CN116322650A - 血小板膜包被的纳米颗粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了血小板膜包被的纳米颗粒，其尤其包含作为toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂的免疫调节剂。还提供了包含本发明纳米颗粒的组合物，例如药物递送装置和药物组合物。进一步提供了本发明的纳米颗粒的用途，包括本发明的纳米颗粒用于治疗或预防受试者的肿瘤的用途。

Description

血小板膜包被的纳米颗粒及其用途

相关申请

本申请要求2020年7月1日提交的美国临时专利申请第63/047,210号的优先权，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明提供了血小板膜包被的纳米颗粒，其尤其包含一种免疫调节剂，该免疫调节剂是一种Toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片类生长因子受体的上调剂。还提供了包含本发明纳米颗粒的组合物，例如药物递送装置和药物组合物。进一步提供了本发明的纳米颗粒的用途，包括本发明的纳米颗粒用于治疗或预防受试者的肿瘤的用途。

背景技术

免疫疗法已成为一种有效的癌症治疗方法，其利用肿瘤微环境中免疫细胞的力量。最近的一些方法，包括使用针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4和程序性细胞死亡蛋白1的免疫检查点抑制剂^1，2，以及嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过继转移³，已经显示出相当大的前景。尽管此类免疫疗法在治疗各种癌症类型方面取得了临床成功^4-7，但每种疗法仍有其需要克服的缺点。例如，CAR T细胞疗法对某些血液癌症表现良好，但对实体瘤效果不佳⁸。检查点阻断疗法通常与严重的全身性副作用相关，并且仅有益于处于正确免疫状态的一部分肿瘤患者^9，10。进一步扩大免疫治疗领域的一种有前途的策略是通过Toll样受体(TLRs)的参与和抑制肿瘤促进免疫信号传导来调节肿瘤微环境^11-14。TLRs主要由免疫细胞表达，其中TLR7是一种内体单链RNA受体，主要由巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞、自然杀伤细胞和B细胞表达¹⁵。

Resiquimod(R848)是一种小分子免疫调节剂，属于TLR7/8激动剂家族。R848与TLR7/8结合后，会释放多种免疫调节细胞因子，包括白细胞介素6(IL-6)、IL-12和干扰素α(IFNα)，因此触发一系列信号通路，导致抗原呈递细胞(APCC)的激活和T细胞反应的极化^16-18。尽管对TLRs在诱导对细菌和病毒病原体的先天免疫反应中的作用进行了广泛研究，但直到最近，人们才将注意力转移到它们在抗癌免疫监视中的作用。TLR7/8信号可通过激活中央转录因子核因子

促进抗癌反应¹⁹。据报道，TLR7/8治疗导致肿瘤抗原特异性CD8⁺T细胞的扩增，这对于有效抗肿瘤免疫反应的发展很重要^20，21。

尽管R848和TLR7激动剂家族的其他成员与检查点抑制剂的联合全身给药已被证明在治疗鳞状细胞癌、结肠癌、转移性黑色素瘤和胰腺癌方面具有优势^1822-24，但是存在限制其临床转化的缺点。例如，当多次静脉注射或口服小分子TLR7激动剂导致患者出现发热、疲劳、头痛和高血压等不良事件时，安全性问题就出现了^25-28。此外，一些报告表明，R848的全身给药会导致白细胞快速耗尽和短暂的局部免疫功能不全²⁹。因此，肿瘤内注射TLR7激动剂已被研究作为治疗实体瘤的更具临床相关性的给药途径^30-34。免疫刺激剂定位于肿瘤微环境可以将其从“冷”状态转变为“热”状态，有助于启动抗肿瘤免疫³⁵。为了使肿瘤内免疫疗法有效，有必要将免疫激动剂有效载荷安全地限制在肿瘤部位内。然而，直接注射游离药物有可能因泄漏而导致全身暴露，而靶向纳米递送平台通常设计为抗原特异性³⁶，限制了它们的广泛适用性。

需要改进的组合物和方法来治疗或预防受试者的各种疾病，例如肿瘤。本发明解决了这个和其他相关需求。

发明内容

该概述不旨在用于限制要求保护的主题的范围。根据包括在附图和所附权利要求中公开的那些方面的详细描述，要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将是显而易见的。

在一个方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包含：a)包含非细胞材料的内核；b)包含源自血小板的细胞膜的外表面；并且，除其他外，c)一种免疫调节剂，它是一种Toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片类生长因子受体的上调剂。

另一方面，本发明提供了一种制备纳米颗粒的方法，包括：a)使免疫调节剂与聚合物接触以在有机溶剂中形成有机相，所述免疫调节剂是toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体上调剂；b)使所述有机相与水相接触以形成初级乳液；c)将所述初级乳液进行超声处理或高压均化以形成细乳液；d)从所述细乳液中除去所述有机溶剂以在所述细乳液中形成包含所述免疫调节剂和所述聚合物的纳米颗粒；e)从所述细乳液中回收所述纳米颗粒。还提供了通过上述过程制成的纳米颗粒。

还提供了包含上述纳米颗粒的组合物以及上述纳米颗粒的各种用途。在又一方面，本发明提供了一种药物输送装置，其包含有效量的上述纳米颗粒。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的上述纳米颗粒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。在另一方面，本发明提供了有效量的上述纳米颗粒在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的肿瘤的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述纳米颗粒、药物递送装置或药物组合物。

附图说明

图1说明了示例性纳米颗粒表征。a，血小板膜表面标志物的表征，包括磷脂酰丝氨酸(PS)、P-选择素、GPIbα和αIIbβ3。b,c，富血小板血浆(PRP)、血小板裂解物和纯化的血小板膜中促血栓形成血小板激活分子凝血酶(b)和二磷酸腺苷(ADP，c)的定量分析(平均值+SD)。d，裸纳米颗粒(NP)核、无包被NP-R848、PNP和PNP-R848的平均流体动力学直径和多分散指数(PDI)(平均值+SD)。e，裸露的NP、NP-R848、PNP和PNP-R848的Zeta电位(平均值+SD)。f，PNP-R848的透射电子显微镜可视化，醋酸双氧铀负染色(比例尺＝50nm)。g，未包被的NP-R848和包被的PNP-R848超过3天的药物释放曲线。

图2说明了示例性纳米颗粒与肿瘤细胞的相互作用。a，b，体外孵育后各种癌细胞(MC38、HT-29、4T1和MDA-MB-231)对PEG-NP和PNP的结合(a)和摄取(b)的量化(平均值+SD；MFI＝平均荧光强度)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，***p＜0.0001(与PNP相比)。c，携带MC38肿瘤的小鼠瘤内给药后，PEG-NP或PNP随时间的保留(平均值±SEM)。d，来自(c)中研究的代表性图像，时间为5分钟、48小时、96小时和168小时(H＝高荧光信号，L＝低荧光信号)。

图3说明了示例性的体外活性以及与免疫细胞的相互作用。a，b，与PNP、游离R848和PNP-R848孵育后TLR7(a)和TLR8(b)报告细胞系的剂量依赖性反应(平均值+SD)。c，d，与游离R848或PNP-R848孵育后骨髓来源细胞(BMDCs)的CD80(c)和CD86(d)表达。e-g，与游离R848和PNP-R848孵育后，BMDCs剂量依赖性分泌IL-6(e)、TNFα(f)和IL-12p40(g)。h，i，在体外与BMDCs孵育后，免疫细胞亚群(CD45⁺、CD11b⁺和CD11c⁺)对PEG-NP和PNP的结合(h)和摄取(i)的量化(平均值+SD；MFI＝平均荧光强度)。j-1，肿瘤内给药后不同时间点的总肿瘤细胞群(j)、CD45⁺细胞(k)和CD11c⁺细胞(1)对PEG-NP和PNP的体内摄取(平均值+SD)。MFI基于总细胞数进行归一化。

图4说明了MC38小鼠结肠直肠腺癌肿瘤模型中的示例性治疗抗肿瘤功效。d，功效研究的时间线示意图。b，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后的平均肿瘤生长动力学(平均值±SEM)。c，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后的个体肿瘤生长动力学(

激发(/>

challenge)，RC＝再激发(re-challenge))。插图描绘了每次再激发后的生长动力学。d，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后小鼠的无进展生存期(肿瘤大小＜200mm³)。e，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后小鼠的体重(平均值±SD)。

图5说明了在MC38小鼠结直肠腺癌荷瘤小鼠中对治疗的示例性免疫反应。a，来自用游离R848和PNP-R848处理的小鼠的DLN中CD11b⁺或CD11c⁺细胞的MHC-II相对表达(平均值+SD)。b，来自用游离R848和PNP-R848处理的小鼠的DLN的CD45⁺细胞群中CD3⁺细胞的百分比(平均值+SD)。c，来自用游离R848和PNP-R848处理的小鼠的DLN的CD3⁺细胞群中CD8⁺细胞的百分比(平均值+SD)。d，来自用游离R848和PNP-R848处理的小鼠的DLN中具有效应记忆或中央记忆表型的CD4⁺ T细胞的比例(平均值+SD)。e，来自用游离R848和PNP-R848处理的小鼠的肿瘤切片中CD3⁺、CD4⁺或CD8⁺细胞密度的量化(平均值+SD)。f，来自(e)中实验的代表性组织学切片(比例尺＝100μm；棕色＝阳性染色)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001(与PNP-R848相比)；单向方差分析。

图6说明了在MC38小鼠结肠直肠腺癌肿瘤模型中减少的R848剂量的示例性治疗抗肿瘤功效。a，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后的平均肿瘤生长动力学(平均值±SEM)。b，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后的个体肿瘤生长动力学(

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challenge)，RC＝再激发(re-challenge))。插图描绘了每次再激发后的生长动力学。c，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后小鼠的无进展生存期(肿瘤大小＜200mm³)。d，用游离R848、PEG-NP-R848和PNP-R848处理后小鼠的体重(平均值±SD)。

图7说明了空纳米载体在MC38小鼠结肠直肠腺癌荷瘤小鼠中的示例性治疗抗肿瘤功效。a，用未加载R848的PEG-NP或PNP处理后小鼠的无进展生存期(肿瘤大小＜200mm³)(NS＝不显著，对数秩检验(log-rank test))。b，用未加载R848的PEG-NP或PNP处理后小鼠的体重(平均值±SD)。

图8说明了在MC38小鼠结直肠腺癌荷瘤小鼠中联合化疗的示例性治疗效果。a，用阿霉素(DOX)或DOX+PNP-R848处理后小鼠的无进展生存期(肿瘤大小＜200mm³)。b，用阿霉素(DOX)或DOX+PNP-R848处理后小鼠的体重(平均值±SD)。

图9说明了4T1小鼠乳腺癌肿瘤模型中的示例性治疗效果。a，功效研究的时间线示意图。用游离R848、PEG-NP-R848或PNP-R848治疗肿瘤。b，治疗后的平均肿瘤生长动力学(平均值±SEM)。c，治疗后个体肿瘤生长动力学。d，治疗后小鼠的无进展生存期(肿瘤大小＜200mm3)。e，治疗后第30天的肿瘤图像。f，治疗后第30天的平均肿瘤重量(平均值+SD)。g，治疗后第30天肺部转移结节的数量(平均值+SD)。*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001(与PNP-R848相比)；单向方差分析。

详细说明

为了提供对本发明的透彻理解，在以下描述中阐述了许多具体细节。这些细节是出于示例的目的而提供的，并且可以根据没有这些具体细节中的一些或全部的权利要求来实践要求保护的主题。应当理解，在不脱离要求保护的主题的范围的情况下，可以使用其他实施例并且可以进行结构改变。应当理解，在一个或多个单独实施例中描述的各种特征和功能不限于它们对描述它们的特定实施例的适用性。相反，它们可以单独或以某种组合应用于本发明的其他实施例中的一个或多个，无论这些实施例是否被描述，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施例的一部分。为了清楚起见，与要求保护的主题相关的技术领域中已知的技术材料未被详细描述，以免不必要地模糊要求保护的主题。

本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，都出于所有目的通过引用整体并入，其程度与每个单独的出版物通过引用单独并入的程度相同。引用出版物或文件并不意味着承认其中任何一个是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。

所有标题都是为了方便读者，除非另有说明，否则不应用于限制标题后文本的含义。

除非另有说明，所提供的实施方案的实践将采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、测序技术、免疫学(包括癌症免疫学)和医学的常规技术和描述，其在本领域技术人员的技能范围内。此类常规技术包括多肽和蛋白质合成和修饰、多核苷酸合成和修饰、聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、杂交检测和核苷酸测序。可以通过参考本文的示例来获得合适技术的具体说明。然而，当然也可以使用其他等效的常规程序。此类常规技术和描述可在标准实验室手册中找到，例如：Green等人编辑，基因组分析：实验室手册系列(第I-IV卷)(Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries(Vols.I-IV))(1999)；Weiner，Gabriel，Stephens编辑，遗传变异：实验室手册(Genetic Variation：A Laboratory Manual)(2007)；Dieffenbach，Dveksler编辑，PCR引物：实验室手册(PCR Primer：A Laboratory Manual)(2003)；Bowtell和Sambrook，DNA微阵列：分子克隆手册(DNA Microarrays：A Molecular Cloning Manual)(2003)；Mount，生物信息学：序列和基因组分析(Bioinformatics：Sequence and Genome Analysis)(2004)；Sambrook和Russell，分子克隆的浓缩方案：实验室手册(Condensed Protocols fromMolecular Cloning：A Laboratory Manual)(2006)；Sambrook和Russell，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(2002)(全部来自冷泉港实验室出版社)；Ausubel et al.eds.，当前的分子生物学协议(Current Protocols in MolecularBiology)(1987)；T.Brown ed.，基本分子生物学(Essential Molecular Biology)(1991)，IRL出版社；Goeddel ed.，基因表达技术(Gene Expression Technology)(1991)，学术出版社(Academic Press)；A.Bothwell等人编辑，真核基因克隆和分析方法(Methods forCloning and Analysis of Eukaryotic Genes)(1990)，Bartlett Publ.；M.Kriegler，基因转移和表达(Gene Transfer and Expression)(1990)，Stockton出版社；R.吴等人编辑，重组DNA方法学(Recombinant DNA Methodology)(1989)，学术出版社(Academic Press)；M.McPherson等人，PCR：实用方法(PCR：A Practical Approach)(1991)，牛津大学出版社IRL出版社；Stryer，生物化学(Biochemistry)(第4版)(1995)，W.H.Freeman，纽约，N.Y.；Gait，寡核苷酸合成：一种实用方法(Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach)(2002)，IRL出版社，伦敦；Nelson和Cox，Lehninger，生物化学原理(Principlesof Biochemistry)(2000年)第3版，W.H.Freeman Pub.，纽约，N.Y.；Berg等人，生物化学(Biochemistry)第五版(2002)，W.H.Freeman Pub.，纽约，N.Y.。出于所有目的，所有这些都通过引用整体并入本文。

为了便于理解本发明，本文使用的许多术语和缩写定义如下。

A.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同含义。如果本节中规定的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中规定的定义相反或不一致，则本节中规定的定义优先于通过引用并入本文的定义。

在介绍本发明或其优选实施例的元素时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示一个或多个元素。术语“包含”、“包括”和“具有”意在包括在内并且意味着除了列出的元素之外还可以有额外的元素。

术语“和/或”在两个或多个项目的列表中使用时，意味着所列项目中的任何一项可以单独使用或与所列项目中的任何一项或多项结合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一个或两者，即单独的A、单独的B或A和B的组合。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、A和B的组合、A和C的组合、B和C的组合或A、B和C的组合。

细胞膜：如本文所用，术语“细胞膜”是指在细胞内或细胞周围用作选择性屏障的生物膜封闭或分离结构。细胞膜可选择性地渗透离子和有机分子，并控制物质进出细胞的运动。细胞膜包含磷脂单层或双层，可选地，还包含相关的蛋白质和碳水化合物。如本文所用，细胞膜是指从细胞或细胞器的天然存在的生物膜获得的膜，或从其衍生的膜。如本文所用，术语“天然存在的”是指存在于自然界中的。如本文所用，术语“从其衍生”是指天然膜的任何后续修饰，例如分离细胞膜、产生膜的部分或片段、去除和/或添加某些成分，例如脂质、蛋白质或碳水化合物，来自或进入取自细胞或细胞器的膜。膜可以通过任何合适的方法衍生自天然存在的膜。例如，可以从细胞制备或分离膜，并且制备或分离的膜可以与其他物质或材料组合以形成衍生膜。在另一个例子中，可以对细胞进行重组工程以产生“非天然”物质，这些物质在体内并入其细胞膜，并且可以从细胞制备或分离细胞膜以形成衍生膜。

在不同的实施方案中，覆盖单层或多层纳米颗粒的细胞膜可以被进一步修饰以被其他脂质组分饱和或不饱和，例如胆固醇、游离脂肪酸和磷脂，也可以包括内源性或添加的蛋白质和碳水化合物，例如细胞表面抗原。在这种情况下，可以将过量的其他脂质成分添加到膜壁中，膜壁将脱落，直到膜壁中的浓度达到平衡，这可以取决于纳米颗粒环境。膜还可以包含可以增加或不增加纳米颗粒活性的其他试剂。在其他实施例中，可以将诸如抗体和适配体的功能基团添加到膜的外表面以增强位点靶向，例如添加到癌细胞中发现的细胞表面表位。纳米颗粒的膜还可以包含可生物可降解的颗粒，阳离子纳米颗粒包括但不限于金、银和合成纳米颗粒。

合成或人造膜：如本文所用，术语“合成膜”或“人造膜”是指由有机材料(如聚合物和液体)以及无机材料制成的人造膜。多种合成膜在本领域中是众所周知的。

纳米颗粒：在一些实施例中，本文所用的术语“纳米颗粒”是指纳米结构、粒子或囊泡，或其片段，其至少一个维度(例如，高度、长度、宽度或直径)在约1nm和约10μm之间。对于全身使用，可以优选约30nm至约500nm，或约30nm至约300nm，或约50nm至约250nm的平均直径。术语“纳米结构”包括但不一定限于颗粒和工程特征。颗粒和工程特征可以具有例如规则或不规则的形状。这样的颗粒也称为纳米颗粒。纳米颗粒可以由有机材料或其他材料组成，并且可以可选地用多孔颗粒来实现。纳米颗粒层可以用单层的纳米颗粒或具有纳米颗粒团聚的层来实现。在一些实施方案中，包含内部隔室(或内核)或由内部隔室(或内核)组成的纳米颗粒可以被外表面(或壳)覆盖，所述外表面(或壳)包含如本文所讨论的膜。本发明考虑了现在已知和以后开发的可以用本文描述的膜包被的任何纳米颗粒。

药学活性：本文所用的术语“药学活性”是指物质对生物体，特别是人体细胞和组织的有益生物活性。“药物活性剂”或“药物”是具有药物活性的物质，“药物活性成分”(API)是药物中的药物活性物质。

药学上可接受的：本文使用的术语“药学上可接受的”是指经美国联邦或州政府监管机构批准或列入美国药典、其他公认的药典以及可安全用于动物(特别是人类和/或非人类哺乳动物)的其他制剂。

药学上可接受的盐：本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指化合物的酸加成盐或碱加成盐，例如在本发明中的多药物偶联物。药学上可接受的盐是保留母体纳米颗粒或化合物的活性并且不会对其施用的对象和施用的环境产生任何有害或不良影响的任何盐。药学上可接受的盐可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。生产作为盐的化合物的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Stahl等人，药用盐手册：特性、选择和使用(Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use)，Wiley-VCH；Verlag Helvetica Chimica Acta，苏黎世，2002；Berge等人，J Pharm.Sci.66：1，1977)。在一些实施方案中，“药学上可接受的盐”意指本文表示的纳米颗粒或化合物的游离酸或碱的盐，其是无毒的、生物学上可耐受的或生物学上适合施用于受试者的。一般参见Berge等人，J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19。优选的药学上可接受的盐是那些在药理学上有效并且适合与受试者的组织接触而没有过度的毒性、刺激或过敏反应的盐。本文所述的纳米颗粒或化合物可具有足够酸性的基团、足够碱性的基团、这两种类型的官能团或每种类型中的一种以上，并相应地与许多无机或有机碱以及无机和有机酸反应，形成药学上可接受的盐。

药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐和扁桃酸盐。

药学上可接受的载体：如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指与纳米颗粒或化合物(例如多药物偶联物)一起给药的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这样的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯等抗菌剂、抗坏血酸或亚硫酸氢钠等抗氧化剂、乙二胺四乙酸等螯合剂、调节张力的药剂(如氯化钠或葡萄糖)也可以是载体。生产与载体组合的组合物的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，用语“药学上可接受的载体”意在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的，参见，例如，Remington，药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第20版(Lippincott、Williams&Wilkins2003)。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑在组合物中使用这种应用。

磷脂：如本文所用，术语“磷脂”是指包含甘油二酯、磷酸基团和简单有机分子(如胆碱)的众多脂质中的任一种。磷脂的实例包括但不限于磷脂酸(磷脂)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸(P1P3)。PC的其他示例包括本领域定义的DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC和DEPC。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指当鉴于该受试者疾病或病症的性质和严重性给予特定受试者时将具有所需治疗效果的那些量，例如，将治愈、预防、抑制或至少部分阻止或部分预防目标疾病或病症的量。更具体的实施方案包括在下文的药物制剂和给药方法部分中。在一些实施方案中，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂联合施用于细胞、组织或受试者时有效预防或改善疾病或病症(例如肿瘤或癌症)，或疾病或病症的进展的治疗剂的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的治疗剂的量，例如相关医学病症的治疗、治愈、预防或改善，或这些病症的治疗、治愈、预防或改善的速率的增加。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量是适用于该单独的该成分。当应用于联合时，无论是联合给药、连续给药还是同时给药，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量。

“处理”或“治疗”或“缓解”是指治疗性处理，其中目的是如果不能治愈目标病理状况或病症或防止病症的复发，则减缓(减轻)。如果在接受治疗量的治疗剂后，受试者表现出可观察到和/或可测量的特定疾病的一种或多种体征和症状的减少或不存在，则该受试者被成功“治疗”。患者也可能感觉到疾病体征或症状的减轻。如果患者经历稳定的疾病，则也认为该患者已得到治疗。在一些实施方案中，用治疗剂治疗有效导致患者在治疗后3个月无病，优选治疗后6个月无病，更优选一年，甚至更优选2年或更长时间。这些用于评估疾病的成功治疗和改善的参数很容易通过本领域具有适当技能的医师熟悉的常规程序来测量。

如本文所用，“预防性”治疗意指延缓疾病、疾病症状或医学病症的发展，抑制可能出现的症状，或降低疾病或症状发展或复发的风险。“治愈性”治疗包括降低现有疾病、症状或病症的严重程度或抑制其恶化。

术语“联合(组合)”是指一个剂量单位形式的固定组合，或用于联合给药的试剂盒，其中纳米颗粒或化合物和组合伴侣(例如，下文解释的另一种药物，也称为“治疗剂”或“辅助剂”)可以同时独立给药或在一定时间间隔内分别给药，特别是在这些时间间隔允许组合伴侣表现出合作(例如协同效应)的情况下。本文中使用的术语“联合给药”或“组合给药”等意在涵盖将选定的组合伴侣给药至需要其的单个受试者(例如，患者)，并且意在包括药剂不一定通过相同的给药途径或同时给药的治疗方案。如本文所用，术语“药物组合”是指多于一种活性成分的混合或组合产生的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如纳米颗粒或化合物)和组合伴侣，均以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如纳米颗粒或化合物)和组合伙伴，均作为单独的实体同时、并行或按顺序地施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供患者体内两种成分或化合物的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如三种或更多种活性成分的给药。

如本文所用，有需要的对象是指动物、非人哺乳动物或人。如本文所用，“动物”包括宠物、家畜、经济动物、运动动物和实验动物，例如猫、狗、马、牛、牛、猪、驴、绵羊、小羊、山羊、老鼠、兔子、鸡、鸭、鹅、灵长类动物(包括猴子和黑猩猩)。如本文所用，“受试者”是指生物体或生物体的一部分或组分，所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统可对其施用或应用。例如，受试者可以是哺乳动物或细胞、组织、器官或哺乳动物的一部分。如本文所用，“哺乳动物”是指任何哺乳动物种类，优选人类(包括人类、人类受试者或人类患者)。受试者和哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。

如本文所用，术语“样品”是指任何可能包含需要对其进行分析的目标分子的物体，包括生物样品。如本文所用，“生物样品”可以指从活体或病毒(或朊病毒)来源或其他大分子和生物分子来源获得的任何样品，并且包括受试者的任何细胞类型或组织，从其可以获得核酸、蛋白质和/或其他大分子。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。例如，扩增的分离核酸构成生物样品。生物样品包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液、汗液、精液、粪便、痰液、泪液、粘液、羊水等，积液，骨髓样本、腹水、盆腔冲洗液、胸膜液、脊髓液、淋巴液、眼液，以及鼻腔、咽喉或生殖器拭子的提取物，消化组织的细胞悬浮液，或粪便材料的提取物，以及来自人类、动物(例如非人类哺乳动物)和植物的组织和器官样本以及由此衍生的加工样本。

如本文所用，“疾病或病症”是指由例如感染或遗传缺陷或其他原因引起的生物体中的病理状况，其特征在于可识别的症状。

应当理解，本文描述的本发明的方面和实施例包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”的方面和实施例。

除非上下文另有明确说明，本文所用的术语“平均值”是指平均值或中值，或用于与平均值或中值接近的任何值。

贯穿本发明，本发明的各个方面以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

本发明的其他目的、优点和特征将从以下结合附图的说明中变得明显。

B.血小板膜包被的纳米颗粒和包含其的组合物

在一个方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包含：a)包含非细胞材料的内核；b)包含源自血小板的细胞膜的外表面；c)一种免疫调节剂，它是一种Toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片类生长因子受体的上调剂。

本纳米颗粒的内核可包含任何合适的物质或材料。例如，本发明纳米颗粒的内核可包含聚合物。本纳米颗粒的内核可包含任何合适的聚合物。在一些实施例中，聚合物是生物相容的和/或生物可降解的聚合物。在一些实施例中，聚合物是均聚物。在一些实施例中，均聚物可包含乳酸单元，包含聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯或聚-D，L-丙交酯单元的乳酸单元。在一些实施例中，聚合物是共聚物。共聚物可包含乳酸和乙醇酸单元，例如，包含聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)的乳酸和乙醇酸单元。在一些实施例中，本发明纳米颗粒的内核可包含生物相容性材料或合成材料，其选自选自聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚赖氨酸和聚谷氨酸。

本纳米颗粒的外表面可包含任何合适的源自血小板的膜。例如，本发明纳米颗粒的外表面可包含源自血小板的质膜。在另一个实施例中，本发明纳米颗粒的外表面可包含源自血小板的胞内膜。在又一实施例中，本发明纳米颗粒的外表面可包含源自血小板的天然存在的细胞膜。在又一实施例中，本发明纳米颗粒的外表面可包含衍生自血小板的改性膜。在又一实施例中，本发明纳米颗粒的外表面可包含混合膜，该混合膜包含源自血小板的天然存在的细胞膜，以及合成膜。

本发明的纳米颗粒可以包含任何合适的免疫调节剂，其是toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂。例如，本发明的纳米颗粒可以包含免疫调节剂，其是小分子、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属和/或其组合物或复合物。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可包含免疫调节剂，其是toll样受体(TLR)激动剂。TLR激动剂可以靶向任何合适的TLR。例如，TLR激动剂可以靶向TLR 1/2、TLR2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 5/6、TLR 7、TLR 8、TLR 9或TLR 10。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可以包含免疫调节剂，其是阿片样物质生长因子受体的上调剂。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可包含免疫调节剂，其为雷西莫特(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)或莫托莫德(motolimod)。在特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒可包含免疫调节剂，即雷西莫特。

在本发明的纳米颗粒中，免疫调节剂可以位于任何合适的位置。例如，免疫调节剂可位于内核内或内核上、内核和外表面之间、或外表面内或外表面上。

可以通过任何合适的方式或机制触发免疫调节剂从本发明纳米颗粒的释放。例如，免疫调节剂的释放可由纳米颗粒与靶细胞、组织、器官或受试者之间的接触触发，或由纳米颗粒周围的物理参数的变化触发。

本纳米颗粒的内部可以具有任何合适的疏水性。例如，本纳米颗粒的内部可以比纳米颗粒的外表面更疏水。在一些实施方案中，免疫调节剂是疏水的并且位于本发明纳米颗粒的疏水或更疏水的内部。

在一些实施例中，本纳米颗粒的内核支撑本纳米颗粒的外表面。

本发明的纳米颗粒可以具有任何合适的尺寸或直径。例如，本发明的纳米颗粒可以具有约10nm至约10μm的直径，例如，直径约为10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm，160nm，170nm，180nm，190nm，200nm，250nm，300nm，350nm，400nm，450nm，500nm，600nm，700nm，800nm，900nm，1μm，2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm或其任何子范围。在一些实施例中，本纳米颗粒具有约50nm至约1μm或其任何子范围的直径。在一些实施例中，本纳米颗粒具有约70nm至约150nm或其任何子范围的直径。

本发明的纳米颗粒可以具有任何合适的形状，包括但不限于球体、正方形、长方形、三角形、圆盘、类立方体、立方体、长方体(cuboid)、圆锥体、圆柱体、棱柱体、角锥体、直角圆柱体等规则或不规则形状。在一些实施例中，本发明的纳米颗粒具有基本上球形的构造或非球形的构造。

在一些实施例中，本发明的纳米颗粒基本上缺乏细胞膜(例如质膜)所源自的血小板的成分。例如，本发明的纳米颗粒可缺少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的细胞膜(例如质膜)所源自的血小板成分。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒基本上保持细胞膜(例如质膜)或细胞膜成分的天然结构完整性或活性。例如，本纳米颗粒可以保留约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然结构完整性。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒基本上保持细胞膜或细胞膜成分的天然结构(包括细胞膜的一级、二级、三级和/或四级结构)完整性，或细胞膜的成分。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒基本上保持细胞膜或细胞膜成分的活性，包括细胞膜或细胞膜成分的结合活性、受体活性和/或酶活性。

在一些实施例中，本纳米颗粒是生物相容的或可生物降解的。例如，本发明纳米颗粒的内核可包含生物相容性或生物可降解材料并且本发明纳米颗粒的外表面包含源自血小板的质膜。在另一个实例中，内部隔室(或内核)仅包含生物相容性或生物可降解材料，或不包含任何非生物相容性或非生物可降解材料。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒包含：内核，该内核包含包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)；外表面，该外表面包含源自血小板的质膜；以及雷西莫特(resiquimod)，例如，resiquimod(R-848，S-27609)。

本发明的纳米颗粒可以具有任何合适的半衰期或在实体瘤中的半衰期。在一些实施方案中，本纳米颗粒在实体瘤中的半衰期为约48小时至约72小时，例如，在实体瘤中的半衰期为约48小时、49小时、50小时、51小时、52小时小时，53小时，54小时，55小时，56小时，57小时，58小时，59小时，60小时，61小时，62小时，63小时，64小时，65小时，66小时，67小时，68小时，69小时、70小时、71小时、72小时或其任何子范围。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒对本发明的纳米颗粒被配置用于施用的受试者、哺乳动物、非人哺乳动物或人基本上缺乏免疫原性。例如，细胞膜可源自与受试者相同物种的血小板。在另一个实施例中，受试者是人并且细胞膜源自人血小板。在一些实施例中，细胞膜可源自待治疗对象的血小板。例如，细胞膜可以来源于待治疗的人的血小板。

本发明纳米颗粒的外表面可包含混合膜，该混合膜包含源自血小板的细胞膜和合成膜。在一些实施例中，纳米粒子的外表面可包含混合膜，该混合膜包含至少约5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)，9％(w/w)，10％(w/w)，20％(w/w)，30％(w/w)，40％(w/w)，50％(w/w)，60％(w/w)，70％(w/w)，80％(w/w)，90％(w/w)，91％(w/w)，92％(w/w)，93％(w/w)，94％(w/w)，95％(w/w)，96％(w/w)，97％(w/w)，98％(w/w)，99％(w/w)的来自血小板的细胞膜。在其他实施例中，本发明纳米颗粒的外表面可包含混合膜，该混合膜包含至少约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w))，5％(w/w)，6％(w/w)，7％(w/w)，8％(w/w)，9％(w/w)，10％(w/w)，20％(w/w)，30％(w/w)，40％(w/w)，50％(w/w)，60％(w/w)，70％(w/w)，80％(w/w)，90％(w/w)，91％(w/w)，92％(w/w)，93％(w/w)，94％(w/w)，95％(w/w)的合成膜。例如，本发明纳米颗粒的外表面可包含混合膜，该混合膜包含约5-10％(w/w)的细胞膜和约95-99％(w/w)的合成膜，约11-25％(w/w)的细胞膜和约75-89％(w/w)的合成膜，约50％(w/w)的细胞膜和约50％(w/w)的合成膜，约51-75％(w/w)的细胞膜和约49-25％(w/w)的合成膜，或者约90-99％(w/w)的细胞膜和约1-10％(w/w)的合成膜。

本纳米颗粒可包含任何合适量或水平的治疗性免疫调节剂，其为toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂。例如，本发明的纳米颗粒可包含约重量百分比1％至约10％的治疗性免疫调节剂，例如约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)，4％(w/w)，5％(w/w)，6％(w/w)，7％(w/w)，8％(w/w)，9％(w/w)，10％(w/w)或其任何子范围的治疗性免疫调节剂。

本发明的纳米颗粒可包含任何合适量或水平的生物相容性聚合物。例如，本发明的纳米颗粒可包含约50％至约99％重量百分比的生物相容性聚合物，例如约50％(w/w)、55％(w/w)、60％(w/w)，65％(w/w)，70％(w/w)，75％(w/w)，80％(w/w)，85％(w/w)，90％(w/w)，95％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或其任何子范围的生物相容性聚合物。

本发明的纳米颗粒可包含任何合适量或水平的源自血小板的细胞膜。例如，本发明的纳米颗粒可包含约20％至约50％重量百分比的源自血小板的细胞膜，例如约20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)或其任何子范围的源自血小板的细胞膜。

在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可包含约1％至约10％重量百分比的治疗性免疫调节剂、约50％至约99％重量百分比的生物相容性聚合物，和约20％至约50％重量百分比的源自血小板的细胞膜。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可包含约1％至约10％重量百分比的resiquimod、约50％至约99％重量百分比的生物相容性聚合物，和约20％至约50％重量百分比的源自血小板的质膜。

另一方面，本发明提供了一种制备纳米颗粒的方法，包括以下步骤：a)使作为免疫调节剂的toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体上调剂与聚合物接触以在有机溶剂中形成有机相；b)使所述有机相与水相接触以形成初级乳液；c)将所述初级乳液进行超声处理或高压均化以形成细乳液；d)从所述细乳液中除去所述有机溶剂以形成在所述细乳液中的包含所述免疫调节剂和所述聚合物的纳米颗粒；e)从所述细乳液中回收所述纳米颗粒。

任何合适的toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂均可用于本方法。例如，免疫调节剂可以是雷西莫特(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)或莫托莫德(motolimod)。在一些实施方案中，免疫调节剂是雷西莫特(resiquimod)。

在本方法中可以使用任何合适的聚合物。例如，均聚物或共聚物可用于本方法。在一些实施例中，包含乳酸和/或乙醇酸单元的均聚物或共聚物可用于本方法。

任何合适的有机相都可以用于本发明方法。例如，包含乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯甲醇、胆酸钠、吐温80等或其组合的有机相可以用于本发明方法。在一些实施方案中，包含苯甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷或其组合的有机相可用于本发明方法。

包含任何合适量或水平的聚合物和免疫调节剂的有机相可用于本发明方法。例如，包含约5％至约10％重量固体的聚合物和免疫调节剂的有机相可用于本发明方法。在一些实施例中，包含约5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)或其任何子范围的聚合物和免疫调节剂的有机相可用于本发明方法。

任何合适的含水水溶液均可用于本发明方法。在一些实施方案中，包含水与胆酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、乙酸乙酯和苯甲醇中的一种或多种组合的水溶液可用于本发明方法。

初级乳液可包含任何合适量或水平的聚合物和免疫调节剂。例如，初级乳液可包含约1％至约10％重量固体的聚合物和免疫调节剂。在一些实施方案中，初级乳液可包含约1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)，6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)或其任何子范围的聚合物和免疫调节剂。

在本方法中，步骤b)可以使用任何合适的程序或以任何合适的方式进行。例如，在本方法中，步骤b)可以通过使用简单混合、高压均质化、探头超声处理、搅拌或通过转子定子均质化使所述有机相与水相接触以形成初级乳液来进行。

在本方法中，步骤c)可以使用任何合适的程序或以任何合适的方式进行。例如，在本方法中，步骤c)可以包括使初级乳液经历一次或多次通过均化器。在另一个实施例中，在本方法中，步骤c)可以包括使用约5,000psi至约15,000psi的压力使初级乳液经受高压均质化。在一些实施方案中，在本方法中，步骤c)可以包括使用约5,000psi、6,000psi、7,000psi、8,000psi、9,000psi、10,000psi、11,000psi、12,000psi、13,000psi、14,000psi、15,000psi或其任何子范围的压力使初级乳液经受高压均质化。

在本方法中，步骤d)可以使用任何合适的程序或以任何合适的方式进行。例如，在本方法中，步骤d)可包括通过将细乳液稀释到冷水溶液或水中至足以溶解细乳液中的所有有机溶剂以形成淬灭相的浓度来淬灭细乳液。淬灭可以在任何合适的温度下进行。例如，淬灭可以在约1℃至约5℃的温度下进行。例如，在一些实施例中，淬灭可以在约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或其任何子范围的温度下进行。在另一个实施例中，在本方法中，步骤d)可以包括通过离心、过滤、超滤或渗滤从细乳液中回收纳米颗粒。可以使用任何合适的膜进行过滤、超滤或渗滤。在一些实施方案中，过滤、超滤或渗滤可使用截留分子量为约100kDa至约500kDa的膜进行，例如，使用截留分子量为约100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或其任何子范围的膜。

本发明提供了通过上述方法制成的纳米颗粒。

在一些实施方案中，本方法还可包括使纳米颗粒与源自血小板的细胞膜接触以形成血小板膜包被的纳米颗粒。任何合适的技术或程序可用于使纳米颗粒与源自血小板的细胞膜接触以形成血小板膜包被的纳米颗粒。例如，可以使用在WO 2013/052167 A2、US2013/0337066 A1、WO 2017/087897 A1、US 2019/0382539 A1、WO 2020/112694 A1和WO2020/112694 A9中公开和/或要求保护的技术或程序。本发明还提供了通过上述方法制成的纳米颗粒。

在另一方面，本发明提供了一种药物递送装置，其包含有效量的上述纳米颗粒。在一些实施方案中，本药物递送装置还可包含另一种(或第二种)活性成分，或医学上或药学上可接受的载体或赋形剂。本药物输送装置还可包含任何合适的其他活性成分。在一些实施方案中，本发明的药物输送装置还可包含其他活性成分，即抗肿瘤剂或物质，例如多西环素(doxycycline)或多柔比星(doxorubicin)。在一些实施例中，本药物递送装置不进一步包含另一种活性成分，例如，不进一步包含另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的上述纳米颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，本发明药物组合物可进一步包含另一种(或第二种)活性成分。本发明药物组合物还可包含任何合适的另一种活性成分。在一些实施方案中，本发明药物组合物还可包含任何合适的另一种活性成分，其是抗肿瘤剂或物质，例如多西环素或多柔比星。在一些实施方案中，本发明的药物组合物不进一步包含另一种活性成分，例如，不进一步包含另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)。

在另一方面，本发明提供了有效量的上述纳米颗粒在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。

本发明的纳米颗粒可以配置用于任何合适的应用用途。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可以被配置用于治疗或预防有需要的受试者的肿瘤。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可以被配置用于治疗或预防有需要的受试者的实体瘤或癌症。

本发明的纳米颗粒可以单独使用。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可以与另一种活性物质(例如另一种抗肿瘤剂或物质)组合使用。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒可以单独使用而无需另一种活性物质(例如另一种抗肿瘤剂或物质)。

C.治疗或预防受试者肿瘤的方法

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的肿瘤的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述纳米颗粒、药物递送装置或药物组合物。

本发明方法可用于任何合适的目的或应用。例如，本发明方法可用于预防受试者的肿瘤。在另一个实施例中，本发明方法可用于治疗受试者的肿瘤。

本发明方法中使用的纳米颗粒可包含任何合适的源自血小板的细胞膜。例如，本方法中使用的纳米颗粒可包含细胞膜，所述细胞膜源自受试者相同物种的血小板或源自待治疗受试者的血小板。

本发明方法可用于治疗或预防任何合适受试者的肿瘤。例如，本发明方法可用于治疗或预防非人类受试者或哺乳动物的肿瘤。在另一个实施例中，本发明方法可用于治疗或预防人类的肿瘤。

任何合适的toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂均可用于本发明方法。例如，免疫调节剂可以是雷西莫特(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)或莫托莫德(motolimod)。在一些实施方案中，免疫调节剂是雷西莫特。

本发明方法可用于治疗或预防受试者的任何合适的肿瘤。例如，本发明方法可用于治疗或预防受试者的淋巴瘤、白血病、脑癌、神经胶质瘤/成胶质细胞瘤(GBM)、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、食道癌或头颈癌。在一些实施方案中，本发明方法可用于治疗或预防受试者的实体癌或肿瘤。

在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者。例如，在本方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以通过肿瘤内、口服、鼻腔、吸入、肠胃外、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、皮内、局部或直肠途径施用于受试者。在一些实施方案中，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以肿瘤内或原位施用至受试者的癌症或肿瘤部位。在一些实施方案中，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以肿瘤内或原位施用至受试者的实体癌或肿瘤部位。

在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以任何合适的剂量或给药方案施用于受试者。例如，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以约0.01mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，在本方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg或任何其子范围的剂量施用于受试者。

在一些实施方案中，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以与另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)组合施用于受试者。在一些实施方案中，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以在没有另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)的情况下单独施用于受试者。

在一些实施方案中，在本发明方法中，可以将纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于已经用抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)治疗的受试者。在一些实施方案中，在本发明方法中，可以将纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于尚未用另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素或多柔比星)治疗的受试者。

可以以任何合适的方式使用本发明方法。在一些实施方案中，在本发明方法中，纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以作为一线治疗施用于受试者。在一些实施方案中，在本发明方法中，可以将纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于患有复发性肿瘤(例如复发性实体癌或肿瘤)的受试者。

在本发明方法中，施用的纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以在任何合适的时间段内保留在受试者的实体癌或肿瘤内。例如，在本发明方法中，至少约50％的施用的纳米颗粒、药物递送或药物组合物可在实体癌或肿瘤内保留至少约40小时。在一些实施方案中，在本发明方法中，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高水平的施用的纳米颗粒、药物递送或药物组合物可以在受试者(例如小鼠或人)的实体癌或肿瘤内保留至少约40小时。

本发明方法可用于实现任何合适的存活率。例如，本发明的方法可用于在接受至少三个月治疗的受试者中实现至少约80％的总体存活率。在一些实施例中，本发明的方法可用于在受试者(例如小鼠或人)中实现至少约80％、85％、90％、95％或更高水平的存活率。

D.药物组合物和给药途径

包含本文所述的纳米颗粒的药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，纳米颗粒是单独的或与其他活性成分组合。药学上可接受的赋形剂是无毒的并且在其他方面生物学上适合施用于受试者的物质。此类赋形剂有助于单独或与其他活性成分组合施用本文所述的纳米颗粒，并且与活性成分相容。药学上可接受的赋形剂的实例包括稳定剂、润滑剂、表面活性剂、稀释剂、抗氧化剂、粘合剂、着色剂、填充剂、乳化剂或调味剂。在优选的实施方案中，根据各种实施方案的药物组合物是无菌组合物。药物组合物可以使用本领域技术人员已知的或变得可用的配合技术来制备。

无菌组合物在本发明范围内，包括符合管辖此类组合物的国家和地方法规的组合物。

本文所述的药物组合物和纳米颗粒，单独地或与其他活性成分组合地，可以按照本领域已知的制备各种剂型的常规方法配制为在合适的药物溶剂或载体中的溶液、乳剂、混悬剂或分散剂，或配制成丸剂、片剂、锭剂、栓剂、小包剂、糖衣丸、颗粒剂、散剂、用于重构的散剂或与固体载体一起的胶囊剂。本文所述的纳米颗粒，单独或与其他活性成分组合地，优选地以药物组合物的形式，可以通过合适的递送途径施用，例如口服、肿瘤内、直肠、鼻腔、局部或眼部途径，或通过吸入或其他胃肠外途径。在一些实施方案中，组合物被配制用于肿瘤内、静脉或口服给药。

对于口服给药，单独的或与另一种活性成分组合的纳米颗粒可以以固体形式提供，例如片剂或胶囊，或以溶液、乳剂或悬浮液提供。为制备口服组合物，可以配制单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒以产生例如每天约0.01至约50mg/kg或每天约0.05至约20mg/kg或每天约0.1至约10mg/kg的剂量。口服片剂可包括与相容的药学上可接受的赋形剂(例如稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)混合的活性成分。合适的惰性填料包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。示例性液体口服赋形剂包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟基乙酸淀粉钠、微晶纤维素和海藻酸是示例性的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶。如果存在，润滑剂可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣以延迟在胃肠道中的吸收，或者可以用肠溶衣包衣。

口服胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊。为制备硬明胶胶囊，可将活性成分与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊可通过将活性成分与水、油(如花生油或橄榄油)、液体石蜡、短链脂肪酸单甘油酯和双甘油酯的混合物、聚乙二醇400或丙二醇混合来制备。

用于口服给药的液体可以是悬浮液、溶液、乳剂或糖浆的形式，或者可以被冻干或呈现为干燥产品以用于在使用前用水或其他合适的载体重构。此类液体组合物可选地包含：药学上可接受的赋形剂，例如助悬剂(例如，山梨糖醇、甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)；非水性载体，例如油(例如杏仁油或分馏椰子油)、丙二醇、乙醇或水；防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)；润湿剂，如卵磷脂；(如果需要)和调味剂或着色剂。

组合物可以配制成栓剂用于直肠给药。对于肠胃外使用，包括静脉内、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、鼻内或皮下途径，纳米颗粒，单独或与其他活性成分组合地，可以以无菌水溶液或悬浮液的形式提供，缓冲至适当的pH和等渗性，或以肠胃外可接受的油形式提供。合适的水性载体可以包括林格氏溶液(Ringer’s solution)和等渗氯化钠。这些形式可以单位剂量形式存在，例如安瓿瓶或一次性注射器；或以多剂量形式存在，例如可以从中取出适当剂量的小瓶；或以可用于制备可注射制剂的固体形式或预浓缩物存在。说明性的输注剂量范围为与药物载体混合的药剂约1至1,000μg/kg/分钟，输注时间为数分钟至数天。

对于经鼻、吸入或口服给药，单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒，可以使用(例如)也含有合适载体的喷雾制剂给药。

对于局部应用，单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒优选配制成乳膏或软膏或适用于局部给药的类似载体。对于局部给药，单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒可以以约0.1％至约10％的药物对载体的浓度与药物载体混合。施用单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒的另一种模式，是可以利用贴剂制剂来实现透皮递送。

在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含单独的或与其他活性成分组合的纳米颗粒，以及甲基纤维素。在某些实施方案中，甲基纤维素处于约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％至约1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素处于约0.1％至约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素处于约0.1％至约1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素处于约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.8％或1％的悬浮液中。在某些实施方案中，甲基纤维素处于约0.5％的悬浮液中。

在某些实施方案中，“预防性”治疗意指延缓疾病、疾病症状或医疗状况的发展，抑制可能出现的症状，或降低疾病或症状发展或复发的风险。在某些实施方案中，“治愈性”治疗包括降低现有疾病、症状或病症的严重程度或抑制其恶化。

本领域的普通技术人员可以在说明书的教导内修改制剂以提供用于特定给药途径的多种制剂。特别地，单独或与其他活性成分组合的纳米颗粒，可以被修饰以使得它们更易溶于水或其他载体。改变特定纳米颗粒(单独或与其他活性成分组合地)的给药途径和给药方案，以便控制本发明化合物的药代动力学以在患者中获得最大有益效果，这也在本领域的普通技术范围内。

E.示例性实施例

在一些实施方案中，本发明涉及预防和/或治疗与实体瘤相关的疾病或病症。本发明提供了用于治疗受试者实体瘤的方法、组合和药物组合物，尤其是使用有效量的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含a)包含非细胞生物相容性材料的内核，b)和包含源自血小板的细胞膜的外表面，c)用于治疗此类实体瘤的免疫调节剂，它是一种Toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂，例如雷西莫特。在以下文献中描述了某些示例性实施例：Bahmani，B.，Gong，H.，Luk，B.T.等人，使用包裹着血小板的纳米颗粒进行肿瘤内免疫治疗可增强实体瘤的抗肿瘤免疫力(Intratumoral immunotherapy using platelet-cloaked nanoparticles enhances antitumor immunity in solid tumors)，Nat Commun12，1999(2021)。https：//doi.org/10.1038/s41467-021-22311-z，出于所有目的，其公开内容通过引用整体并入本文。

长期以来，人们一直认为能够以有针对性的方式向患者输送药物或控制药物释放的纳米颗粒系统是有益的。特别是纳米颗粒已被证明能够定位到特定的组织或细胞类型，从而减少不需要治疗的身体的其他区域的药物量。这在治疗癌症等疾病时很重要，在这种情况下，必须将治疗定位于患病部位，以减少毒性、有时危及生命的不良反应。这在癌症免疫治疗中也特别重要，以避免免疫系统过度激活，免疫系统过度激活可能导致自身免疫性疾病或细胞因子风暴。

提供此类靶向治疗和/或控释的疗法还必须提供有效量的药物。制备平衡每个纳米颗粒的大小(以具有有利的递送特性)和与每个纳米颗粒相关的药物量的纳米颗粒系统可能是一个挑战。此外，为了使治疗的治疗效果最大化，增加纳米颗粒在患病部位的停留时间是有利的。

因此，需要新的纳米颗粒制剂及其制备方法，它们可以递送治疗水平的药物来治疗癌症，同时还诱导对此类癌症的免疫力并减少患者的副作用。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗性纳米颗粒系统，其包括用于免疫调节的活性剂，其为TLR7/8激动剂和生物相容性聚合物。例如，本发明公开的一种治疗性纳米颗粒，其包含约1％至10％重量百分比的治疗性免疫调节剂(例如雷西莫特)，约50％至99％重量百分比的生物相容性聚合物，以及约20％至50％重量百分比的血小板膜。例如，生物相容性聚合物可以是均聚物(如聚(乳酸)均聚物)，或二嵌段共聚物(例如聚(乳酸-共-乙醇酸)酸)。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过靶向肿瘤的纳米颗粒治疗实体瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的纳米颗粒，该纳米颗粒包含a)包含非细胞材料的内核，b)包含源自血小板的细胞膜的外表面；c)用于治疗此类实体瘤的免疫调节剂，它是TLR7/8激动剂，例如雷西莫特。

本发明公开的纳米颗粒的直径可以是，例如，约85至约140nm。公开的治疗性纳米颗粒在-80℃下在蔗糖溶液中可以稳定至少5天。当置于37℃的磷酸盐缓冲溶液中时，本发明公开的纳米颗粒可基本上立即释放约80％的治疗剂。

在一些实施方案中，本发明涉及包含治疗剂的聚合物纳米颗粒及其制备方法。

在一些实施方案中，“纳米颗粒”是指具有小于1μm的直径的任何粒子。本发明公开的治疗性纳米颗粒可包括具有约85至140nm直径的纳米颗粒，其包含约1％至10％重量百分比的免疫调节剂，其是TLR激动剂(例如雷西莫特、咪喹莫特或莫托莫德)。本文公开的纳米颗粒可包括一种或多种生物可降解聚合物。

聚合物

在一些实施方案中，本发明公开的纳米颗粒包括聚合物基质。本发明公开的纳米颗粒通常包括一种聚合物，例如单体聚合物或二嵌段共聚物。本发明公开的治疗性纳米颗粒包括治疗剂，其可以与聚合物基质的表面结合、包封在聚合物基质内、被聚合物基质包围和/或分散在整个聚合物基质中。

用于形成纳米颗粒的多种聚合物和方法在纳米医学和药物递送领域是已知的。根据本发明可以使用任何聚合物。聚合物可以是天然或合成聚合物。聚合物可以是均聚物或包含多种单体的共聚物。提出的聚合物可以是生物相容的和/或可生物降解的。生物相容性通常是指没有或减少会导致毒性的免疫系统对材料的急性排斥反应。评估生物相容性的一项简单测试可以是在体外将聚合物暴露于细胞。非生物相容性聚合物可能会在中等浓度下引起显著的细胞死亡，而生物相容性聚合物则不会。可生物降解通常是指聚合物在诸如身体的生理环境中进行化学和/或生物降解的能力。可生物降解的聚合物是那些在被引入细胞中时通过生物(例如，通过细胞组织)或化学(例如，通过水解)方式分解成生物相容性(例如，不会对细胞产生显著毒性作用)成分的聚合物。

在一些实施方案中，术语“聚合物”给出了其IUPAC定义，例如，高相对分子质量的分子，其结构基本上包括实际上或概念上衍生自低相对分子质量的分子的多个重复单元。重复亚基可能相同，或者在某些情况下，聚合物内存在多于一种类型的重复亚基。所公开的粒子可以包括共聚物，在一些实施例中，其描述了已经与各自缔合的多种聚合物，通常通过将相应的聚合物共价键合在一起。

在一些实施方案中，聚合物可以是聚酯，包括包含乳酸单元的均聚物，例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D，L-丙交酯，在本文中统称为“PLA”；以及包含乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，在本文中统称为“PLGA”。PLA和PLGA是生物相容和可生物降解的聚合物。

在一些实施方案中，本发明公开的纳米颗粒可具有基本上球形的构造，尽管纳米颗粒在膨胀或收缩时可采用非球形构造。本发明公开的纳米颗粒的直径可以小于1μm。在特定实施方案中，本发明公开的纳米颗粒具有大约85-140nm的直径。

本发明公开的纳米颗粒可以具有基本上球形的构造，尽管纳米颗粒在膨胀或收缩时可以采用非球形构造。本发明公开的纳米颗粒具有小于1μm的直径。在特定实施方案中，本发明公开的纳米颗粒具有大约85-140nm的直径。

在一些情况下，纳米颗粒的内部比粒子的表面更疏水。例如，粒子的内部相对于粒子的表面可能是相对疏水的，并且药物或其他有效载荷可能是疏水的，并且容易加载到相对疏水的纳米颗粒核中。因此，有效载荷可以包含在粒子的内部，这可以保护它免受纳米颗粒周围的外部环境的影响。因此，加载到给予患者的纳米颗粒中的有效载荷将受到保护，免受患者身体的影响，并且身体也可以在至少一段时间内免受暴露于有效载荷的影响。

在一个实施方案中，本发明包括一种纳米颗粒，该纳米颗粒包含a)包含非细胞生物相容性材料的内核，b)包含源自血小板的细胞膜的外表面，c)用于治疗此类实体瘤的免疫调节剂，其是一种TLR7/8激动剂，例如雷西莫特。

纳米颗粒的制备

在一些实施方案中，本发明的另一方面涉及制备所公开的纳米颗粒的系统和方法。在一个特定的实施方案中，本文所述的方法形成具有大量封装的免疫治疗剂(1-10％重量百分比)的纳米颗粒。

在一个实施方案中，提供了纳米乳液工艺。例如，将治疗剂和聚合物(例如PLA或PLGA)与有机溶液混合以形成第一有机相。这样的第一相可以包括约5％至约10％重量的固体。第一有机相可以与第一水溶液合并以形成第二相。有机溶液可以包括，例如乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯甲醇、胆酸钠、吐温80等，及其组合。在一个实施方案中，有机相可包括苯甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷及其组合。第二相可以在约1％至10％重量比例之间。水溶液可以是水，(可选地)与胆酸钠、乙酸乙酯和苯甲醇中的一种或多种组合。

油相可使用与水相最低限度混溶的溶剂。因此，当以足够低的比例混合和/或当使用用有机溶剂预饱和的水时，油相保持液态。可以将油相乳化成水溶液，并且作为液滴，使用例如高能分散系统(例如均化器或超声仪)剪切成纳米颗粒。乳液的含水部分，也称为“水相”，可以是由胆酸钠组成并用乙酸乙酯和苯甲醇或其组合预饱和的表面活性剂溶液。

乳化第二相以形成乳液相可以在一个或两个乳化步骤中进行。例如，可制备初级乳液，然后乳化形成细乳液。可以使用简单混合、高压均质化、探头超声处理、搅拌或通过转子定子均质化来形成初级乳液。可通过使用探头超声仪或高压均化器，例如通过采用1次或多次通过均化器，让初级乳液形成为细乳液。例如，当使用高压均化器时，所用压力可为约5,000至约15,000psi。

需要进行稀释的溶剂蒸发以完成溶剂的提取和固化颗粒。水淬可用于更好地控制提取动力学和更具可扩展性的过程。例如，可将乳液稀释到冷水中至足以溶解所有有机溶剂以形成淬灭相的浓度。淬灭可在1-5℃的温度下进行。

可以过滤溶解相以回收纳米颗粒并去除未包封的药物。超滤膜可用于浓缩纳米颗粒悬浮液并去除有机溶剂、游离药物和表面活性剂。过滤可以通过切向流过滤(TFF)系统进行。例如，通过使用孔径适合保留纳米颗粒同时允许较小的试剂通过的膜，可以选择性地分离和浓缩纳米颗粒。可以使用具有300-500kDα的截留分子量的示例性膜。在纯化和浓缩纳米颗粒悬浮液之后，颗粒可以通过一个或多个除菌过滤器。

在制备纳米颗粒的示例性实施方案中，形成有机相，其由治疗剂(例如瑞西莫特)和聚合物(PLA)的混合物组成。有机相可以以大约1：4.65的比例(油相：水相)与水相混合，其中水相由表面活性剂和(可选的)溶解溶剂组成。然后可以通过使用转子定子均化器将两相组合来形成初级乳液。然后通过使用高压均化器将初级乳液形成为细乳液。然后可以通过在混合下加入去离子水来淬灭这种细乳液。示例性的淬灭剂：乳液比可以是大约1∶1。然后可以通过离心或超滤/渗滤分离形成的纳米颗粒。

膜包衣

在一些实施方案中，源自血小板的细胞膜可用于包被本发明所公开的纳米颗粒。血小板膜具有特定的生物学特性，可以通过与患病部位的特定靶点结合来增加在患病部位的停留时间。因此，本发明所公开的纳米颗粒可以具有用于免疫相容性和结合/粘附至生物组分的血小板模拟特性。

F.实施例

实施例1.制备纳米颗粒-乳化法

在此实施例中，形成了有机相，其由治疗剂(例如瑞西莫特)和聚合物(PLA)的混合物组成。有机相与水相以大约1∶4.65的比例(油相：水相)混合，其中水相由表面活性剂(胆酸钠)和一些溶解溶剂(7vol％乙酸乙酯)组成。使用有机相中7％的固体。

通过使用转子定子均化器以12,000转/分的速度将两相结合90秒，从而形成初级粗乳液。转子定子产生均匀的乳状溶液。转子定子被用作形成粗乳液的标准方法，尽管高速混合器可能适用于更大规模。

然后通过使用高压均化器将初级乳液形成为细乳液。初级乳液在10,000psi下通过均化器两次。连续通过高压均化器(Microfluidics International Corporation LM-20)后，粗乳液的大小不会显著影响粒径。尺度对粒径的影响表现出尺度依赖性。趋势表明，较大的批次会产生较小的粒径。表1总结了示例性乳化参数。

表1.乳化工艺参数

参数	值
		粗乳液形成	转子定子
均质机进料压力	10000psi
		互动室	75μm Y-chamber
通过均质机次数	2-3次
		水相[胆酸钠]	0.2％
W∶O比	4.65∶1
		油相中[固体]	7％

然后在混合下加入1-5℃的去离子水，将细乳液淬灭。在淬灭单元操作中，将乳液在搅拌下加入冷的水溶液淬灭剂中。这用于提取大部分油相溶剂，有效地硬化用于下游过滤的纳米颗粒。冷却淬灭显著改善了药物包封。淬灭剂∶乳液比约为1∶1。表2总结了示例性淬灭工艺参数。

表2.淬灭工艺参数

参数	值
		初始淬灭温度	1-5℃
淬灭剂∶乳液比例	1∶1
		淬灭保持/处理温度	1-5℃

然后通过切向流过滤方法分离纳米颗粒，以浓缩纳米颗粒悬浮液，并将溶液中的溶剂、游离药物和表面活性剂缓冲交换到水中。使用的再生纤维素膜的截留分子量(MWCO)为300kDa。表3总结了使用的示例性TFF参数。

表3.TFF方法参数

参数	值
		1膜材料	再生纤维素
MWCO	300kDa
		流速	～220mL/min
纳米颗粒浓度	6mg/mL
		渗滤体积数	6个渗滤体积
膜面积	235cm2

在TFF过程之后，将纳米颗粒悬浮液通过除菌过滤器(0.2μm)。表4总结了示例性使用的示例性参数，以及获得的示例性特征。

表4.参数汇总

实施例2.体外释放

体外释放方法用于确定纳米颗粒在37C时的初始爆发相释放。透析系统旨在维持水槽条件并防止纳米颗粒进入释放样品。透析系统如下：将8％蔗糖中的3mL雷西莫特纳米颗粒浆液(约5mg/mL PLA纳米颗粒，对应于约250μg/mL雷西莫特浓度)置于20kDa MWCO透析盒中。将透析盒放入带有浮标和搅拌棒的1L磷酸盐缓冲液中，并以150rpm的速度持续搅拌。在溶解前测试样品的雷西莫特浓度以确定每个透析盒中雷西莫特的总剂量。在每个预定时间点，从每个溶出杯中取出1mL样品并放入HPLC小瓶中用于HPLC分析。

实施例3.粒度分拆

通过动态光散射(DLS)分析粒度。DLS使用Malvern Instruments Nano ZSzetasizer仪在25℃下进行。DLS的输出与纳米颗粒的流体动力学半径相关，其包括血小板膜包被。

实施例4.使用包裹着血小板的纳米颗粒的瘤内免疫法增强结直肠腺癌的抗肿瘤 免疫力

瘤内免疫疗法是一种新兴的治疗实体瘤的方法，可以诱导局部和全身抗肿瘤免疫。Toll样受体(TLR)激动剂已显示出引发先天性和适应性免疫反应的希望。然而，这些激动剂的全身给药通常会导致不良副作用的发生，从而限制了它们的临床应用。在此，研究了通过血小板膜包被的纳米颗粒(PNP-R848)局部递送TLR激动剂雷西莫德(R848)是否可以在结直肠肿瘤模型中引发有效的抗肿瘤反应。天然膜包被提供了一种增强与肿瘤微环境相互作用的简便方法，从而在低药物剂量下最大化R848的生物活性。作为一种单一疗法，PNP-R848的瘤内给药可显著增强局部免疫激活，并导致100％的小鼠肿瘤完全消退，同时提供绝对保护，防止反复和侵袭性的肿瘤再攻击。PNP-R848的动员对抗肿瘤免疫至关重要的免疫细胞群的增强的能力使其能够显著优于更传统的R848制剂。本文公开的发现强调了使用仿生纳米载体在局部递送免疫刺激有效载荷的前景，其具有增强的生物相容性和天然靶向亲和力等优势，可用于开发针对多种实体瘤的安全有效疗法。

本文报道了用于R848瘤内递送的血小板膜包裹的纳米颗粒(PNP)的开发。源自人类血小板的质膜及其大量蛋白质、糖蛋白和脂质赋予血小板模拟特性，例如选择性粘附到肿瘤微环境中的细胞³⁷。细胞膜包被是一种提高生物相容性的简便方法，同时使纳米颗粒平台能够通过多模式相互作用有效地与生物靶标(如肿瘤)相互作用³⁸。结果表明，装载R848的PNP(PNP-R848)在肿瘤部位表现出延长的保留时间，并改善了肿瘤微环境内的细胞相互作用。这使得纳米制剂能够在瘤内给药时发挥显著的生物活性，即使是在全身给药时无效的低R848剂量下也是如此。在MC38小鼠结直肠腺癌模型中，显示PNP-R848促进引流淋巴结(DLN)内APC的强烈激活并增加免疫浸润。这最终导致了一种有效的抗肿瘤反应，促进了对已建立肿瘤的完全短期排斥，同时赋予了长期免疫力，以防止反复和高度侵袭性的肿瘤再攻击。

纳米颗粒合成与表征

鉴于血小板与其他细胞类型和组织的多种相互作用^39-44，我们的目标是利用这些独特的能力来设计一个包含自然靶向能力的纳米颗粒平台。这是通过将通过差速离心和冻融过程从人血小板中分离出来的膜通过超声处理直接包被到合成的聚乳酸(PLA)纳米颗粒核上来完成的³⁷。通过流式细胞仪在血小板膜影的表面证实了磷脂酰丝氨酸、P-选择素、GPIbα和整合素αIIbβ3的存在(图1a)。血小板活化后，磷脂酰丝氨酸、P-选择素和完整的αIIbβ3复合物在膜表面表达^45-48。GPIbα负责血管假性血友病因子(von Willebrand factor)介导的血小板粘附⁴⁹。P-选择素、αIIbβ3和GPIbα都与癌症发病机制有关，表明与肿瘤细胞的重要相互作用⁵⁰。尽管膜处于激活状态，但对凝血酶和二磷酸腺苷的额外测定证实了这些负责传播血栓形成反应的血小板激活分子的成功去除，从而减轻了安全问题(图1b，c)。物理化学表征表明，膜包被略微增加了裸露的PLA纳米颗粒核以及裸露的负载R848的纳米颗粒核(NP-R848)的尺寸(图1d)。此外，所有样品的表面zeta电位相似(图1e)。透射电子显微镜显示，最终的PNP-R848配方具有核壳结构，外面有一层膜包被(图1f)。最后，研究了随着时间的推移R848有效载荷的释放，裸NP-R848和包被的PNP-R848配方的曲线非常匹配，其中超过80％的封装有效载荷在前24小时内被释放(图1g)。

纳米颗粒与肿瘤的相互作用

为了评估PNP与实体瘤细胞类型的相互作用，在体外研究了结合和摄取。将荧光染料标记的纳米颗粒与一组小鼠和人类癌细胞(包括MC38、HT-29、4T1和MDA-MB-231)一起孵育，结合研究在4℃下进行，摄取研究在37℃下进行。通过流式细胞术观察到，与聚乙二醇(PEG)包被的纳米颗粒(PEG-NP)对照相比，PNP更容易与所有四种癌细胞结合(图2a)。这些结果与细胞摄取密切相关，在所有细胞系中，PNP的细胞摄取也明显高于PEG-NP(图2b)。考虑到PNP在体外与MC38细胞的相互作用增强，接下来测试了PNP在体内MC38肿瘤模型中的保留时间。在允许肿瘤建立后，小鼠接受单次瘤内注射染料标记的PEG-NP或PNP，并在7天的过程中使用实时成像系统跟踪纳米颗粒(图2c，d)。最初，肿瘤内存在的纳米颗粒数量有类似的下降。随着时间的推移，两组之间的差异增加，并且在48小时观察到最大的对比，此时平均保留35％的PNP，而只有11％的PEG-NP保留在肿瘤内。综上所述，这些研究表明，与更传统的PEG包被相比，血小板膜包被能够显著增加纳米颗粒对MC38肿瘤细胞的亲和力，该膜包被显示为已知的在癌细胞结合中发挥作用的表面标记⁵¹。

体外免疫刺激活性

为了直接评估R848有效载荷的生物活性，将PNP-R848与表达TLR7或TLR8的人类报告细胞系一起孵育，TLR7或TLR8提供响应

激活的比色读数(图3a，b)。将细胞与游离的R848或PNP-R848孵育21小时，结果表明在相同的药物浓度下，两者的活性大致相当。正如预期的那样，没有载药的PNP纳米颗粒显示出最小的TLR7和TLR8激活。接下来，研究了PNP-R848对骨髓来源细胞(BMDCs)的生物学效应，并且观察到该制剂可以诱导CD80和CD86的上调，这两种APC成熟标记物可作为介导下游免疫反应的共刺激信号(图3c，d)。CD80和CD86的表达水平与游离R848诱导的表达水平相当，表明将有效载荷加载到纳米颗粒中不会影响其有效的免疫调节活性。此外，还评估了PNP-R848引发BMDC产生促炎细胞因子(如IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL-12的能力(图3e-g)。在与各种浓度的游离R848或PNP-R848孵育后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析培养物上清液。对于所研究的每种细胞因子，结果显示两种样品都具有相似的剂量依赖性释放模式。空PNP，无论血小板膜是来自人类还是小鼠，都不会诱导明显的APC成熟或细胞因子分泌；这支持了PNP-R848引发的免疫反应主要是由包含R848有效载荷驱动的观点^52，53。

纳米颗粒与免疫细胞的相互作用

接下来，评估了PNP制剂与各种BMDC亚群的相互作用(图3h，i)。对于所有检测的细胞亚型，包括CD45⁺白细胞、CD11b⁺巨噬细胞和CD11c⁺树突细胞，与PEG-NP相比，PNP显示细胞结合和摄取的显著增加。据信，BMDCs对PNP的增强摄取可能有助于在先前研究中观察到的细胞因子释放增加。接下来研究了肿瘤内施用染料标记的PEG-NP和PNP后不同时间点纳米制剂与肿瘤细胞群的体内相互作用(图3j-1)。总的来说，与PEG-NP相比，肿瘤细胞总数对PNP的摄取明显更高，这通过荧光强度的显著增加得到证明。当评估肿瘤中的免疫细胞亚群时，在所有时间点的CD45⁺白细胞和CD11c⁺树突状细胞中也观察到更高的PNP摄取。

在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效

在免疫活性C57BL/6小鼠中使用MC38小鼠结肠腺癌模型评估PNP-R848的抗肿瘤功效(图4a)。每只动物在右侧腹接受1×10⁶个MC38细胞的皮下注射，允许平均肿瘤大小达到～30-40mm³。此时，小鼠开始接受以下治疗之一：8％蔗糖作为阴性对照、游离R848、载有R848的PEG-NP(PEG-NP-R848)或PNP-R848，每种药物剂量为每次注射15μg。每隔一天进行肿瘤内治疗，总共3次，之后定期监测小鼠以评估治疗效果(图4b-e)。PNP-R848治疗后肿瘤迅速消退，观察到100％的小鼠肿瘤完全根除。当用游离R848或PEG-NP-R848治疗时，肿瘤生长显著延迟，但大多数小鼠在治疗开始后约30天出现明显的疾病进展。最后，游离R848和PEG-NP-R848治疗均产生了28.6％的长期存活率。当药物剂量减少2.5倍至每次注射6μg R848时，还评估了治疗效果(图6)。在这种情况下，87.5％的用PNP-R848治疗的小鼠完全拒绝肿瘤攻击，28.6％的小鼠在用PEG-NP-R848治疗后存活。有趣的是，较低剂量的游离R848优于相应的较高剂量治疗，长期存活率为62.5％。没有一种治疗对小鼠的体重有显著影响，表明没有急性毒性。还应注意的是，没有任何R848负载的PEG-NP和PNP都没有对小鼠的无进展生存期产生统计学上的显著影响(图7)。

为了确定存活的动物是否对MC38癌细胞产生了长期免疫力，在第一次治疗开始后56天，在小鼠右侧腹皮下接种了3倍高的接种物(图4c，d)。对于接受过任一剂量PNP-R848治疗的幸存者，第二次肿瘤攻击的拒绝率为100％。虽然用6μg剂量的游离R848治疗的动物最初表现出62.5％的存活率，但在肿瘤再次攻击后总体存活率下降到37.5％，表明针对MC38细胞的适应性免疫反应的发展效率低下。其他组中其余存活的动物都拒绝了再次攻击，在初始治疗开始后至少100天没有观察到肿瘤进展。这些结果表明，虽然游离R848表现出抗肿瘤活性，但它在引发持久免疫方面不如PNP-R848制剂有效。值得注意的是，在初始治疗后140天，用PNP-R848治疗的小鼠都拒绝了用5倍高剂量癌细胞进行的第二次再攻击(图4c，d)。

还评估了PNP-R848联合化疗的疗效(图8)。虽然瘤内施用63μg高剂量的游离多柔比星可延长生存期，但与PNP-R848治疗相比，改善幅度不大。当结合这两种治疗方式时，尽管在治疗开始后6天体重减轻超过10％，表明存在毒性，100％的小鼠在最初的肿瘤攻击中存活下来。尽管初步结果令人鼓舞，但所有接受多柔比星治疗的小鼠(无论有无PNP-R848)在再次受到3倍高剂量癌细胞的攻击后均死亡。鉴于白细胞减少通常是化疗的副作用⁵⁴，这些结果突出表明需要完整的免疫反应才能实现持久的抗肿瘤保护。

治疗对体内免疫细胞群的影响

为了阐明与治疗功效相关的免疫反应，在按照与上述相同的时间表施用低剂量游离R848或PNP-R848后7天收集来自荷瘤小鼠的DLN。PNP-R848能够显著提高CD11b⁺和CD11c⁺APC亚群上主要组织相容性复合体II(MHC-II)的表达，MHC-II是一种成熟标记物(图5a)。在游离R848处理后，相同细胞群中未观察到MHC-II表达的显著差异。有趣的是，第7天DLN中CD3⁺ T细胞的总体百分比响应PNP-R848处理而下降(图5b)，这也适用于CD8⁺T细胞的比例(图5c)。在存在的T细胞中，CD4⁺群体的效应记忆(CD44^hiCD62L^low)和中央记忆(CD44^hiCD62L^hi)表型的比例显著升高(图5d)。由于观察到DLN中T细胞百分比的下降，因此评估这是否是由于它们迁移到肿瘤中所致。对肿瘤组织进行组织学切片并针对各种免疫细胞亚群进行染色(图5e，f)。实际上，与游离R848相比，在用PNP-R848处理的小鼠肿瘤中发现CD4⁺和CD8⁺T细胞密度增加。总体而言，数据表明PNP-R848通过改善组织保留，能够增强DLN中APCs的刺激，从而更好地启动T细胞及其随后向肿瘤中的募集。这最终导致了肿瘤根除和记忆T细胞的产生，以对抗随后的肿瘤再攻击。

在小鼠乳腺癌模型中的抗肿瘤功效

进一步评估PNP-R848作为针对实体瘤的普遍治疗的适用性，在使用BALB/c小鼠建立的同源小鼠4T1三阴性乳腺癌模型中测试了抗癌功效(图9a)。每只动物的右侧腹皮下植入5×10⁵个肿瘤细胞，在使用8％蔗糖、游离R848、PEG-NP-R848或PNP-R848以每次注射15μg的药物剂量进行治疗之前，允许平均肿瘤大小达到约30-40mm³。小鼠每隔一天接受治疗，共治疗5次，并监测肿瘤大小和无进展生存期(图9b-d)。与MC38模型类似，PNPR848的给药导致4T1肿瘤生长的显著抑制。使用PNP-R848治疗，无进展生存期延长至23天，而对照组为9天。游离R848和PEG-NP-R848均表现出中等水平的抗肿瘤功效。这种趋势也反映在第一次治疗后的第30天，当时肿瘤被切除并称重(图9e，f)。值得注意的是，PNP-R848对肺部转移结节的数量有显著影响，将每个肺的结节平均数量从对照组的50多个减少到3个(图9g)。

讨论

在这里，报道了一种新型仿生递送载体，可在肿瘤部位局部保留有效的免疫调节剂。TLR7激动剂家族刺激树突状细胞活化和随后的T细胞启动，从而导致肿瘤特异性T细胞免疫反应和免疫^33，55，56。有一些报道表明，通过静脉内或腹腔内途径全身给药R848可促进抗肿瘤免疫反应，但通常需要高药物剂量才能达到治疗效果^18，57。在一种情况下，携带MC38肿瘤的小鼠被给予总计600μgR848，但未观察到肿瘤完全消退⁵⁷。相比之下，已经表明，以更适度的剂量局部递送R848，有时与化疗结合，可以导致肿瘤完全消退和长期保护性免疫^58，59。应该注意的是，仅当与其他免疫刺激剂联合使用时，通常观察到肿瘤内R848具有相当大的疗效^59，60。数据表明，仿生血小板衍生膜增加了PNP-R848与肿瘤微环境中各种细胞的相互作用，从而提高局部递送后R848在肿瘤部位和周围淋巴组织的生物利用度。与之前的研究相比，这使得所需的R848剂量显著减少，同时保持其治疗潜力。即使在每只小鼠18μg的低总剂量下，在MC38结直肠肿瘤模型中几乎所有单独接受PNP-R848的小鼠都观察到完全缓解。

不希望受任何特定理论的束缚，假设肿瘤内施用的PNP-R848能够通过触发局部炎症反应和激活常驻APCs来实现肿瘤消退，其中一些APCs可以迁移到DLN并促进随后引发的T细胞流入肿瘤组织。早在治疗后7天就观察到细胞毒性CD8⁺细胞浸润到肿瘤中，这对应于疗效研究中肿瘤尺寸开始缩小。该数据证实了最近的发现，即肿瘤内激活TLR7/8会改变肿瘤微环境并诱导免疫细胞浸润到肿瘤中³²。此外，观察到的DLN中效应和中央记忆T细胞的增加支持系统适应性抗肿瘤免疫的发展。当用更具侵略性的肿瘤植入方案再次攻击时，在用PNP-R848瘤内治疗后根除初始MC38肿瘤的动物表现出强大的免疫力，并在2周内完全排斥新植入物。值得注意的是，在PNP-R848治疗后，在4T1乳腺癌模型中也观察到肺转移显著减少。

总之，已经开发出一种仿生纳米制剂，它利用血小板膜包被来增强用于肿瘤内癌症免疫治疗的免疫刺激有效载荷的递送和保留。包被膜的纳米颗粒有效地与癌细胞相互作用，使得体内肿瘤保留增强，并最大限度地提高封装的R848有效载荷的活性。在结直肠癌的免疫活性小鼠模型中，用PNP-R848治疗能够完全根除肿瘤生长，带来长期抗肿瘤免疫，使所有存活的小鼠都能拒绝随后的再次攻击。该制剂的有效活性在三阴性乳腺癌小鼠模型中得到进一步证实，其中实现了转移显著减少。这种局部递送小分子免疫调节剂的方法可以很容易地应用于多种实体瘤类型，为引发有效的免疫反应提供了一种有意义的策略，可以大大提高临床患者治疗效果。

方法

血小板膜的制备和表征。人富血小板血浆(PRP)从圣地亚哥血库获得。为了收集血小板膜，PRP首先用由以下组成的缓冲液稀释2倍：140mM NaCl(Fisher Chemical)，2.7mMKCl(Fisher Chemical)，3.8mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES；Acros)，5mM乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(Bioworld)，和2μM前列腺素E1(PGE1；AdooQBioScience)，随后以2,000g不减速离心15分钟。去除上清液，用含有以下混合物的裂解缓冲液重悬血小板：75mM NaCl、6mM NaHCO₃(Fisher Chemical)、1.5mM KCl、0.17mM Na₂HPO₄(Fisher Chemical)、0.5mM MgCl₂(Alfa Aesar)、20mM HEPES、1mM乙二胺四乙酸(FisherChemical)、1μM PGE1、0.01％NP40表面活性剂(Boston Bioproducts)和蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific)。血小板膜是通过反复冻融过程获得的。血小板混合物在-80℃下冷冻，在室温下解冻，然后以21,100g离心10分钟沉淀。然后将沉淀重悬于裂解缓冲液中，再重复冻融两次。反复洗涤后，将膜悬浮在水中以包被到纳米颗粒核上。

使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Life Technologies)对总膜蛋白浓度进行定量分析。流式细胞术用于探测血小板膜上特定表面标志物的表达，使用了FITC偶联的膜联蛋白V(Biolegend)、Alexa488偶联的抗人P-选择素(AK4；Biolegend)、Alexa647偶联的抗人GPIbα(HIP1；Biolegend)和Alexa647偶联的抗人αIIbβ3(PAC-1；Biolegend)。将探针与纯化的血小板膜在磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)中在室温下避光孵育30分钟。孵育后，通过以21,100g离心洗涤膜。使用Becton Dickinson Accuri C6流式细胞仪收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。

纳米颗粒合成和物理化学表征。负载R848的纳米颗粒是使用单一乳液工艺合成的。首先，将聚乳酸(PLA；R202H；Evonik)和R848(BOC Sciences)溶解在由苯甲醇(Acros)和乙酸乙酯(Fisher Chemical)组成的有机相中，浓度分别为60mg/mL和10mg/mL。然后将混合物添加到5倍体积的冰冷外相介质中，该介质由含0.2wt％胆酸钠(Alfa Aesar)的10mMTris pH 7.5(Invitrogen)和7vol％乙酸乙酯组成。使用Kinematica Polytron PT 3100匀质器将该溶液以12,000rpm的转速匀化90秒，然后通过Microfluidics LM20微流控器(Microfluidizer)(配备Ychamber)三次。然后将该混合物加入等体积的外相介质中，并在通风橱中以200rpm搅拌、蒸发溶剂过夜。使用相同的程序制备未负载的纳米颗粒核，但有机相中不含R848。血小板膜包被是通过以聚合物与膜的质量比为1：0.7对载有或未负载R848的纳米颗粒核与血小板膜进行超声处理来进行的。聚乙二醇(PEG)包被的纳米颗粒使用与纳米颗粒核相同的程序制备，但使用PEG缀合的PLA(PolySciTech)代替10wt％的未缀合的PLA。为了制备载有1，1′-二十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚二羰花青(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindodicarbocyanine)(DiD；Biotium)的纳米颗粒，将染料以聚合物的0.1wt％比例添加到10mg/mL的PLA丙酮溶液中。然后，将2mL该溶液滴加到4mL水中，形成载有染料的纳米颗粒核。溶剂过夜蒸发后，通过超声处理将纳米颗粒包被上血小板膜。使用Malvern Zetasizer Nano ZS通过动态光散射测量流体动力学纳米颗粒尺寸和表面zeta电位。为了成像，纳米颗粒用0.2wt％乙酸双氧铀(Electron MicroscopySciences)染色，并用FEI Tecnai Spirit G2 BioTWIN透射电子显微镜观察。

药物装载和释放。使用反相超高效液相色谱(UHPLC)方法分析R848负载量。UHPLC系统由二元梯度泵、在线脱气机、自动进样器和Thermo Scientific Vanquish光电二极管阵列检测器组成。R848的分离和定量分析是在3.5μm Waters XBridge^TM C18色谱柱(2.1x150mm)上实现的，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为227nm。流动相A由10mM磷酸钠(Fisher Chemical)和0.1％三乙胺(Acros)组成，pH调节至2.45，而流动相B由100％乙腈(Fisher Chemical)构成。每次分析的采集运行时间为6.5分钟，梯度为：从0到3分钟15％流动相B、从3到5分钟45％流动相B、从5.1到6.5分钟15％流动相B。样品首先在乙腈中稀释，然后在30％乙腈和70％0.1N盐酸(Acros)的混合物中稀释。然后，在用100％乙腈稀释R848制备的一系列六次标准进样后，将它们进样到色谱柱中。PNP-R848的药物释放动力学是在含有0.05％Triton X-100(Alfa Aesar)的PBS中使用20kDa透析盒(Thermo Scientific)进行的。通过带有21号针头的注射器将重构样品转移到透析盒中。溶解实验在37℃下进行，以200rpm的速度搅拌72小时。在不同的时间点抽取样品并通过UHPLC进行分析。

小鼠和人类癌细胞对PNP的体外结合和摄取。MC38小鼠结肠腺癌细胞(Kerafast)和MDA-MB-231人乳腺腺癌细胞(HTB-26；美国典型培养物保藏中心)在添加有10％胎牛血清(Cornlng)的Dulbecco改良Eagle’s培养基(Gibco)中培养。4T1鼠乳腺癌细胞(CRL2539；美国典型培养物保藏中心)在添加有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco)中培养。HT-29人结肠直肠腺癌细胞(HTB-38；美国典型培养物保藏中心)在添加有10％胎牛血清的McCoy’s 5a培养基(Gibco)中培养。对于结合研究，将装载DiD的PNP或PEG-NP与5×105MC38、HT-29、4T1或MDA-MB-231细胞在100μL培养基中孵育。该孵育的最终纳米颗粒浓度为0.2mg/mL。孵育在4℃下进行30分钟，以尽量减少内吞摄取，之后用PBS洗涤细胞3次，并使用流式细胞仪检查。对于摄取研究，孵化改为在37℃下进行10分钟。使用Becton Dickinson Accuri C6流式细胞仪收集数据，并使用FlowJo软件进行分析。

TLR激活测定。按照制造商的指示培养HEK-Blue hTLR7和HEK-Blue hTLR8报告细胞(Invivogen)。对于剂量反应实验，将20μL PNP、游离R848或PNP-R848以10倍所需最终浓度(0.977至1000ng/mL)加载到96孔细胞培养板中。培养的报告细胞用温PBS冲洗，重悬于1mL温PBS中，然后通过轻轻刮擦从培养瓶中分离。在HEK-Blue检测培养基(Invivogen)中将细胞稀释至2.2×10⁵个细胞/mL的浓度，然后立即将180μL细胞悬浮液添加到样品稀释液中。在37℃、5％CO₂中孵育21小时后，测量655nm处的吸光度。

BMDCs上的纳米颗粒活性。所有动物实验均按照加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用机构委员会批准的指南进行。通过CO₂窒息对雌性C57BL/6小鼠实施安乐死。从每只小鼠中分离出完整的胫骨，将其短暂浸入70％乙醇中，并在冰上储存在RPMI细胞培养基(Gibco)中。切割每根胫骨的两端，并使用连接有23号针头的注射器用10mL RPMI冲洗每根骨头。收集骨髓细胞并通过以320g离心9分钟进行洗涤。最后，细胞通过50-μm细胞过滤器(Corning)。对于细胞因子释放和共刺激标记物表征，对BMDC细胞进行计数，并在6孔板中每孔接种500,000个细胞。将不同浓度的游离R848和PNP-R848添加到细胞中，并在37℃下孵育24小时。然后，使用OptEIA小鼠IL-6ELISA试剂盒(BD Biosciences)测定上清液的IL-6释放。清洗细胞并从板上刮下细胞，然后用FITC偶联的抗小鼠CD45(30-F11；BDBiosciences)、PE偶联的抗小鼠CD80(16-10A1；BD Biosciences)和APC偶联的抗小鼠CD86(GL-1；Biolegend)进行染色。使用Becton Dickinson Accuri C6流式细胞仪收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。

BMDC结合和摄取。对于细胞结合研究，载有DiD的PNP或PEG-NP在100μL培养基中以纳米颗粒0.2mg/mL的终浓度与1×10⁶个BMDC细胞一起孵育。在4℃下孵育30分钟，之后用PBS洗涤细胞3次，随后使用FITC偶联的抗小鼠CD45、PE偶联的抗小鼠CD11b(M1/70；Biolegend)和PE/Cy7偶联的抗小鼠CD11c(N418；Biolegend)染色。对于摄取研究，在37℃下孵育10分钟。使用Becton Dickinson Accuri C6流式细胞仪收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。

与肿瘤的体内相互作用。为了发展肿瘤，将1×10⁶个MC38细胞皮下植入6周大的雌性C57BL/6小鼠的右侧腹。使用以下等式计算肿瘤体积：体积＝(长度×宽度²)/2。对于肿瘤保留研究，允许平均肿瘤大小达到100mm³，之后给小鼠施用8％蔗糖作为阴性对照(n＝3)、DiD标记的PNP(n＝3)和DiD-标记的PEG-NP(n＝3)。每只动物接受一次肿瘤内注射，并以相同的采集时间和过滤器设置使用Xenogen IVIS 200系统在不同时间点成像，包括5分钟和1、3、6、24、48、96和168小时。通过IVIS软件分析获取的图像以量化肿瘤的荧光强度并确定肿瘤保留百分比。

为了评估与免疫细胞的相互作用，对有平均体积100mm³的肿瘤的小鼠进行瘤内给药，给予DiD标记的PNP或PEG-NP。在第1、4和24小时，对小鼠进行安乐死，并且通过在含有终浓度分别为1mg/mL和10μg/mL的胶原酶IV(Sigma-Aldrich)和脱氧核糖核酸酶(DNase)typeIV(Sigma-Aldrich)的溶液中消化，将肿瘤组织加工成单细胞悬浮液。使用FITC偶联的抗小鼠CD45和PE/Cy7偶联的抗小鼠CD11c对细胞进行染色。使用Becton Dickinson Accuri C6流式细胞仪收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。

在小鼠MC38肿瘤模型中的治疗效果。将1×10⁶个MC38细胞皮下植入小鼠右侧腹，使其生长至平均大小约为30-40mm³。然后每隔一天对小鼠进行肿瘤内治疗，总共3次。治疗组包括：8％蔗糖(n＝7)、游离R848(n＝7)、PEG-NP-R848(n＝7)和PNP-R848(n＝8)。每个治疗组每次治疗接受15μg R848。所有治疗的注射体积均为30μL，并通过带有31号针头的注射器进行输送。每隔一天监测肿瘤生长和小鼠体重。无进展生存期定义为肿瘤体积＜200mm³。在第一次治疗开始后的第56天，所有排斥初始MC38接种物的小鼠都使用3×10⁶个MC38细胞进行皮下再攻击。PNP-R848治疗组中的小鼠在初始再攻击研究结束时无肿瘤，在第140天用5×10⁶个MC38细胞进行第二次再攻击。对于每次重新攻击，使用5只接受相同MC38肿瘤细胞攻击的幼稚

C57BL/6小鼠作为对照来验证致瘤性。

体内免疫分析。携带MC38肿瘤的小鼠按照与抗肿瘤功效研究相同的时间表进行治疗，使用8％蔗糖(n＝3)、低剂量游离R848(n＝4)和低剂量PNP-R848(n＝4)。然后在第一次治疗后7天对小鼠实施安乐死，并通过使用50-μm细胞过滤器剪切组织，将腹股沟引流淋巴结(DLN)(与肿瘤位于同一侧)处理成单细胞悬液。细胞用不同的抗体染色，包括BV510偶联抗小鼠CD3(17A2；Biolegend)、FITC偶联抗小鼠CD4(RM4-5；eBiosciences)、APC/Cy7偶联抗小鼠CD8(53-6.7；Invitrogen)、PerCP/Cy5.5-偶联抗小鼠CD62L(MEL-14；eBiosciences)、APC偶联抗小鼠CD44(IM7；BD Biosciences)、V500偶联抗小鼠CD45(30-F11；BDBiosciences)、APC偶联抗小鼠MHC-II(M5/114.15.2；Tonbo Biosciences)、APC/Cy7偶联抗小鼠CD11b(M1/70；BD Biosciences)和PE/Cy7偶联抗小鼠CD11c。使用Becton DickinsonAccuri C6流式细胞仪收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。肿瘤组织在福尔马林(Fisher Scientific)中固定24小时，然后转移到70％乙醇中，然后由Moores癌症中心组织技术共享资源(Moores Cancer Center Tissue Technology Shared Resource)进行组织学切片。使用AEC底物对肿瘤切片进行小鼠CD3、CD4和CD8染色，并用Mayer’s苏木精复染。使用Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT幻灯片扫描仪对幻灯片进行成像。

R848剂量降低时小鼠MC38肿瘤模型的治疗效果。将1×10⁶个MC38细胞皮下植入小鼠右侧腹，使其生长至平均大小约为30-40mm³。然后每隔一天对小鼠进行肿瘤内治疗，总共3次。治疗组包括：8％蔗糖(n＝7)、游离R848(n＝8)、PEG-NP-R848(n＝7)和PNP-R848(n＝8)。每个治疗组每次治疗接受6μg R848。所有治疗的注射体积均为30μL，并通过带有31号针头的注射器进行输送。每隔一天监测肿瘤生长和小鼠体重。无进展生存期定义为肿瘤体积<200mm³。在第一次治疗开始后的第56天，所有排斥初始MC38接种物的小鼠都使用3×10⁶个MC38细胞进行皮下再攻击。PNP-R848治疗组中的小鼠在初始再攻击研究结束时无肿瘤，在第140天用5×10⁶个MC38细胞进行第二次再攻击。对于每次重新攻击，使用5只接受相同MC38肿瘤细胞攻击的幼稚

C57BL/6小鼠作为对照来验证致瘤性。

未负载的纳米载体的治疗效果。将1×10⁶个MC38细胞皮下植入小鼠右侧腹，使其生长至平均大小约为30-40mm³。小鼠每隔一天接受瘤内治疗，共四次。治疗组包括：8％蔗糖(n＝5)、PEG-NP(n＝5)和PNP(n＝5)。本研究中使用的纳米颗粒是空的，不含R848。每隔一天监测肿瘤生长和小鼠体重。无进展生存期定义为肿瘤体积＜200mm³。

与多柔比星联合治疗效果。将1×10⁶个MC38细胞皮下植入小鼠右侧，使其生长至平均大小约为30-40mm³。小鼠每隔一天接受肿瘤内治疗，共3次。治疗组包括：8％蔗糖(n＝6)、游离多柔比星(n＝6)和多柔比星+PNP-R848(n＝6)。小鼠每剂接受63μg多柔比星和15μgR848。对于联合治疗，多柔比星和PNP-R848在给药前混合，动物接受一次包含两者的瘤内注射。每隔一天监测肿瘤生长和小鼠体重。无进展生存期定义为肿瘤体积＜200mm³。在第一次治疗开始后的第56天，所有排斥初始MC38接种物的小鼠都使用3×10⁶个MC38细胞进行皮下再攻击。五只接受相同MC38肿瘤细胞攻击的幼稚

C57BL/6小鼠被用作对照来验证致瘤性。

在小鼠4T1肿瘤模型中的治疗效果。将5×10⁵个4T1细胞皮下植入雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腹，使其生长至平均大小约为3040mm3。然后每隔一天对小鼠进行治疗，总共进行5次治疗。治疗组包括：8％蔗糖(n＝6)、游离R848(n＝6)、PEG-NP-R848(n＝6)和PNP-R848(n＝6)。每组每次治疗接受15μg R848。所有治疗的注射体积均为30μL，并通过带有31号针头的注射器进行输送。每隔一天监测肿瘤生长和小鼠体重。无进展生存期定义为肿瘤体积＜200mm³。该研究在第一次治疗后30天终止，并收集了肿瘤和肺。为了对转移性结节计数，用Bouin’s溶液固定肺组织(电子显微镜科学(ElectionMicroscopy Sciences))。

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Claims (92)

1.一种纳米颗粒，其包含：

a)包含非细胞材料的内核；

b)包含源自血小板的细胞膜的外表面；和

c)一种免疫调节剂，它是一种Toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体的上调剂。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述内核包含聚合物。

3.如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物是生物相容的和/或可生物降解的聚合物。

4.根据权利要求2或3所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物是均聚物。

5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其特征在于，所述均聚物包含乳酸单元。

6.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其特征在于，所述乳酸单元包括聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D,L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯或聚-D,L-丙交酯单元。

7.如权利要求2或3所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物是共聚物。

8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其特征在于，所述共聚物包含乳酸和乙醇酸单元。

9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其特征在于，所述乳酸和乙醇酸单元包含聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述内核包含选自由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚赖氨酸和聚谷氨酸组成的组中的生物相容材料或合成材料。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述细胞膜包含源自血小板的质膜。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述细胞膜包括源自血小板的胞内膜。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述外表面包含源自血小板的天然存在的细胞膜。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述外表面包含衍生自血小板的改性膜。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述外表面包含混合膜，所述混合膜包含源自血小板的天然存在的细胞膜和合成膜。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是小分子、多核苷酸、核酸、多肽、蛋白质、肽、脂质、碳水化合物、激素、金属、和/或其组合物或复合物。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是Toll样受体(TLR)激动剂。

18.根据权利要求17所述的纳米颗粒，其特征在于，所述激动剂靶向TLR 1/2、TLR 2、TLR 3、TLR4、TLR 5、TLR 5/6、TLR 7、TLR 8、TLR 9或TLR 10。

19.根据权利要求1-16中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是阿片类生长因子受体的上调剂。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是雷西莫特、咪喹莫特或莫托莫德。

21.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是雷西莫特。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂位于内核内或内核上，内核和外表面之间，或外表面内或外表面上。

23.根据权利要求22所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂的释放由所述纳米颗粒与靶细胞、组织、器官或受试者之间的接触触发，或由所述纳米颗粒周围的物理参数的变化触发。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的内部比所述纳米颗粒的外表面更疏水。

25.根据权利要求24所述的纳米颗粒，其特征在于，所述免疫调节剂是疏水的并且位于所述纳米颗粒的疏水内部。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述内核支撑所述外表面。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的纳米颗粒，其直径为约10nm至约10μm。

28.根据权利要求27所述的纳米颗粒，其直径为约50nm至约1μm。

29.根据权利要求28所述的纳米颗粒，其直径为约70nm至约150nm。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的纳米颗粒，其具有基本上球形的构造或非球形的构造。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的纳米颗粒，其基本上不含细胞膜例如质膜所源自的血小板的成分。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的纳米颗粒，其基本上保持细胞膜例如质膜的的天然结构完整性或活性。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的纳米颗粒，其是生物相容的或可生物降解的。

34.根据权利要求33所述的纳米颗粒，其特征在于，所述内核包含含有乳酸和乙醇酸单元的共聚物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，所述外表面包含源自血小板的质膜，所述免疫调节剂是雷西莫特。

35.根据权利要求34所述的纳米颗粒，其具有在实体瘤中的约48小时至约72小时的半衰期。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的纳米颗粒，其对细胞膜所源自的物种或受试者基本上缺乏免疫原性。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的纳米颗粒，其包含约1％至约10％重量百分比的治疗性免疫调节剂、约50％至约99％重量百分比的生物相容性聚合物和约20％至约50％重量百分比的源自血小板的细胞膜。

38.根据权利要求37所述的纳米颗粒，其包含约1％至约10％重量百分比的雷西莫德、约50％至约99％重量百分比的生物相容性聚合物和约20％至约50％重量百分比的源自血小板的质膜。

39.一种制备纳米颗粒的方法，包括：

a)使免疫调节剂与聚合物接触以在有机溶剂中形成有机相，所述免疫调节剂是toll样受体(TLR)激动剂和/或阿片样物质生长因子受体上调剂；

b)使所述有机相与水相接触以形成初级乳液；

c)将所述初级乳液进行超声处理或高压均化以形成细乳液；

d)从所述细乳液中除去所述有机溶剂以在所述细乳液中形成包含所述免疫调节剂和所述聚合物的纳米颗粒；

e)从所述细乳液中回收所述纳米颗粒。

40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述免疫调节剂是toll样受体(TLR)激动剂，例如雷西莫特、咪喹莫特或莫托莫德。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其特征在于，所述聚合物是包含乳酸和/或乙醇酸单元的均聚物或共聚物。

42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述有机相包含乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯甲醇、胆酸钠、吐温80等，或其组合。

43.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述有机相包含苯甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷，或其组合。

44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述有机相包含约5％至约10％重量固体的所述聚合物和所述免疫调节剂。

45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述水相溶液包含水，可选地与胆酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、乙酸乙酯和苯甲醇中的一种或多种组合。

46.根据权利要求45所述的方法，其特征在于，所述初级乳液包含约1％至约10％重量固体的所述聚合物和所述免疫调节剂。

47.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)可以通过使用简单混合、高压均质化、探头超声处理、搅拌或通过转子定子均质化使所述有机相与水相接触以形成初级乳液来进行。

48.根据权利要求39-47中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)包括使初级乳液一次或多次通过均化器。

49.根据权利要求39-47中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)包括使用约5,000psi至约15,000psi的压力使初级乳液经受高压均质化。

50.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d)包括通过将细乳液稀释到冷水溶液或水中至足以溶解细乳液中的所有有机溶剂以形成淬灭相的浓度来淬灭细乳液。

51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，所述淬灭在约1℃至约5℃的温度下进行。

52.根据权利要求39-51中任一项所述的方法，其特征在于，步骤d)包括通过离心、过滤、超滤或渗滤从细乳液中回收纳米颗粒。

53.根据权利要求52所述的方法，其特征在于，所述过滤、超滤或渗滤使用截留分子量为约100kDa至约500kDa的膜进行。

54.通过权利要求39-53中任一项所述的方法制备的纳米颗粒。

55.根据权利要求39-53中任一项所述的方法，其进一步包括使纳米颗粒与源自血小板的细胞膜接触以形成血小板膜包被的纳米颗粒。

56.一种通过权利要求55的方法制备的纳米颗粒。

57.一种药物递送装置，其包含有效量的权利要求1-38和56中任一项所述的纳米颗粒。

58.根据权利要求57所述的药物输送装置，还包括另一种活性成分，或者医学上或药学上可接受的载体或赋形剂。

59.根据权利要求58所述的药物输送装置，其特征在于，所述另一种活性成分是抗肿瘤剂或物质，例如多西环素。

60.根据权利要求57所述的药物输送装置，其不进一步包含另一种活性成分，例如，不进一步包含另一种抗肿瘤剂或物质，例如多西环素。

61.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-38和56中任一项所述的纳米颗粒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

62.根据权利要求61所述的药物组合物，还包含另一种活性成分。

63.根据权利要求62所述的药物组合物，其特征在于，所述另一种活性成分是抗肿瘤剂或物质，例如多西环素。

64.根据权利要求61所述的药物组合物，其不进一步包含另一种活性成分，例如，不进一步包含另一种抗肿瘤剂或物质，例如多西环素。

65.有效量的权利要求1-38和56中任一项所述的纳米颗粒在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。

66.根据权利要求65所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒被配置用于治疗或预防有需要的受试者的肿瘤。

67.根据权利要求66所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒被配置用于治疗或预防有需要的受试者的实体瘤或癌症。

68.根据权利要求66所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒与另一种抗肿瘤剂或物质联合使用。

69.根据权利要求66所述的用途，其特征在于，所述纳米颗粒单独使用而没有另一种抗肿瘤剂或物质。

70.一种用于治疗或预防有需要的受试者的肿瘤的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-38和56中任一项所述的纳米颗粒、权利要求57-60中任一项所述的药物递送装置，或权利要求61-64中任一项所述的药物组合物。

71.根据权利要求70所述的方法，其用于预防受试者的肿瘤。

72.根据权利要求70所述的方法，其用于治疗受试者的肿瘤。

73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒中的细胞膜源自受试者的相同物种的细胞或源自受试者的细胞。

74.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述受试者是非人类受试者或哺乳动物。

75.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述受试者是人。

76.根据权利要求70-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫调节剂是toll样受体(TLR)激动剂或阿片类生长因子受体的上调剂。

77.根据权利要求70-76中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫调节剂是雷西莫特、咪喹莫特或莫托莫德。

78.根据权利要求77所述的方法，其特征在于，所述免疫调节剂是雷西莫特。

79.根据权利要求70-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是淋巴瘤、白血病、脑癌、神经胶质瘤/成胶质细胞瘤(GBM)、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肝癌、胃癌，乳腺癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、食道癌或头颈癌。

80.根据权利要求70-79中任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是实体癌或肿瘤。

81.根据权利要求70-80中任一项所述的方法，其特征在于，通过肿瘤内、口服、鼻腔、吸入、胃肠外、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、皮内、局部或直肠途径向受试者施用所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物。

82.根据权利要求70-80中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物肿瘤内或原位施用至受试者的癌症或肿瘤部位。

83.根据权利要求70-80中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物肿瘤内或原位施用至受试者的实体癌或肿瘤部位。

84.根据权利要求70-83中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物以约0.01mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用于受试者。

85.根据权利要求70-84中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物与另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素)组合施用于受试者。

86.根据权利要求70-84中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物在没有另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素)的情况下单独施用于受试者。

87.根据权利要求70-86中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于已经用抗肿瘤剂或物质(例如多西环素)治疗的受试者。

88.根据权利要求70-86中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于尚未用另一种抗肿瘤剂或物质(例如多西环素)治疗的受试者。

89.根据权利要求70-88中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物作为一线治疗施用于受试者。

90.根据权利要求70-88中任一项所述的方法，其特征在于，将所述纳米颗粒、药物递送或药物组合物施用于患有复发性肿瘤(例如复发性实体癌或肿瘤)的受试者。

91.根据权利要求70-90中任一项所述的方法，其特征在于，至少约50％的施用的纳米颗粒、药物递送或药物组合物在实体癌或肿瘤中保留至少约40小时。

92.根据权利要求70-90中任一项所述的方法，其在接受至少三个月治疗的受试者中实现至少约80％的存活率。

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