚合物殼及由該聚合物殼封閉之一或多個含水核。
通常，該聚合物殼由含有非極性區段及極性末端基之兩親性聚合物形成。該非極性區段之實例包括(但不限於)聚(乳酸)、聚(乳酸共羥乙酸)(PLGA)、聚己內酯、及聚胺基甲酸酯。該PLGA可具有任何乳酸對羥乙酸之莫耳比(例如：50：50或75：25 PLGA)。該極性末端基可係負電荷基團、正電荷基團、兩性離子基團、或中性基團。該負電荷基團之實例包括羧酸、琥珀酸、及磺酸。該正電荷基團之實例包括胺及脒。該兩性離子基團之實例包括羧基甜菜鹼及磺基甜菜鹼。該中性基團之實例係醣。
一示例性聚合物殼由含有作為非極性區段之聚(乳酸共羥乙酸)及作為極性末端基之羧酸的聚合物形成。
本文所述之聚合物奈米粒子可為厚度25nm或更低之無缺陷聚合物殼的聚合物中空奈米粒子平台。中空聚合物奈米粒子之外直徑通常 在30與600nm間。
藉由將殼厚度最小化，該聚合物奈米粒子可形成具有能最大化該運送裝載之大型內部含水空間。對於外直徑高於100nm之粒子而言，該內部含水空間之直徑可具有至少80%之粒子外直徑或可具有含大收集體積之多個區間。在不含補充之結合分子下，薄殼中空奈米粒子證實親水性染料與核酸之高效包覆。該等薄殼奈米粒子證實對滲透壓具抗性，此係不透水之完整、無缺陷之聚合物殼所致之特徵。本發明之聚合物奈米粒子可用於傳送各種領域之生物活性劑，包括藥物傳送及疫苗開發。
聚合物奈米粒子，尤其是該等由生物可降解及生物相容性聚合物組成者(諸如聚(乳酸共羥乙酸)(PLGA))，在奈米藥物研究中因為聚合物之數個特徵(包括：生物相容性、生物可降解性、及合成靈活性)已廣泛受到注意。然而，由於該聚合物之固有的疏水性，以PLGA為基礎之奈米粒子在臨床上限制於傳送不溶水性化合物。聚合物奈米粒子中包覆親水性及巨分子運送物仍然是一項挑戰，其原因在於聚合物奈米粒子通常為實心球體而無空間搭載親水性及巨分子運送物(例如：siRNA)。
由於巨分子包覆常見於如病毒形式之天然奈米粒子，可設想理想之奈米載體應具有薄殼及含水空間以用於封裝生物活性分子。此外，此粒子之外殼應為無缺陷且不透水，以供當作可靠之運送包覆載體。
本發明涵蓋使用上述聚合物奈米粒子於治療醫學症狀之方法。該醫學症狀之實例包括(但不限於)心血管疾病、癌症、自體免疫疾病、或感染病。
本文詳細揭示一種製備上述聚合物奈米粒子之方法。
此發明之製程是利用雙乳化程序將末端具有高極性對比之兩親性聚合物，以製備薄殼中空奈米粒子。更特定而言，首先使用溶在二氯甲烷(DCM)中之羧基末端PLGA溶液，在音波分散下乳化含有運送物之水相以形成乳液。隨後在外部水相中使用流體分散，以乳化所形成之雙重乳液。
藉由在雙乳化程序中調節聚合物濃度及分散力或使用具界定長度及明顯極性之聚合物，上述之製備方法可提供外直徑為30與600nm之間(例如：30-40nm及100-600nm)之之中空聚合物奈米粒子。
該等奈米粒子基於水-油-水雙乳化程序製備，其中溶於溶劑系統中之聚合物首先用於乳化水相。隨後藉由第二水相乳化該乳液。該等內部及外部水相可具有任何極性溶液，例如：水、乙酸、及乙醇。該水相可包含溶解分子以調節該溶液之酸性及黏度，粒子包括但不限於磷酸鈉及碳酸氫鈉。在一具體實施例中，使用水作為用於奈米粒子製備之反溶劑。
上述用於製備本發明之聚合物奈米粒子之水-油-水雙乳化方法具有兩個主要特徵；即，(i)不同相間之乳化係經由具固有的高對比極性之聚合物(具羧基末端基之PLGA)，而非使用界面活性劑(例如：維生素E-D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(E-D-α-tocopherol polyethylene glycol succinate)及聚(乙烯醇)(poly(vinyl alcohol)))達成，其加強乳化能力以最小化聚合物殼厚度並具有較高商業價值，而不需使用界面活性劑材料；及(ii)使用微流體均質劑或音波對第二乳化製程進行受控流體分散以平衡油相之均質性及內部含水相中包覆運送物之滯留。
藉由上述方法製備之該聚合物奈米粒子作為用於藥物傳 送、診療、及疫苗開發應用之平台技術。其可有助於傳送許多種類之生物活性劑，包括：小分子、胜肽、核酸、及蛋白質以加強其治療能力。可使用該薄殼聚合物中空奈米粒子以包覆生物活性劑，包括(但不限於)小分子、胜肽、蛋白質、核酸、顯像劑、無機奈米粒子、有機奈米粒子、及以上之任何組合。該平台表面可視情況裝飾有功能基團，包括小分子、胜肽、蛋白質、核酸、顯影劑、奈米粒子，以用於不同應用，諸如：長效循環藥物傳送、標靶藥物傳送及抗原傳送。
未進一步地闡述，據信熟悉本技術者基於以上描述可最大程度地利用本發明。以下特定實例因此僅視為說明性而非以任何方式限制本揭露之其他部分。本文引用之全部公開案係以引用方式併入本文中。
聚合物奈米粒子之製備
根據包括以下步驟之方案製造薄殼聚合物奈米粒子：
1.製備在DCM中之10mg/mL之羧基封端PLGA聚合物。
2.在500uL之PLGA/DCM溶液中乳化50uL之含生物活性劑之內部含水相以形成第一乳液。在50%音波振幅下連續地進行探針音波達30秒。
3.在5mL水溶液中乳化第一乳液並使用微流體均質機在受控流體剪切下分散該混合物以形成第二乳液。
4.將額外之30mL之水溶液添加至該第二乳液並在35℃下蒸發溶劑。
5.在通風櫥中蒸發DCM達3小時以揮發油相溶劑。
6.藉由超離心機在22kG下進行35分鐘以分離粒子。
7.利用所需溶液分散該等粒子。
聚合物奈米粒子之特性及包覆
藉由使用上述之步驟，製備具110.9nm之平均直徑之中空聚合物奈米粒子。基於由奈米粒子追蹤分析所得之參數推導該粒子之殼厚度之統計平均。基於總聚合物重、PLGA密度、及所得奈米粒子數，計算得該等奈米粒子統計平均之殼厚度為16.5nm。出乎預料地，某些聚合物奈米粒子之直徑少於40nm。
發現該等薄殼中空奈米粒子由於該等不透水聚合物殼而具有抗滲透性。在一測試中，包覆親水性紅色食用色素之100nm中空奈米粒子懸浮在水至3倍PBS範圍內之溶液中，滲透壓差(在0至850Osmo/kg之間)未造成該等中空奈米粒子釋出其運送物。在其各別溶液中培養10分鐘後，在30,000g下離心5分鐘以粒化奈米粒子，且所得丸粒顯示相似、紅色色彩，表示親水性染料滯留在該等粒子中。基於吸光度法偵測釋放染料之上清液顯示無可測得之訊號。該研究顯示儘管具有低於20nm之薄聚合物殼，該等中空奈米粒子具有無缺陷之殼，其使該等奈米粒子對滲透壓具抗性。
為進一步證實該薄殼中空奈米粒子之殼為固體而非流體，對中空奈米粒子施加機械應力以破壞該殼。在低溫電子顯微鏡(cryo-EM)顯像中，觀察到破掉之中空奈米粒子。與在機械擾動後進行囊泡重組之聚合物囊泡相比，該破掉之中空奈米粒子之觀察影像指出具有固體殼之中空球體。該固體聚合物殼造成不透水性及抗滲透性，其等未在已知中空奈米結構中觀察到。
該薄殼聚合物奈米粒子平台之區別性特徵係其以大內部含水空間包覆大量親水性運送物之容量。將該等薄殼中空奈米粒子包覆數種生物活性劑，包括siRNA及免疫佐劑環狀di-GMP。出乎預料地，針對各種長度標度之親水性含量達到高包覆效率，包括小分子(例如：磺基-cy5、環狀di-GMP、及環狀cGAMP)、胜肽(例如：卵白蛋白肽OTI(SIINFEKL)或OTII(AAHAEINEA))、核酸(例如：CpG-寡脫氧核苷酸、20-聚體單股DNA、及20-聚體siRNA)、及蛋白質(例如：牛血清白蛋白(BSA)及CRISPR-Cas9核酸酶)，其成功地在該化合物之溶解性限制下以高於30%之效率包覆。例如，在50%之效率下以每mg奈米粒子約1nmol之最終裝載量包覆siRNA，且以37%之裝載效率包覆環狀di-GMP。觀察到使用載有siRNA之薄殼中空奈米粒子讓GFP表現HeLa細胞中之綠色螢光蛋白質(GFP)基因靜默。
實施例1：包覆有親水性巨分子之聚合物奈米粒子
進行檢驗以評估針對兩種親水性巨分子(即：核酸(染料標記之20-聚體單股DNA)及蛋白質(染料標記之BSA))之聚合物奈米粒子之包覆效率。
第一A圖至第一D圖描述用於核酸及蛋白質之聚合物奈米粒子之包覆效率。
A：超離心粒化後之空奈米粒子(左)、載有染料標記DNA之奈米粒子(中)、及載有染料標記牛血清白蛋白之奈米粒子(右)之觀察。獨特之有色丸粒指出DNA及BSA蛋白質之成功包覆。
B：藉由cryoEM觀看到之空的奈米粒子。
C：藉由cryoEM觀看到之載有DNA之奈米粒子。
D：藉由cryoEM觀看到之載有BSA蛋白質之奈米粒子。經由奈米粒子內側之高度粒狀紋理可觀察到有效的DNA及蛋白質裝載。
在本研究中，使用染料標記20-聚體單股DNA(第一A圖；中)及染料標記BSA(第一A圖；右)驗證核酸與蛋白質之有效包覆。在粒化該等奈米粒子後，相對於該等空的奈米粒子之白色丸粒(第一A圖；左)，發現該等粒子丸粒為黃色(指出黃色FAM染料標記)。螢光定量指出奈米粒子出乎意料地對於核酸及蛋白質分別展現42%及35%之包覆效率。
使用cryoEM亦觀看到該核酸及蛋白質之有效包覆。空的奈米粒子在其含水核中呈現素色均勻紋理(第一B圖)，而載有DNA粒子(第一C圖)及載有BSA粒子(第一D圖)顯示高度粒狀紋理，其係cryoEM下濃縮生物含量的表徵。基於本具體實施例之8mM DNA及50mg/mL BSA之裝載濃度，載有DNA之奈米粒子含有約3500個DNA分子及載有BSA之奈米粒子含有約260個蛋白質。重要地，先前未曾達到如此高裝載之核酸及蛋白質。的確，已知以PLGA為基礎之奈米配方一致地顯示極差之核酸包覆性，且必須使用聚陽離子聚合物以中和核酸上之負電荷以加強裝載。例如，參見Shi等人之Angew Chem Int Ed Engl,2011,50(31)：7027-31；及Woodrow等人之Nature Materials,2009,8(6)：526-533。
上述之該等結果指出本發明之薄殼聚合物奈米粒子出乎預料地在其天然、溶解狀態下展現對親水性巨分子之高包覆效率(即高裝載效率)，突顯該薄殼中空奈米粒子之優點及獨特性。
實施例2：聚合物奈米粒子對傳送siRNA至細胞以用於RNA干擾之效應
進行一檢驗以評估聚合物奈米粒子對傳送siRNA至細胞以用於RNA干擾之效應。
第二A圖至第二C圖描述細胞吸收及以siRNA-GFP之GFP減弱。
A：Hela細胞吸收磺基-Cy5 NP達24小時及以DAPI染色細胞核。藉由共焦顯微鏡取得影像。
B：在不同之經處理細胞中之GFP訊號。以siRNA-GFP-NP(100、300及1000ug/ml PLGA)處理Hela-GFP細胞達24小時。以脂質體RNAiMax轉染細胞並以空NP培養細胞作為對照組。
C：siRNA-GFP-NP在24小時處理時之劑量反應。萃取RNA並反轉錄至cDNA。以qRT-PCR測量GFP mRNA量並標準化為甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。
在本研究中，證實該奈米粒子平台能成功地將siRNA傳送至細胞用於RNA干擾。首先使用載有磺基-Cy5 PLGA奈米粒子追蹤細胞中之奈米粒子之內化以進行細胞吸收實驗。以磺基-Cy5 NP處理Hela細胞24小時，以DAPI染色細胞核並以共焦顯微鏡取得影像。在24小時培養後，磺基-Cy5 NP經細胞吸收並累積在細胞質中(第二A圖)。接著，在Hela-GFP細胞中測試是否該載有siRNA奈米粒子可特定地減弱該標靶基因表現。在薄殼聚合物奈米粒子中包覆針對GFP序列之siRNA，並與細胞混合24小時及72小時。藉由RNAiMax脂質體以siRNA轉染細胞作為正對照組。在指定時間點，以螢光顯微鏡顯影細胞(第二B圖)接著以Trizol試劑萃取總RNA。將RNA反 轉錄成cDNA，且以qRT-PCR測定GFP之靜默並標準化成GAPDH。在以脂質體轉染24小時後，GFP mRNA量減弱至5%。以100、300、及1000ug/ml之奈米粒子處理之細胞分別顯示GFP mRNA量之劑量依存性減少至70%、30%、及4%(第二C圖)。高濃度之奈米粒子顯示類似於已知之商品脂質體之減弱效率(knockdown efficiency)。重要地，甚至在1000ug/ml PLGA量之最高濃度下，在以siRNA-GFP-NP處理之細胞中未觀察到細胞毒性現象，指出該平台優異的安全性。
該等結果指出聚合物奈米粒子展現對傳送siRNA至細胞用於RNA干擾之高效率。
實施例3：聚合物奈米粒子對用於淋巴結中免疫刺激之干擾素基因刺激蛋白(STING)促效劑之包覆及受控釋放的效應。
進行檢驗以評估聚合物奈米粒子對用於淋巴結中免疫刺激之STING促效劑之包覆及受控釋放的效應。
第三A圖至第三E圖描述聚合物奈米粒子對用於免疫刺激之STING促效劑之包覆及受控釋放的效應。
A：載有佐劑之薄殼中空奈米粒子之製備。
B：藉由奈米粒子追蹤分析測量之奈米粒子尺寸。
C：藉由梯度HPLC驗證環狀di-GMP之包覆。
D：薄殼中空奈米粒子之CryoEM顯像。
E：運送物釋放研究顯示奈米粒子之pH敏感觸發釋放曲線。
在本研究中，將本平台應用於疫苗開發。製備奈米粒子疫苗 之主要技術挑戰在於在奈米級基材上可靠地連結抗原及佐劑。例如，參見Brannon-Peppas等人之Adv Drug Deliv Rev,2004,56(11)：1649-59；及Lima-Tenorio等人之Int J Pharm,2015,493(1-2)：313-27。為克服此技術挑戰，使用生物降解聚合物(即PLAG)使用薄殼聚合物中空奈米粒子封裝高密度之功能性運送物。
更特定而言，使用雙乳化程序製備直徑在100至200nm間之中空粒子(第三A圖及第三B圖)。其等在約40%效率下有效地包覆STING促效佐劑(環狀di-GMP(cd-GMP))(第三C圖)，值得注意的是，核酸及親水性運送物包覆在奈米粒子平台中的困難眾所周知。該高包覆效率產生每奈米粒子約2,000個STING促效劑分子。先前未有基於聚合物奈米粒子之STING促效劑之奈米配方之報告。藉由cryoEM檢驗顯示在該等中空奈米粒子中具有大的內部核，其可達成cd-GMP之高裝載效率(第三D圖)。在細胞內傳送後，該等中空奈米粒子之薄聚合物殼由酸性pH觸發以快速地釋放內容物(第三E圖)。
該等結果指出該等薄殼聚合物奈米粒子可有效地製備合成疫苗。
實施例4：針對增強淋巴細胞激素並最小化全身細胞激素，評估載有STING促效劑奈米粒子
進行檢驗以針對增強淋巴細胞激素並最小化全身細胞激素評估載有STING促效劑奈米粒子。
第四A圖至第四F圖描述針對增強淋巴細胞激素並最小化全 身細胞激素之載有STING促效劑奈米粒子。
A：以cd-GMP奈米粒子及cd-GMP培養之後，在小鼠樹狀細胞株中TNF-α之誘導。
B：在相同小鼠樹狀細胞株中之IL-6誘導。
C：在該小鼠樹狀細胞株中之IFN-β誘導。
D：以等劑量之cd-GMP在自由分子形式下且在奈米粒子配方中培養後JAWSII之活化。
E：足墊注射cd-GMP或奈米粒子cd-GMP 48小時後之淋巴結IFN-β之量化。
F：足墊注射cd-GMP或奈米粒子cd-GMP後之全身TNF-α量。
藉由該等載有cd-GMP之奈米粒子之免疫活化，首先使用小鼠樹狀細胞株(JAWSII)在活體外檢驗。在以cd-GMP或cd-GMP奈米粒子培養24小時後，收集培養上清液用於ELISA分析以量化TNF-α、IL-6、及IFN-β之量。與cd-GMP配方相比，該奈米粒子配方更有效地觸發TNF-α、IL-6、及IFN-β之產生(第四A圖、第四B圖、及第四C圖)。與等劑量之cd-GMP相比，當以奈米粒子配方培養時，亦加強了細胞上之CD80表現(第四D圖)。觀察到奈米粒子增強該STING促效劑之佐劑性約30倍，此係由於奈米載體提高細胞內傳送。可推斷環狀二核苷酸不易於膜滲透，且或許不易於到達其細胞溶質目標。在奈米粒子包覆後，經由粒子胞吞作用加強細胞吸收，且後續細胞內釋放有助於cd-GMP細胞溶質進入，藉以加強其免疫增強效應。
藉由cd-GMP奈米粒子之免疫增強與在小鼠之活體內之cd-GMP做進一步比較。足墊注射後48小時，收集引流膕淋巴結以用於IFN-β 量化。觀察到奈米粒子配方誘導淋巴結中相當高之IFN-β量(第四E圖)，其對正常T細胞成熟是重要的。此外，在以cd-GMP及cd-GMP奈米粒子進行足墊投藥後，亦監測全身TNF-α量(反應原性之指標)。觀察到奈米粒子造成相當低之TNF-α之血清量，其反映奈米粒子在淋巴系統中之分布。另一方面，cd-GMP誘發血清TNF-α量升高且該等小分子可自由地擴散至該血流內(第四F圖)。
該等結果指出，載有STING促效劑之奈米粒子有效地增強淋巴結免疫細胞之活化。
實施例5：奈米粒子疫苗之製備與評估
以經由抗原/奈米粒子耦合製備奈米粒子疫苗進行檢驗，並評估所製備之奈米粒子疫苗。
第五A圖至第五F圖描述經由抗原/奈米粒子耦合製備奈米粒子疫苗。
A：經由功能性奈米粒子及抗原間之自發性連結製備擬態病毒奈米粒子疫苗。
B：經由BCA檢驗量化抗原含量。
C：藉由動態光散射測量在抗原接合作用之前及之後之奈米粒子尺寸。
D：在蛋白質接合作用之前及之後的包覆cd-GMP之奈米粒子的量化。
E：在抗原接合作用之後的奈米粒子之Cryo-EM顯像。
F：針對病毒抗原的免疫金染色驗證奈米粒子上成功之抗原接合作用。
使用載有cdGMP之薄殼聚合物奈米粒子，針對中東呼吸症 候群冠狀病毒(MERS-CoV)以MERS-CoV棘狀蛋白之受體結合域(RBD)製備奈米粒子疫苗。該RBD在無血清適應Sf21昆蟲細胞中表現且使用抗MERS-CoV RBD多株抗體及anti-His抗體藉由西方點墨法(Western blot)證實。藉由快速蛋白質液相層析術上之Histrap柱在純化後獲得35kDa RBD蛋白質之純產物。為使抗原/奈米粒子能夠耦合，首先以馬來醯亞胺封端之表面連結劑製備載有cd-GMP之奈米粒子，其自發地與可得硫醇基形成共價鍵結(第五A圖)。接著將該純化RBD蛋白質以溫和還原劑(參(2-羧乙基)膦)處理，其將二硫鍵還原成自由硫醇基。接著在溫和混合下將該等還原RBD蛋白質與馬來醯亞胺官能化奈米粒子混合達4小時。經由在30,000 x g離心將該RBD接合奈米粒子與自由蛋白質分離。在收集奈米粒子後，BCA檢驗顯示所得奈米粒子包含約20%之抗原輸入，對應於每粒子約20個蛋白質抗原(第五B圖)。動態光散射顯示在蛋白質接合作用後奈米粒子直徑自150nm增加至179nm(第五C圖)，指出成功的抗原/粒子耦合，其增加該粒子之總流體動力尺寸。
第六A圖至第六C圖描述針對上述奈米粒子疫苗之評估。
A：用於疫苗評估之接種時程表。
B：在加強接種之後兩週，於第35天之總抗RBD IgG滴定量。
C：於第35天之抗RBD IgG1及IgG2a滴定量。
評估抗原特異性IgG抗體反應並與其它疫苗奈米粒子比較，包括與自由cd-GMP混合之自由抗原及與MF59混合之自由抗原。在第0天及第21天將小鼠接種上述不同疫苗奈米粒子，並在第35天收集所有免疫接種小鼠之血清以用於ELISA分析(第六A圖)。出乎預料地，該等合成奈米 粒子在所有群組間誘發顯著較高之抗體滴定量(第六B圖)。值得注意地，IgG2a量(Th1免疫反應之指標)亦在奈米粒子接種之後增加(第六C圖)。
該等結果證實奈米粒子平台可製備於提高體液反應上展現優異優點之奈米粒子疫苗。
實施例6：共包覆CD8抗原及STING促效劑之奈米粒子對誘導CD8 T細胞反應之評估
進行檢驗以評估共包覆CD8抗原(SIINFEKL)及STING促效劑之聚合物奈米粒子對促進抗原特異性CD8 T細胞反應之效應。
第七A圖至第七C圖描述共包覆SIINFEKL胜肽及STING促效劑之聚合物奈米粒子對促進SIINFEKL-特異性CD8 T細胞反應之效應。
A：共包覆SINNFEKL胜肽及STING促效劑之奈米粒子(cd-GMP)。
B：在奈米粒子免疫接種後7天之SIINFEKL特異性CD8 T細胞之頻率。
C：在以含有不同劑量之cd-GMP之奈米粒子進行免疫接種後之多功能性(IFNg+TNF+)CD8+T細胞之量化。
為評估由該聚合物奈米粒子引發之抗原特異性細胞免疫，經由皮下途徑以含有OVA257-264 H2-Kb-限制胜肽SIINFEKL(每小鼠8μg)及不同量之cd-GMP(每小鼠0.4、2、或10μg)之奈米粒子對三隻C57BL/6小鼠進行免疫接種(第七A圖)。在免疫接種後7天將小鼠安樂死，並收集脾臟以藉由細胞內細胞激素染色分析CD8+T細胞反應。觀察到奈米粒子以取決於cd-GMP之劑量之方式引發抗原特異性CD8+T細胞之細胞激素產生(第七B 圖)。此外，接受較高cd-GMP量之小鼠顯示較多多功能性CD8+T細胞反應(第七C圖)。
該等結果指出本發明之聚合物奈米粒子實現對促進抗原特異性T細胞免疫作用之高效應。其等亦證實該運送物包覆可藉由在奈米粒子中以不同量組合胜肽及核酸來調節。
實施例7：具多個載有生物活性劑之含水核之薄殼聚合物奈米粒子之製備。
進行檢驗以製備具多個載有20聚體單股DNA之含水核之薄殼聚合物奈米粒子。
第八圖描述具有多個由聚合物薄殼封閉之含水核之薄殼聚合物奈米粒子。每一核載有DNA，其顯示緻密、粒狀之紋理。
發現在該薄殼聚合物奈米粒子內之含水核數目可藉由控制在上述第一及第二乳液之形成期間之分散程度來調節。為製備含有多個含水核之奈米粒子，降低在該微粒均質機中之流體壓力(2000psi)，以在每單一乳液液滴提供較大之具多重含水相之水/油/水乳液。在溶劑蒸發後，cryoEM顯像顯示含有多個含水核之薄殼聚合物奈米粒子(第八圖)。每一含水核由厚度低於20nm之聚合物薄殼封閉。該包覆有DNA之聚合物奈米粒子的cryoEM影像顯示在每一含水核中之稠密粒狀紋理，指出運送物成功包覆(第八圖)。
此結果證實本發明之聚合物奈米粒子具有多個含水核，每一個包覆一生物活性劑。
其它具體實施例
可以任何組合結合在本說明書中揭示之所有特徵。在本說明書中揭示之每一特徵可由提供相同、同等、或類似目的之替代性特徵取代。因此，除非另外明確說明，所揭示之每一特徵僅為一通用系列之同等或類似特徵的一實例。
由以上描述，熟習本技術者可易於確認本發明之基本特徵，且在不背離其精神與範疇下可對本發明進行各種變化與修正以將其調適用於各種用途及狀況。例如，亦可針對類鴉片(opioid)受體之調節活性及治療類鴉片受體相關症狀製造、篩選與本發明之化合物結構類似之化合物。因此，其它具體實施例亦在申請專利範圍內。

Claims (13)

  1. 一種用於包覆一生物活性劑之聚合物奈米粒子，該聚合物奈米粒子包含：一不透水之聚合物殼，及由該聚合物殼封閉之一或多個含水核，每一該一或多個含水核含有該生物活性劑，其中該聚合物殼之厚度8nm以上且少於25nm，且該聚合物奈米粒子之外直徑為30-600nm；其中該聚合物殼由含有非極性區段及極性末端基之聚合物形成；其中該非極性區段係聚(乳酸)(poly(lactic acid))、聚(乳酸共羥乙酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))、聚己內酯(polycaprolactone)、或聚胺基甲酸酯(polyurethane)；其中該極性末端基係負電荷基團、正電荷基團、兩性離子基團、或中性基團；其中該負電荷基團係羧酸(carboxylic acid)、琥珀酸(succinic acid)、或磺酸(sulfonic acid)；其中該正電荷基團係胺或脒(amidine)；其中該兩性離子基團係羧基甜菜鹼(carboxybetaine)或磺基甜菜鹼(sulfobetaine)；其中該中性基團係醣。
  2. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該聚合物殼之厚度為8-20nm。
  3. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該聚合物奈米粒子之外直徑30nm以上且少於40nm。
  4. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該聚合物奈米粒子之外直徑大於100nm且600nm以下。
  5. 如申請專利範圍第4項之聚合物奈米粒子，其中該含水核的直徑大於該聚合物奈米粒子之外直徑之70%且97%以下。
  6. 如申請專利範圍第5項之聚合物奈米粒子，其中該含水核的直徑大於該聚合物奈米粒子之外直徑之80%且97%以下。
  7. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該非極性區段係聚(乳酸共羥乙酸)及該極性末端基係羧酸。
  8. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該聚合物奈米粒子之滲透阻力為840mOsm/kg或更高。
  9. 如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子，其中該生物活性劑係選自由以下組成之群組：小分子、胜肽、蛋白質、核酸、顯影劑、無機奈米粒子、有機奈米粒子、及其組合。
  10. 如申請專利範圍第9項之聚合物奈米粒子，其中該生物活性劑係siRNA或環狀di-GMP。
  11. 一種用於製備如申請專利範圍第1項之聚合物奈米粒子之方法，其包含：將一聚合物溶於溶劑中以形成一聚合物溶液，藉由將該聚合物溶液分散於包含一生物活性劑之一第一水溶液中來乳化以形成一乳液，藉由將所形成之乳液流體分散在一第二水溶液中來乳化以獲得聚合物奈米粒子，及收集所得之聚合物奈米粒子，其中該聚合物含有非極性區段及極性末端基，及該流體分散係藉由使用微流體均質機以一受控方式進行。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該溶劑係選自由以下組成之群組之非極性溶劑：二氯甲烷、苯甲醇、乙酸乙酯、氯仿、及其組合。
  13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中每一該第一及該第二水溶液中包含選自由以下組成之群組之調配物：磷酸鈉、碳酸氫鈉、Tris-HCl、蔗糖、聚葡糖及其組合。
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