CN102906127A - 来自两性离子聚合物的自组装颗粒以及相关的方法 - Google Patents

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Abstract

有利地自组装成为颗粒的两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物，由所述两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物组装的颗粒，包括所述自组装的颗粒的药物组合物，以及用于使用所述颗粒来递送治疗剂和诊断剂的方法。

Description

来自两性离子聚合物的自组装颗粒以及相关的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月6日递交的美国临时申请号61/259,085的权益。每个申请均明确地在此以其全部通过引用而并入。
政府许可权利声明
本发明是以分别由海军研究办公室、国家科学基金和国家癌症研究所授予的N000140910137，DMR 0705907和U54 CA 119335-04S之下的政府支持进行的。政府在本发明中有一定的权力。
发明背景
纳米颗粒(NP)的稳定性和靶向效率对于将其应用于药物递送和诊断性成像而言是两个最重要的问题。需要涂覆材料以使得NP既稳定又是多功能的，从而解决这两个问题。聚乙二醇(PEG)是为了稳定化的目的而最常被用于修饰NP的材料，这是由于其对于非特异性蛋白吸附的抗性(或非污染特性)。然而，PEG易受氧化损伤并在生物学介质中失去功能，这限制了其长期应用。除了它们在复杂介质中的稳定性之外，NP本身的稳定性是常被忽视的另一个重要的问题。NP需要在任何必要的制造过程（例如离心或冻干）中保持完整。为了维持NP（包括以PEG涂覆的那些）的稳定性，必须使用数种措施（例如低速超滤和在冷冻干燥之前加入冷冻保护剂）。对于靶向药物递送，常常需要将生物识别元件(例如靶向配体)固定在NP表面上。在长的PEG链(例如2-5kDa)的末端仅有一个潜在可用于缀合生物分子的官能团。此外，未反应的官能团可引起非特异性结合，特别是在复杂的介质中（例如血浆和血清）。用所有现存的NP涂覆材料时，人们将必须在出色的稳定性和多功能性之间进行折衷。
尽管有在NP涂覆材料的开发中的进展，存在对于可提供NP超稳定性和多功能性的单一材料或涂覆平台的需求。
发明概述
一方面，本发明提供了嵌段共聚物，其包括:
(a)两性离子聚合物嵌段，其包括聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱);和
(b)疏水性嵌段。
在一个实施方案中，所述两性离子聚合物嵌段包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:
Figure BDA00001747467700021
其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[-(CH2-CR4)n-]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)-O-]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，S，SO，P或PO;
M+是与阴离子中心(A=O)O-相缔合的反离子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;且
n是1至约10,000的整数。
另一方面，本发明提供了嵌段共聚物，其包含:
(a)混合荷电共聚物嵌段，其包含混合荷电共聚物;和
(b)疏水性嵌段。
在一个实施方案中，所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每个重复单元具有下式:
Figure BDA00001747467700031
其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)-OM)是阴离子中心，其中A是C，S，SO，P或PO，并且M是金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)-OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
p是1至约10,000的整数。
对于上文中的聚合物，在一个实施方案中，所述疏水性嵌段包含生物相容性聚合物。在一个实施方案中，所述疏水性嵌段包含均聚物或共聚物。在一个实施方案中，所述疏水性嵌段包含选自下列的聚合物：乳酸乙醇酸共聚物，聚己酸内酯，聚乙交酯，聚乳酸，聚-3-羟基丁酸酯，聚二氧杂环己酮，聚三亚甲基碳酸酯，乙交酯己内酯共聚物，乙交酯三亚甲基碳酸脂共聚物和二氧杂环己酮-三亚甲基碳酸酯-乙交酯共聚物。在一个实施方案中，所述疏水性嵌段具有的数平均分子量为约1,000至约200,000。
一方面，本发明提供了两性离子聚合物缀合物，其包含与聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)，或聚(磷酰基甜菜碱)共价偶联的脂。
在一个实施方案中，所述聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)，或聚(磷酰基甜菜碱)包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
Figure BDA00001747467700041
其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[-(CH2-CR4)n-]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)-O-]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，S，SO，P或PO;
M+是与(A=O)O-阴离子中心相缔合的反离子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;且
n是1至约10,000的整数。
一方面，本发明提供了混合荷电共聚物缀合物，其包含与混合荷电共聚物共价偶联的脂。
在一个实施方案中，所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
Figure BDA00001747467700042
其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)-OM)是阴离子中心，其中A是C，S，SO，P或PO，且M是金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)-OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
p是1至约10,000的整数。
对于上述的缀合物，在一个实施方案中，所述脂是二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰甘油。在一个实施方案中，所述脂选自二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-一甲基-磷酰乙醇胺，16-O-二甲基-磷酰乙醇胺，18-1-反式-磷酰乙醇胺，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方案中，所述脂为二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在其它方面，本发明提供了颗粒。
在一个实施方案中，本发明提供了核-壳聚合颗粒，其包含多个本发明的嵌段共聚物。
在一个实施方案中，本发明提供胶束，其包含多个脂质体缀合物，所述脂质体缀合物包含多个本发明的缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供脂质体，其包含多个本发明的缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供聚合物囊泡（polymersome），其包含多个本发明的嵌段共聚物。
所述颗粒还可包括一种或多种靶向试剂，以及一种或多种治疗剂和/或一种或多种诊断剂。
在其它方面，本发明提供组合物，其包括一种或多种本发明的颗粒和药学上可接受的载体或稀释剂。
在其它方面，本发明提供用于递送治疗剂和/或诊断剂的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的组合物。
附图说明
通过参考下面的详细描述并与附图相结合，将更好地理解从而更容易认可本发明的前述方面以及许多所伴随的优势。
图1是下列的图示：本发明的代表性的两性离子聚合物缀合物PLGA-PCB共聚物的制备;PLGA-PCB/Dtxl NP的形成;以及用靶向配体或诊断性染料对NP进行后官能化。
图2A-2F表明了代表性的两性离子聚合物缀合物纳米颗粒的特征。在冻干和通过吹吸而不超声处理以在水中进行简短重悬之前(图2A)和之后(图2B)的PLGA-PCB NP的扫描电子显微镜检查(SEM)图像。比例尺是1μm。在37°C下、在5天中，在10wt%BSA的PBS溶液和100%FBS中的PLGA-PCB NP稳定性(图2C)。将NP的大小(平均值±SD，n=3)作为时间的函数作图。以三个连续的离心循环对PLGA-PCB NP(图2D)和PLGA-PCB/Dtxl NP(1wt%药物加载)(图2E)在高速离心后的NP稳定性进行测试。在每个离心步骤(16110g，15min)之后，移除或保留上清液并通过吹吸而不超声处理来重悬NP粒状沉淀。在冻干后且没有添加任何冷冻保护剂时，具有1wt%药物加载的PLGA NP，PLGA-PCB NP和PLGA-PCB/Dtxl NP的稳定性(图2F)。对NP大小(平均值±SD，n=3)作图，并且显示了每一个尺寸点所伴的多分散性指数(PDI，平均值±SD，n=3)。
图3A显示了对于以NH2-荧光素缀合的PLGA-PCB NP的研究结果。分别在黑色、蓝色和绿色曲线中显示了没有荧光素处理的裸NP，用荧光素处理的NP(-EDC，+NHS)，以及用荧光素处理的NP(+EDC，+NHS)。与荧光素(绿线)共价结合的NP相对于NP(-EDC+NHS+荧光素)显示出平均荧光强度的巨大增加。以半乳糖官能化的PLGA-PCB/NBD NP与HepG2细胞的结合。用经NH2-半乳糖(+EDC，+NHS)(图3B)和NH2-半乳糖(-EDC，+NHS)(图3C)处理的PLGA-PCB/NBD NP孵育细胞2h。在20h时摄取荧光图像和相衬图并如附图中所示将其结合。
图4是本发明的代表性的两性离子嵌段共聚物DSPC-PCB的制备的图示。
图5A-5D比较了本发明的代表性颗粒(囊泡和胶束)[DSPC/DSPE-PCB 5K(图5A);DSPC/DSPE-PCB 2K(图5B)]和相关的PEG颗粒[DSPC/DSPE-PEG 5K(图5C);DSPC/DSPE-PEG 2K(图5D)]的尺寸排阻色谱结果，其作为摩尔组成的函数。
图6比较了本发明的代表性的颗粒(脂质体)(DSPC/DSPE-PCB 5K)与相关颗粒在37℃下、在PBS中的脂质体稳定性。
图7比较了来自本发明的代表性纳米颗粒PLGA-PCB NP和PLGA NP的多西他赛释放谱。对于两种NP的药物加载都是1wt%。
图8A和8B比较了37°C下、在PBS中的10wt%BSA溶液中(图8A)，和100%FBS溶液(图8B)中的NP稳定性(纳米颗粒大小)。将NP大小(平均值±SD，n=3)作为时间的函数作图。
图9比较了本发明的代表性纳米颗粒PLGA-PCB NP和PLGA NP在HepG2细胞上的细胞存活(细胞毒性)。以所示的浓度用使NP与细胞孵育24h，并立即一式三份对细胞存活进行分析。
发明详述
本发明提供了有利地自组装成为颗粒的嵌段共聚物和缀合物。本发明还包括由所述嵌段共聚物和缀合物组装的颗粒，包括所述自组装颗粒的药物组合物，和利用所述颗粒而用于递送治疗剂和诊断剂的方法。还提供了用于制成所述嵌段共聚物和缀合物以及相关颗粒的方法。
嵌段共聚物
一方面，本发明提供了嵌段共聚物。在一个实施方案中，所述嵌段共聚物是两性离子嵌段共聚物。在另一个实施方案中，所述嵌段共聚物是混合荷电嵌段共聚物。
两性离子嵌段共聚物
在一个实施方案中，本发明提供了两性离子嵌段共聚物。如本文中所使用的，术语“两性离子嵌段共聚物”是指具有两性离子聚合物嵌段的嵌段共聚物。
在一个实施方案中，所述嵌段共聚物是两性离子嵌段共聚物，其包含:
(a)两性离子嵌段，其包括聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱);和
(b)疏水性嵌段。
在一个实施方案中，所述两性离子聚合物嵌段包含多个重复单元，每一个重复单元具有式(I):
Figure BDA00001747467700081
其中
R1选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[-(CH2-CR4)n-]共价偶联的连接子;
L2是将阴离子中心[A(=O)-O-]与阳离子中心共价偶联的连接子;
A是C，S，SO，P或PO;
M+是(A=O)O-阴离子中心相缔合的反离子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;且
*代表所述重复单元与下一个重复单元共价连接的点。
混合荷电嵌段共聚物
在一个实施方案中，本发明提供混合荷电嵌段共聚物。在一个实施方案中，所述嵌段共聚物是混合荷电嵌段共聚物，其包含:
(a)混合荷电共聚物嵌段，其包括聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱);和
(b)疏水性嵌段。
如本文中所使用的，术语“混合荷电嵌段共聚物”是指具有混合荷电聚合物嵌段的嵌段共聚物。
如本文中所使用的，术语“混合荷电共聚物”是指具有聚合物主链、多个带正电的重复单元，和多个带负电的重复单元的共聚物。在本发明的实施中，这些共聚物可通过离子对共聚单体的聚合而制备。
混合荷电共聚物包括多个带正电的重复单元，和多个带负电的重复单元。在一个实施方案中，所述混合荷电共聚物是基本上电中性的。如本文中所使用的，术语“基本上电中性的”是指赋予共聚物有利的非污染特性的共聚物。在一个实施方案中，基本上电中性的共聚物是具有基本上为零的净电荷的共聚物(即具有大约相同数目的带正电的重复单元和带负电的重复单元的共聚物)。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目的比例为约1:1.1至约1:0.5。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目的比例为约1:1.1至约1:0.7。在一个实施方案中，带正电的重复单元的数目与带负电的重复单元的数目的比例为约1:1.1至约1:0.9。
离子对共聚单体.在一个实施方案中，通过合适的可聚合离子对共聚单体的共聚而制备所述共聚物。
可用于本发明的代表性的离子对共聚单体具有式(II)和(III):
CH2=C(R4)-L3-N+(R6)(R7)(R8)  X-            (II)
CH2=C(R5)-L4-A2(=O)-OM                     (III)
在这一实施方案中，混合荷电共聚物具有重复单元，所述重复单元具有式(IV):
Figure BDA00001747467700101
其中
R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
A(=O)-OM)是阴离子中心，其中A是C，S，SO，P或PO，且M是金属或有机反离子;
L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
L4是将阴离子中心[A(=O)-OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
n是1至约10,000的整数;
p是1至约10,000的整数;且
*代表重复单元与下一个重复单元共价连接的点。
在一个实施方案中，R7和R8是C1-C3烷基。
R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心。在一个实施方案中，R6，R7和R8是C1-C3烷基。
在某些实施方案中，L3选自-C(=O)O-(CH2)n-和-C(=O)NH-(CH2)n-，其中n是1至20的整数。在某些实施方案中，L3是-C(=O)O-(CH2)n-，其中n是1-6。
在某些实施方案中，L4是C1-C20烯烃链。代表性的的L4基团包括-(CH2)n-，其中n是1-20(例如1，3或5)。
在某些实施方案中，A是C或SO。
在某些实施方案中，n是5至约5,000的整数。
在一个实施方案中，R4，R5，R6，R7和R8是甲基，L3是-C(=O)O-(CH2)2-，且L4是-CH2-，A1是C或SO，n是5至约5,000的整数。
在上文的式中，聚合物主链包括源自乙烯基单体的乙烯基主链(即-C(R′)(R″)-C(R′″)(R″″)-，其中R′，R″，R′″和R′″独立地选自氢，烷基和芳基)(例如丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，苯乙烯)。
在上面的式中，N+是阳离子中心。在某些实施方案中，所述阳离子中心是季铵(例如与L1，R2，R3和L2相连接的N)。除了铵之外，其它有用的阳离子中心(例如R2和R3，连同N)包括咪唑鎓,三唑鎓,吡啶鎓,吗啉鎓,噁唑烷鎓,吡嗪鎓,哒嗪鎓,嘧啶鎓,哌嗪鎓和吡咯烷鎓。
R1-R8独立地选自氢，烷基和芳基。代表性的烷基包括C1-C10直链和分支的烷基。在某些实施方案中，所述烷基还经一个或多个取代基取代，所述取代基包括例如，芳基(例如-CH2C6H5，苄基)。在一个实施方案中，R2和R3，以及R6，R7和R8是甲基。在一个实施方案中，R1-R8是甲基。代表性的芳基包括C6-C12芳基，这包括例如苯基。对于上面的式的某些实施方案，R2和R3，和/或R6，R7和R8连同N+一起形成阳离子中心。
L1是将阳离子中心与聚合物主链共价偶联的连接子。在某些实施方案中，L1包括使L1的剩余部分与聚合物主链(或单体的可聚合部分)偶联的官能团(例如酯或酰胺)。除了所述官能团之外，L1可包括C1-C20烯烃链。代表性的L1基团包括-C(=O)O-(CH2)n-和-C(=O)NH-(CH2)n-，其中n是1-20(例如n=2)。
L2是将阳离子中心与阴离子基团共价偶联的连接子。L2可以是C1-C20烯烃链。代表性的L2基团包括-(CH2)n-，其中n是1-20(例如1，3或5)。
L3是将阳离子中心与聚合物主链共价偶联的连接子。在某些实施方案中，L3包括使L3的剩余部分与聚合物主链(或单体的可聚合部分)偶联的官能团(例如酯或酰胺)。除了所述官能团之外，L3可包括C1-C20烯烃链。代表性的L3基团包括-C(=O)O-(CH2)n-和-C(=O)NH-(CH2)n-，其中n是1-20(例如n=2)。
L4是将聚合物主链与阴离子基团共价偶联的连接子。L4可以是C1-C20烯烃链。代表性的L4基团包括-(CH2)n-，其中n是1-20(例如1，3或5)。
代表性的烷基包括C1-C30直链和分支烷基。在某些实施方案中，所述烷基进一步经一个或多个取代基取代，所述取代基包括例如芳基(例如，-CH2C6H5，苄基)。
代表性的芳基包括C6-C12芳基，这包括例如苯基，包括经取代的苯基(例如苯甲酸)。
X-是与阳离子中心相缔合的反离子。所述反离子可以是源自阳离子聚合物或单体的合成的反离子(例如Cl-，Br-，I-)。起初由阳离子中心的合成产生的所述反离子也可与其它合适的反离子交换。代表性的疏水性反离子包括羧酸根，例如苯甲酸和脂肪酸阴离子(例如CH3(CH2)nCO2 -，其中n=1-19);烷基磺酸根(例如CH3(CH2)nSO3 -，其中n=1-19);水杨酸根;乳酸根;二(三氟甲基磺酰基)酰胺阴离子(N-(SO2CF3)2);以及它们的衍生物。其它的反离子也可选自氯离子，溴离子，碘离子，硫酸;硝酸;高氯酸(ClO4);四氟硼酸(BF4);六氟磷酸(PF6);三氟甲基磺酸(SO3CF3);以及它们的衍生物。其它合适的反离子包括水杨酸(2-羟基苯甲酸)，苯酸和乳酸。
对于可用于本发明的两性离子聚合物和混合荷电共聚物，聚合度(DP或n)，数平均分子量(Mn)，以及重量平均与数平均分子量之比(Mw/Mn)（也已知为多分散指数），可以变化。在一个实施方案中，聚合物具有的聚合度(n)为1至约10,000。在一个实施方案中，n为约10至约5,000。在另一个实施方案中，n为约100至约3,500。在一个实施方案中，聚合物具有的数平均分子量(Mn)为约200至约2,000,000Da。在一个实施方案中，Mn为约2,000至约100,000Da。在另一个实施方案中，Mn为约20,000至约80,000Da。在一个实施方案中，聚合物具有的重量平均与数平均分子量之比(Mw/Mn.)为约1.0至约2.0。在一个实施方案中，Mw/Mn为约1.1至约1.5。在另一个实施方案中，Mw/Mn为约1.2至约2.0。
在嵌段共聚物中，疏水性嵌段是形成核-壳颗粒的核的共聚物部分。合适的疏水性嵌段包括为生物相容性聚合物的多聚嵌段。所述疏水性嵌段可由均聚物或共聚物组成。两性离子聚合物嵌段或混合荷电共聚物嵌段形成颗粒的壳。
代表性的生物可降解疏水性嵌段包括肽，多酯，多正酯，聚酐，聚酯酰胺和聚氧杂酯，以及它们的衍生物或其组合。
代表性的疏水性嵌段包括选自下列的聚合物：乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)，聚己酸内酯(PCL)，聚乙交酯(PG)，聚乳酸(PLA)，聚-3-羟基丁酸酯，聚二氧杂环己酮，聚三亚甲基碳酸酯，乙交酯己内酯共聚物(MonocrylTM)，乙交酯三亚甲基碳酸脂共聚物(MaxonTM)和二氧杂环己酮-三亚甲基碳酸酯-乙交酯共聚物(BioSynTM)。
在某些实施方案中，所述疏水性嵌段具有的数平均分子量为约1,000至约200,000Da。
可通过制备基于疏水性嵌段的自由基引发剂(经官能化以包括末端自由基引发剂基团的疏水性聚合物)，随后进行合适的羧基甜菜碱单体的聚合而制备所述嵌段共聚物。备选地，可通过将适当官能化的疏水性聚合物(例如末端氨基)与适当官能化的两性离子聚合物(例如末端羧基或其反应活性衍生物)或它们的疏水性衍生物(例如阳离子酯衍生物)共价偶联而制备所述嵌段共聚物。
缀合物
另一方面，本发明提供了缀合物。在一个实施方案中，所述缀合物是两性离子聚合物缀合物。在另一个实施方案中，所述缀合物是混合荷电共聚物缀合物。与上文所述的嵌段共聚物相似，所述缀合物包括疏水部分，所述疏水部分包括所述缀合物自组装形成的颗粒的核。颗粒的壳由两性离子聚合物部分或混合荷电共聚物部分组成。
两性离子缀合物
在一个实施方案中，本发明提供了两性离子聚合物缀合物，其包括与聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱)共价偶联的脂。在另一个实施方案中，本发明提供混合荷电共聚物缀合物，其包含与聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱)共价偶联的脂。
适用于所述缀合物中的脂可选自各种合成的形成囊泡的脂或天然存在的形成囊泡的脂。这些脂包括磷脂，鞘脂和固醇类。所述脂在其极性头部基团处含有适于所述两性离子聚合物或混合荷电共聚物链的共价连接的化学基团，例如胺基，羟基，醛基或羧酸基团。
一个实施方案包括两个烃链，例如磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇(PI)，其中每一个烃链在长度上含有3-24个碳原子并具有不同的不饱和度。
合适的脂包括源自下列的那些：二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂，脑磷脂和脑苷脂。对于二酰基化合物，所述酰基为脂肪酸基团(例如C8-C40)。
在某些实施方案中，所述脂为二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰甘油。
代表性的脂包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-一甲基-磷酰乙醇胺，16-O-二甲基-磷酰乙醇胺，18-1-反式-磷酰乙醇胺，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(反式DOPE)。
在一个实施方案中，所述疏水性部分是二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
对于两性离子聚合物缀合物，所述缀合物的两性离子聚合物部分与上文中对于两性离子聚合物嵌段所描述的相同(即式(I))。
对于混合荷电共聚物缀合物，所述缀合物的混合荷电共聚物部分与上文中对于混合荷电共聚物嵌段所描述的相同(即式(IV))。
可通过使适当官能化的疏水性部分(例如末端氨基)与适当官能化的两性离子聚合物或混合荷电共聚物(例如末端羧基或其反应活性衍生物)或它们的疏水性衍生物(例如阳离子酯衍生物)共价偶联而制备所述缀合物。
在实施例1中描述了本发明的代表性两性离子缀合物、包括治疗性药物的相应颗粒以及所述颗粒的脂质体制剂的制备和特征。
颗粒
在本发明的另一方面，提供了由两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物形成的颗粒。由于所述共聚物和缀合物的性质，可通过在含水环境中的自组装而形成所述颗粒。在含水环境(例如生理环境)中，所述颗粒具有疏水性核心（其包含所述共聚物的疏水部分）和亲水性的壳（其包含所述共聚物的高度带电的两性离子部分）。在另一个实施方案中，所述颗粒具有由所述缀合物构成的胶束的形式。
在某些实施方案中，所述颗粒可具有囊泡结构。在一个实施方案中，所述颗粒具有脂质体的形式，其由所述缀合物和其它形成囊泡的脂配制而成。这些形成囊泡的脂可选自各种合成的形成囊泡的脂或天然存在的形成囊泡的脂。这些脂包括磷脂，鞘脂和固醇类。在另一个实施方案中，所述颗粒具有聚合物囊泡的形式，其是由所述共聚物配制的。对于负荷（例如治疗剂和/或诊断剂）的递送，核-壳纳米颗粒和胶束适于包裹疏水性负荷，而脂质体和聚合物囊泡优选亲水性负荷，虽然也可包裹疏水性负荷。
在另一个实施方案中，本发明提供包含多种本发明的两性离子缀合物的颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒还包括一种或多种形成囊泡的脂。
在一个实施方案中，所述颗粒是核-壳纳米颗粒。
在一个实施方案中，所述颗粒是聚合物囊泡。
在一个实施方案中，所述颗粒是胶束。
在一个实施方案中，所述颗粒是脂质体。
核-壳纳米颗粒和胶束可用于涂覆疏水颗粒。疏水颗粒包括金属颗粒(例如金，银，铁氧化物，量子点)和多聚颗粒。
在某些实施方案中，所述颗粒具有的平均流体动力学直径为约5至约5000nm。在某些实施方案中，所述颗粒具有的平均流体动力学直径为约5至约500nm。在其它实施方案中，所述颗粒具有的平均流体动力学直径为约5至约200nm。具有大于肾小球孔的直径(约5nm)的刚性NP可有效地减少肾过滤，因而增加血液循环时间。肿瘤脉管系统具有比正常组织更大的孔径(40-80nm或甚至1μm)，因而允许合适大小的NP被动渗漏到肿瘤中，这被称为增强的透过和保留(EPR)效应。
治疗剂.在某些实施方案中，本发明的颗粒还包括一种或多种治疗剂。可根据本发明使用的示例性治疗剂包括小分子，有机金属化合物，核酸，蛋白(包括多聚蛋白，蛋白复合物，肽)，脂，碳水化合物，激素，金属，放射性元素和化合物，药物，疫苗，免疫学试剂，和/或它们的组合。
在一些实施方案中，所述治疗剂是具有药物活性的小分子和/或有机化合物。在一些实施方案中，所述治疗剂是临床上使用的药物。在一些实施方案中，所述药物是抗癌试剂，抗生素，抗病毒试剂，抗HIV试剂，抗寄生虫试剂，抗原生动物试剂，麻醉剂，抗凝剂，酶的抑制剂，甾体试剂，甾体或非甾体的抗炎剂，抗组胺试剂，免疫抑制剂，抗肿瘤试剂，抗原，疫苗，抗体，解充血剂，镇静剂，阿片样试剂，止痛剂，解热剂，生育控制试剂，激素，前列腺素，促孕剂，抗青光眼试剂，眼科试剂，抗胆碱能试剂，止痛剂，抗抑郁剂，抗精神病试剂，神经毒素，安眠药，安定剂，抗惊厥剂，肌肉舒缓剂，抗帕金森试剂，抗痉挛剂，肌肉收缩剂，通道阻断剂，缩瞳剂，抗分泌试剂，抗血栓形成剂，抗凝剂，抗胆碱能试剂，β-肾上腺素能阻断剂，利尿剂，心血管活性试剂，血管活性试剂，血管舒张剂，抗高血压剂，血管生成试剂，细胞外基质相互作用调节剂(例如细胞生长抑制剂和抗粘附分子)，DNA、RNA或蛋白合成的抑制剂。
在某些实施方案中，小分子试剂可以是任何药物。在一些实施方案中，所述药物是已被适当的政府机构或管理部门认为在人或动物中使用是安全和有效的药物。例如，FDA在21C.F.R.§§330.5，331至361，以及440至460中列出的批准用于人类应用的药物，其在此通过引用而并入;FDA在21C.F.R.§§500至589中列出的用于兽用的药物，其在此通过引用而并入。所有列出的药物都被认为对于根据本发明使用是可接受的。
适用于本发明的类别和具体药物的更完整的列表可在下列中找到：Pharmaceutical Drugs:Syntheses，Patents，Applications by AxelKleemann and Jurgen Engel，Thieme Medical Publishing，1999和Merck Index:An Encyclopedia of Chemicals，Drugs and Biologicals，Ed.by Budavari et al，CRC Press，1996，二者均在此通过引用而并入。
在本发明的某些实施方案中，所述治疗剂是核酸(例如DNA，RNA，其衍生物)。在一些实施方案中，所述核酸试剂是功能性RNA。一般地，“功能性RNA”是不编码蛋白而属于其成员典型地在细胞内具有一种或多种不同的功能或活性的RNA分子类别的RNA。将领会，具有不同序列的功能性RNA分子的相对活性可以不同并且可至少部分地依赖于RNA存在于其中的特定细胞类型。因此，本文中使用的术语“功能性RNA”是指一类RNA分子并且不意在暗示此类的所有成员都将在任何特定的条件下实际上展现出所述类别的特征性活性。在一些实施方案中，功能性RNA包括诱导RNAi的实体(例如短的干扰性RNA(siRNAs)，短的发夹RNA(shRNAs)和微小RNA)，核糖酶，tRNA，rRNA，可用于三螺旋形成的RNA）。
在一些实施方案中，所述核酸试剂是载体。如本文中所使用的，术语“载体”是指核酸分子(通常但不必须是DNA分子)，其可转移与其相连的另一个核酸。载体可实现宿主细胞中的额外染色体复制和/或与其相连的核酸的表达。在一些实施方案中，载体可实现整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施方案中，载体用于指导蛋白和/或RNA表达。在一些实施方案中，待表达的蛋白和/或RNA是所述细胞通常不表达的。在一些实施方案中，待表达的蛋白和/或RNA是所述细胞通常所表达的，但是与未将所述载体递送至所述细胞时所表达的相比，表达水平更低。在一些实施方案中，载体指导本文所述的任何功能性RNA（例如诱导RNAi的实体，核糖酶）的表达。
在一些实施方案中，所述治疗剂可以是蛋白或肽。术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可以可互换地使用。在某些实施方案中，肽的大小的范围为5至约5000，5至约1000，约5至约750，约5至约500，约5至约250，约5至约100，约5至约75，约5至约50，约5至约40，约5至约30，约5至约25，约5至约20，约5至约15，或约5至约10个氨基酸。
多肽可含有L-氨基酸，D-氨基酸，或二者并且可含有本领域中已知的任何种类的氨基酸修饰或类似物。有用的修饰包括，例如末端乙酰化，酰胺化。在一些实施方案中，多肽可包含天然的氨基酸，非天然的氨基酸，合成的氨基酸，以及它们的组合，如本文中所描述的。
在一些实施方案中，治疗剂可以是激素，促红细胞生成素，胰岛素，细胞因子，用于疫苗接种的抗原，生长因子。在一些实施方案中，治疗剂可以是抗体和/或其特征性部分。在一些实施方案中，抗体可包括但不限于多克隆，单克隆，嵌合(即“人源化的”)，或单链(重组)抗体。在一些实施方案中，抗体可具有降低的效应子功能和/或双特异性分子。在一些实施方案中，抗体可包括Fab片段和/或由Fab表达文库产生的片段(例如Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，Fv，dsFv双体抗体，和Fd片段)。
在一些实施方案中，所述治疗剂是碳水化合物。在某些实施方案中，所述碳水化合物是与蛋白相缔合的碳水化合物(例如糖蛋白，蛋白聚糖)。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物也可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物可以是简单或复杂的糖。在某些实施方案中，碳水化合物是单糖，这包括但不限于葡萄糖，果糖，半乳糖和核糖。在某些实施方案中，碳水化合物为二糖，这包括但不限于乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和纤维二糖。在某些实施方案中，碳水化合物是多糖，这包括但不限于纤维素，微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，甲基纤维素(MC)，右旋糖，右旋糖酐，糖原，黄原胶，结冷胶，淀粉和支链淀粉。在某些实施方案中，碳水化合物是糖醇，这包括但不限于甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。
在一些实施方案中，所述治疗剂是脂。在某些实施方案中，所述脂是与蛋白相缔合的脂(例如脂蛋白)。可根据本发明使用的示例性的脂包括但不限于油脂、脂肪酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、必需脂肪酸、顺式脂肪酸、反式脂肪酸、甘油酯、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、激素、类固醇(例如胆固醇，胆酸)，维生素(例如维生素E)，磷脂，鞘脂和脂蛋白。
在一些实施方案中，所述脂可包含一种或多种脂肪酸基团或其盐。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可包含可消化的、长链(例如C8-C50)、经取代或未取代的烃。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可以是下列的一种或多种：丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山萮酸或二十四烷酸。在一些实施方案中，所述脂肪酸基团可以是下列的一种或多种：棕榈油酸，油酸，十八碳烯酸，亚麻油酸，α-亚麻油酸，γ-亚麻油酸，花生四烯酸，鳕烯酸，花生四烯酸，十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸或芥酸。
诊断剂.在某些实施方案中，本发明的颗粒还包括一种或多种诊断剂。在一些实施方案中，诊断剂包括商业上可获得的成像剂，其用于正电子放射断层造影术(PET)，计算机辅助断层造影术(CAT)，单光子放射计算机断层造影术，x-射线，荧光镜检查和磁共振成像(MRI);抗呕吐剂;和造影剂。在MRI中用作造影剂的合适的材料的实例包括钆螯合剂，以及铁，镁，锰，铜和铬。可用于CAT和x-射线成像的材料的实例包括基于碘的材料。
在一些实施方案中，诊断和/或治疗剂可以是放射性核素。在所使用的放射性核素中，γ-发射体，正电子-发射体和X射线发射体是适于诊断和/或治疗目的的，而β发射体和α-发射体也可用于治疗。用于本发明的合适的放射性核素包括但不限于123I，125I，130I，131I，133I，135I，47Sc，72As，72Se，90Y，88Y，97Ru，100Pd，101mRh，119Sb，128Ba，197Hg，211At，212Bi，212Pb，109Pd，111In，67Ga，68Ga，67Cu，75Br，77Br，99mTc，14C，13N，15O，32P，33P和18F。
在一些实施方案中，诊断剂可以是荧光，发光或磁性部分。荧光和发光部分包括各种不同的有机或无机小分子，通常被称作“染料”、“标记物”或“指示剂”。实例包括荧光素，罗丹明，吖啶染料，Alexa染料，青蓝染料。荧光和发光部分可包括各种天然存在的蛋白及其衍生物，例如经遗传工程化的变体。例如，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)，增强的GFP，红色，蓝色，黄色，青色和宝石蓝色荧光蛋白，礁珊瑚荧光蛋白。发光蛋白包括萤光素酶，水母发光蛋白及其衍生物。众多荧光和发光染料和蛋白是本领域中已知的(见例如美国专利申请公开2004/0067503;Valeur，B.，"Molecular Fluorescence:Principles andApplications,"John Wiley和Sons，2002;Handbook of FluorescentProbes and Research Products，Molecular Probes，第9版，2002;以及The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies，Invitrogen，第10版，可在Invitrogen的网址获得)。
在一些实施方案中，诊断剂可以是可通过某些诊断方法检测的纳米颗粒，例如量子点，铁氧化物，金纳米颗粒，纳米棒或纳米壳，碳纳米管，纳米板，二氧化硅保护的纳米颗粒或这些纳米材料的组合。
在某些实施方案中，本发明的颗粒还包括一种或多种治疗剂和/或一种或多种诊断剂。
靶向试剂.在某些实施方案中，所述颗粒(带有或不带有负荷)还包括一种或多种靶向试剂。
可用本发明的聚合物有利地处理可用于治疗和诊断目的颗粒。在某些实施方案中，表面还包括与附着至表面的多种聚合物的部分共价偶联的多种靶标结合伴侣。在此实施方案中，所述靶标结合伴侣具有与靶分子的亲合力。在这些实施方案中，所述表面可被用于诊断性测定中。
靶分子与所述表面的结合亲合力产生自固定在所述表面上的靶标结合伴侣。靶标结合伴侣和靶分子（各自称为结合对成员）形成结合对。每一个结合对成员是特异性结合另一个成员的分子。在一个实施方案中，靶标结合伴侣与靶分子的亲合力具有的Kd为小于约10-8。
结合对成员可以是任何合适的分子，这包括而不限于蛋白，肽，蛋白，多糖或寡糖，糖蛋白，脂和脂蛋白，核酸，以及具有确定的生物学活性的合成的有机或无机分子，例如抗生素、抗炎剂或细胞粘附介导剂。
可被固定在本发明的表面上的蛋白的实例包括配体结合蛋白，凝集素，激素，受体和酶。代表性的蛋白包括抗体(单克隆，多克隆，嵌合，单链或其它重组形式)，它们的蛋白/肽抗原，蛋白-肽激素，抗生蛋白链菌素，抗生物素蛋白，蛋白A，蛋白G，生长因子及它们各自的受体，DNA结合蛋白，细胞膜受体，内体膜受体，核膜受体，神经元受体，视觉受体和肌肉细胞受体。可被固定在本发明的表面上的代表性寡核苷酸包括DNA(基因组的或cDNA)，RNA，反义序列，核糖酶和用于RNA酶P的外部引导序列，并且大小可以从短的寡核苷酸引物直至整个基因。
特异性结合靶化合物的其它靶标结合伴侣包括结合受体的糖蛋白上的多糖或寡糖，例如炎症介导剂P-选择素和E-选择素的配体上的碳水化合物，和结合互补序列的核酸序列，例如核糖酶，反义序列，RNA酶P的外部引导序列和适体。
在一个实施方案中，所述靶标结合伴侣是抗体，且所述靶分子是针对所述抗体的抗原。在这一实施方案中，本发明的表面特异性地结合抗原并抵抗非特异性蛋白吸附。在一个实施方案中，所述靶标结合伴侣是能够促进细胞附着的蛋白，且所述靶分子是细胞。在这种实施方案中，本发明的表面特异性地结合细胞并且抵抗非特异性蛋白吸附和非特异性细胞附着。
WO 2008/083390中描述了使用羧基甜菜碱聚合物表面来固定靶标结合伴侣，在此以其全部通过引用而明确地并入。
药物组合物
在其它方面，本发明提供了组合物，其包括两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物。在某些实施方案中，所述组合物是适于向受试者施用的药物组合物。这些组合物包括药学上所接受的载体或稀释剂。
用于递送治疗剂/诊断剂的方法
在另一个方面，本发明提供使用所述颗粒的方法。
在一个实施方案中，本发明提供用于向需要治疗或诊断的受试者递送治疗剂和/或诊断剂的方法。在所述方法中，向所述受试者施用包含颗粒的组合物，所述颗粒为一种或多种本发明的两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物的颗粒。
下面描述了代表性的两性离子嵌段共聚物和两性离子缀合物，它们的颗粒，以及它们的特征。
在一个实施方案中，本发明提供两性离子材料聚(羧基甜菜碱)(PCB)，其独特之处在于每一个CB侧链具有一个羧酸阴离子基团用于与含有胺的生物分子缀合而同时每一个羧酸阴离子基团与一个阳离子季胺基团配对作为两性离子基团以有效地抵抗非特异性蛋白吸附（甚至是来自复杂介质的）。可通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的化学作用而容易地实现与生物分子的缀合。缀合之后，将未反应的NHS酯基团水解为羧酸阴离子，其与阳离子季胺配对以形成非污染的两性离子结构。然而，对于可官能化的COOH-封端的PEG，未反应的官能团(例如羧酸)可引起严重的污染问题，特别是在复杂的介质中。因此，PCB具有充足的官能团和超低的污染背景（都在一种材料中），这不使得两种很不同的特性（非污染性和官能化）被折衷。当抗体被固定在经PCB涂覆的传感器芯片上时，官能化之后的表面仍保持超低的污染特性(例如<0.3ng/cm2吸附的蛋白，甚至是来自未稀释的血浆和血清的)并且可以高灵敏度检测到血液中的生物标记物。将CB引入到NP表面上改善了药物递送载体的稳定性和多功能性能力。
一方面，本发明提供了基于乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)的药物递送系统。PLGA（经FDA批准）被用于包裹和控制药物释放，这是由于其疏水性质和在含水介质中的缓慢水解性质。在一个实施方案中，本发明提供两性离子嵌段共聚物(例如PLGA-PCB嵌段共聚物)，其自组装为具有PCB-壳的PLGA-核NP用于药物递送。
PLGA-PCB NP显示出稳定化效果，这是由于两性离子CB的强的水合和PLGA-核与PCB-壳之间鲜明的亲水性/疏水性差异。两种嵌段之间的这种差别如此之大以至于没有共同的溶剂或混合溶剂可共溶解PLGA和PCB均聚物。因此，由于所述溶剂问题，PLGA-PCB嵌段共聚物的合成是非常有挑战性的。为了解决这一问题，制备了新的羧基甜菜碱叔丁基(CB-tBu)酯单体(见图1)。不像两性离子CB，CB-tBu是在有机溶剂中具有溶解性的阳离子酯单体，因此其使得能够在共同的溶剂（例如乙腈）中使PLGA与PCB-tBu聚合物共价结合。在与PLGA共价结合之后，可通过在酸性环境（例如三氟乙酸(TFA)）中水解两性离子tBu酯基团而产生CB结构。这种合成途径潜在地拓宽了两性离子CB分子在有机合成中的适用性，使得极性两性离子CB与广泛的疏水分子之间的反应是有可能的。
可通过PLGA(具有适当的末端基团)引发的CB的自由基聚合或通过PLGA与PCB(例如COOH封端的-PLGA与NH2封端的-PCB相偶联)的缀合而制备PLGA-PCB嵌段共聚物。优选后一途径，因为NH2-PCB产物可与广泛的COOH-封端的分子相缀合，所述COOH-封端的分子包括商业上可获得的PLGA，潜在的化学药物和用于稳定化和多功能目的的蛋白或酶。然而，NH2-PCB与COOH-PLGA嵌段的直接缀合是困难的，这是由于它们在两种嵌段的极性方面显著的差异。两性离子PCB仅能够溶解在水或甲醇中，而PLGA不能溶解在水或甲醇中的任一种中。还已知PLGA被痕量的水水解。为了解决这些“溶剂”问题，本发明提供了CB-tBu酯单体(图1)，其在无水有机溶剂（例如乙腈和DMF）中是稳定的并且具有可溶性。通过由带有TFA-NH3 +的引发剂(2-氨乙基2-溴异丁酸)引发的原子转移自由基聚合(ATRP)方法而使CB-tBu酯单体聚合(图1，步骤1)。去除TFA盐之后，获得了在有机溶剂中具有良好的溶解度的PCB-tBu-NH2(图1，步骤2)，这使得能够在无水乙腈中与PLGA-NHS相缀合以形成PLGA-PCB-tBu嵌段共聚物(图1，步骤3)。tBu酯的独特性在于容易通过TFA去除酯基团以产生两性离子CB结构而PLGA在这种酸性环境中保持是完整的(图1，步骤4)。1小时的TFA处理足以完全将PCB-tBu转化为PCB而不破坏其甲基丙烯酸酯部分中的酯键，而直至6小时的TFA孵育将不破坏PLGA的酯主链。PLGA和聚乳酸(PLA)对于酸降解的抗性是已知的。因此，PCB-tBu可被用于用来合成含有一个PCB嵌段和另一个疏水性嵌段的两性嵌段聚合物(例如PLA-PCB或PLGA-PCB)的一般性方法中，虽然所述疏水性部分经受水解。
为了配制PLGA-PCB NP，使用了溶剂置换方法(或纳米沉淀方法)，其中使嵌段共聚物溶解在水可混溶的有机溶剂中。在加入了水之后（其中PCB嵌段是可溶的而PLGA嵌段是不可溶的），形成了有“PLGA核-PCB壳”结构的NP。伴随着搅拌使有机溶剂蒸发，留下含水溶液，其中NP硬化。当将疏水性药物与共聚物在有机溶剂中相混合时，它们在上文所述的过程中被包裹在NP的疏水性核中(图1，步骤5)。由于PLGA和PCB嵌段的极性之间的鲜明差异，有机溶剂可在NP形成中起决定性的作用。单一的溶剂（例如2,2,2-三氟乙醇(TFE)）可溶解PLGA-PCB，主要是由于PLGA在此溶剂中的溶解性，但是这产生具有非均质大小分布(515.8±50.0nm，PDI=0.527±0.056)的大颗粒。这产生自PCB嵌段在TFE中的微观不可溶状态。因此，倒转的“PCB核-PLGA壳”胶束的形成不利于小且均一的NP。为了改善PCB嵌段在TFE中的溶解性，改为使用TFE/MeOH共溶剂，然后以可复制的方式制造了具有单分散大小分布的NP（例如NP大小=148.8±1.1nm;PDI=0.040±0.011(图2A)）。注意，由于TFE在搅拌时容易蒸发，TFE相对于DMSO是优选的。对于典型的配制，PLGA-PCB共聚物自组装成为具有非常低PDI的NP。产率接近100%，通过组装过程没有形成沉淀或微小尺寸的颗粒。因此，不需要使用过滤以去除大颗粒。在溶剂置换过程中不需要表面活性剂，因为两性离子PCB壳使NP在含水介质中稳定化。与聚乙二醇化的NP系统相比较，PCB对于NP分散具有更好的稳定化效果，因为PCB比PEG亲水得多，因而预期在自组装过程中更少的链被PLGA包埋。共聚物嵌段之间鲜明的极性差异促成这种有效的组装成为小且均一的NP。上述获得的PLGA-PCB NP的ζ电位被测量为-43.5±1.0mV，而同样大小的PLGANP(NP大小=145.7±3.9nm;PDI=0.113±0.033)具有的ζ电位为-68.1±1.8mV。
通过上述方法使多西他赛被包裹到PLGA-PCB NP中，并收集药物释放谱。对于制剂中5wt%的初始药物输入，所产生的PLGA-PCB/Dtxl NP具有约1wt%(0.933±0.021wt%)药物加载，大小为138.5±0.6nm，PDI为0.125±0.017，且ζ电位为-34.8±1.3mV。经PCB修饰的和未修饰的PLGA NP在96小时中具有相似的持续药物释放谱，其中在前8小时中释放了50%被包裹的药物。可通过改变PLGA嵌段的长度而进一步调节药物释放动力学;可通过增加PLGA的分子量而延长药物释放的速度。
NP在生物学相关介质（例如血清）中的稳定性决定其作为药物递送媒介用于体内应用的可行性。PCB（其被发现有效减少来自未稀释的血浆和血清的非特异性蛋白在表面上的结合）可在复杂介质中稳定疏水性PLGA NP。在37°C下，将PLGA-PCB NP置于10wt%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液或100%FBS溶液中，并且作为时间的函数测量NP大小。在13小时的研究中，没有观察到经PCB修饰的NP的大小增加，而未修饰的PLGA NP在浸入这些介质中后立即严重凝聚。对于PLGA-PCB NP的长期研究显示出这些颗粒在5天的时间段中、在10wt%BSA和100%FBS介质中都保持其原始大小(图2C)。这表示PLGA-PCB NP可被用于体内药物递送。
从在实验室中产生的NP到其临床应用，配制后或加工时的NP稳定性也是重要的。因为PCB通过静电诱导的水合来结合水，其具有比氢键合材料（例如PEG）更强的水合。所预期的是，两性离子PCB聚合物保护NP免受加工的各步骤的恶劣条件。高速离心被广泛用于形成NP粒状沉淀而用于纯化目的，但是基于PLGA的NP（包括聚乙二醇化的NP）倾向于在粒状沉淀形成过程中凝聚。通过简短吹吸来重悬粒状沉淀因而免除超声处理的需要，由重复的高速离心容易地回收经PCB修饰的PLGA NP（具有或不具有加载的药物）。然而，未修饰的PLGA NP的粒状沉淀一旦形成就不能不进行超声处理而被重悬。特别地，对于经PCB修饰的NP，当在每个离心步骤处去除上清液时(如在标准NP纯化程序中的)，对于PLGA-PCB NP和PLGA-PCB/Dtxl NP分别观察到了大小的6-9%和1-8%的增加（由图2D和2E计算的），伴随PDI的略微降低。在每个循环后获得的更小的PDI未反映那些剩余的NP的单分散性。注意，在每个循环后有略微的大小增加，这不是由NP凝聚引起的。更小的NP在每个离心步骤中较不可能形成粒状沉淀，因此，去除上清液将使所回收的部分的大小分布移向更大的值。为了双重证实这一稳定性问题，进行了平行的实验，其中在离心步骤时间没有去除上清液。发现在重复的离心之后NP保持相同的大小和PDI，这表明在粒状沉淀后，PCB使PLGA NP(包裹或未包裹药物)稳定化而不进行任何凝聚的能力。这是由于NP的PCB壳所产生强的水合层，其使疏水性PLGA核稳定化而不进行机械上诱导的凝聚。
冷冻干燥是NP储存的必要程序，以防止含水储存介质中的聚合物降解和药物渗漏。没有其它基于聚合物的NP可没有冷冻保护添加剂而幸存于冻干。甚至对于聚乙二醇化的NP，也需要添加剂（例如10%蔗糖），因为PEG在冷冻干燥后结晶并丧失其防止NP凝聚的功能。经PCB修饰的PLGA NP没有任何添加剂而在冷冻干燥后保持其稳定性(图2F)。以吹吸（无需超声处理）简短重悬干燥的经PCB修饰的NP（加载或未加载药物）使NP恢复至相同的平均直径和低PDI。在冷冻干燥后，通过SEM也可见这些NP(图2B)。这种行为可产生自强的PCB水合和不同的PLGA/PCB嵌段。不像PEG，PCB强地结合一定量的水分子以防止在冻干过程中结晶。此外，由于两种嵌段之间鲜明的极性对比，共聚物的有效组装使得产生几乎没有缺陷的保护性PCB壳，这使疏水性核甚至在高度脱水的环境中也保持分离。由于其幸存于复杂的生物学介质和恶劣的配制后加工的能力，经两性离子PCB修饰的NP独特地解决了工业和临床稳定性二者所关心的问题。
需要NP的官能化以连接生物分子（例如染料和靶向配体）用于不同的目的。为了检测将那些感兴趣的分子固定到PCB壳上的可行性，使用荧光素作为模式配体来产生荧光NP。在(+)EDC和NHS的存在下，将PCB的羧酸基团转化为NHS酯，并且在之后与荧光素分子中的氨基缀合。为了证实在NP表面上的缀合化学作用，制备了NP而不产生NHS酯作为阴性对照（没有(-)EDC但是+NHS）。在阴性对照中，染料在NP上的任何结合都应当是由于物理相互作用。在荧光素孵育之后，与对照相比，在表面上具有NHS的NP由于其与染料的共价偶联而具有显著更高的荧光强度(图3A)。也评估了PLGA-PCB NP作为靶向药物递送媒介的潜力。使用了绿色荧光染料(NBD)作为“可见的”模式药物并被包裹在NP中。使所产生的PLGA-PCB/NBD NP进一步与经胺修饰的半乳糖配体（具有+EDC和+NHS，或-EDC和+NHS）相缀合，然后用HepG2细胞进行孵育以测试细胞结合能力。半乳糖被广泛用于靶向体外的肝瘤细胞系(例如HepG2)和体内的肝细胞中的去唾液酸糖蛋白受体。具有固定的半乳糖配体的PLGA-PCB/NBD NP(+EDC，+NHS)容易地与细胞结合，因而产生强的荧光，如图3B中所示。不含固定的配体的PLGA-PCB/NBD NP(-EDC，+NHS)产生非靶向且非污染的NP，且因此具有低的细胞结合能力(图3C)。这些荧光素和半乳糖/NBD结果显示出经PCB修饰的NP可被胺封端的分子容易地官能化而用于成像和/或靶向目的。
CB的结构与甘氨酸甜菜碱的结构是相似的，甘氨酸甜菜碱是对于活生物体的渗透压调节极其重要的溶质。估计人的甘氨酸甜菜碱摄入为0.1至2.5g/天。因此，用生物模拟PCB修饰PLGA NP不应给FDA批准的PLGA带来任何毒性。的确，细胞毒性测定显示出，在以直至10mg/ml的NP浓度孵育24h后，PLGA-PCB NP和PLGA NP在HepG2细胞的存活方面相似。这一浓度对于成年人相应于超过500mg/kg体重，这远高于体内药物递送所需的剂量。
实施例2中描述了本发明的代表性纳米颗粒药物递送系统的制备和特征。图7比较了来自本发明的代表性纳米颗粒PLGA-PCB NP与PLGA NP的多西他赛释放谱。对于两种NP的药物加载都是1wt%。相对于未修饰的PLGA，PCB修饰没有很多地改变药物释放行为。图8A和8B比较了在37°C下、在PBS中的10wt%BSA溶液中(图8A)和100%FBS溶液(图8B)中的NP稳定性(纳米颗粒大小)。将NP大小(平均值±SD，n=3)作为时间的函数作图。图9比较了本发明的代表性纳米颗粒PLGA-PCB NP与PLGA NP在HepG2细胞上的细胞存活（细胞毒性）。以所示的浓度使NP与细胞孵育24h，并一式三份立即测定细胞存活。与PLGA NP相似，PLGA-PCB NP在直至10mg/ml的浓度时未显示出细胞毒性。
由于其容易加工，格外的稳定性和未折衷的多官能性，经PCB修饰的NP优于聚乙二醇化的NP。PCB的充足的羧酸阴离子基团使得能够都在一种材料中通过常规的NHS/EDC化学作用而连接靶向配体，治疗性药物和诊断标记物，使PCB成为用于“治疗诊断学”的通用平台。
提供了下列实施例用于阐释而非限制本发明的目的。
实施例1
代表性的两性离子缀合物DSPE-PCB的制备和特征:
在这个实施例中，描述了本发明的代表性两性离子缀合物DSPE-PCB及相关脂质体的制备和特征。图4中阐释了所述缀合物的制备。
DSPE-PCB缀合物
NHS酯引发剂(N-羟基琥珀酰亚胺2-溴丙酸)用于原子转移自由基聚 合(ATRP).在具有磁性搅拌子的圆底摇瓶中，将N-羟基琥珀酰亚胺(2.26g，19.6mmol)和2-溴丙酸(1.45ml，16.4mmol)溶解在500ml的无水二氯甲烷中。将摇瓶冷却至0℃并逐滴加入二氯甲烷中的N,N′-二环己基碳二亚胺(3.35g，16.34mmol)溶液(25ml)。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物过滤并在降低的压力下去除溶剂以给出黄色固体。通过快速色谱进一步纯化产物。获得了2.4g的白色固体(9.63mmol，产率=59%)。1H NMR(氯仿)δ(ppm):1.97和2.00(d，3H，-COOCH(CH3)Br)，2.89(s，4H，-COCH2CH2CO-)，4.64(quar，J=6Hz，1H，-COOCH(CH3)Br)。
2-叔丁氧基-N-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)-N,N-二甲基-2-氧代乙 烷铵(CB-tBu).使5g 2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸甲酯与8.68g溴乙酸叔丁酯在20ml乙腈中、于50°C、在N2保护下反应24h。向反应混合物中加入250ml乙醚后，分离和干燥所形成的白色晶体。将所产生的CB-tBu单体立即储存在-20°C的干燥器中(产率96%)。1H NMR(D2O)δ(ppm):1.44(s，9H，-OC(CH3)3)，1.87(s，3H,CH2=C(CH3)COO-)，3.31(s，6H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，3.98(t，J=3Hz，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，4.28(s，2H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，4.60(t，J=3Hz，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，5.73和6.10(s，2H，CH2=C(CH3)COO-)。
NHS-PCB-tBu.使用Cu(I)Br/HMTETA催化剂，在无水二甲基甲酰胺(DMF)中进行CB-tBu的ATRP。在典型的聚合中，通过用氮气起泡而对DMF和液体HMTETA配体分别进行氧清除。将1g(3.67mmol)CB-tBu单体和125mg(0.5mmol)NHS引发剂加入Schlenk管中。向第二个Schlenk管中加入71.7mg(0.5mmol)Cu(I)Br。通过在氮和真空之间循环三次而使两个管都脱氧。将8和2mL脱氧的DMF分别加入单体/引发剂和Cu(I)Br管中。将136μL(0.50mmol)脱氧的HMTETA加入含有Cu(I)Br的溶液中并在氮保护下搅拌30min。然后，将催化剂溶液(Cu(I)/HMTETA)都加入单体/引发剂溶液中以使反应开始。在室温下使反应过夜进行。聚合之后，使反应在乙醚中完全沉淀。然后，使沉淀物在真空下干燥并重新溶解在最少的DMF(3-5mL)中。涡旋振荡此溶液直至完全溶解并使其在丙酮中沉淀以去除可溶的催化剂和痕量单体。将其总共重复3次以完全去除催化剂。在真空下过夜干燥剩余的酯聚合物并通过NMR进行分析。(754mg，产率=74.5%)。
NHS-PCB和分子量测量.通过水解tBu基团来获得NHS-PCB。将500mg NHS-PCB-tBu溶解在5ml三氟乙酸中。允许其静置2小时。然后使所述溶液在乙醚中沉淀，在真空下过夜干燥。由下列1H NMR(D2O)δ(ppm)确定分子量(例如4,909Da左右):2.82(s，4H，-COCH2CH2CO-，来自引发剂)，3.27(b，6H，-CH2N(CH3)2CH2COO-来自CBMA-1)，4.2和4.5(m，6H，-COOCH2CH2N(CH3)2CH2COO-)。注意，游离的NHS将具有1H NMR(D2O)δ(ppm):2.67(s，4H，-COCH2CH2CO-，来自引发剂)。水相GPC也显示出MW=5410Da，具有PDI=1.03。使用这些MW数据来表征DSPE-PCB中的PCB嵌段的MW。
DSPE-PCB.如所接收的使用1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE，Genzyme Pharmaceuticals)。1H NMR(三氟乙酸-d)δ(ppm):0.907(6H，t，J=6.3Hz，-CH3)，1.344(56H，br s，CH3-(CH2)14-)，1.752(4H，m，CH3-(CH2)14-CH2-,)，2.551(4H，m，CH3-(CH2)15-CH2-)，3.664(2H，s，-CH2-NH3 +)，4.438和4.606(6H，m，-CH2-CH(C17H35COO)-CH2-PO4-CH2-)，5.581(1H，m，sn2-CH)。
对于典型的反应，在30ml氯仿/4.3ml DMF混合溶剂中、在129μl三乙胺的存在下，将120mg NHS-PCB-tBu(PCB的MW为5K)和120mgDSPE搅拌数天。然后蒸发反应混合物并使其在乙醚中沉淀。首先通过乙腈提取沉淀物并将其过滤。蒸发滤过物，用TFA处理4h，使其在乙醚中沉淀并真空干燥。在含有20mM羟基胺的200mM磷酸缓冲液(pH=8)中中和干燥产物，并重复地在PBS、随后在水中经过超滤(30K MW截断)。在此过程中保留纯的DSPE-PCB缀合物并冷冻干燥。(产率=58%)。
证实了DSPE-PCB缀合的形成并通过下列1H NMR(三氟乙酸-d)δ(ppm)确定了摩尔比(DSPE/CB)为1/20:2.567(m，CH3-(CH2)15-CH2-的4H，来自DSPE)，4.637(br m，-CH2-CH(C17H35COO)-CH2-PO4-CH2-的6H，来自DSPE，和-COOCH2CH2N(CH3)2CH2COO-的6H，来自PCB)，5.590(s，sn2-CH的1H，来自DSPE)。此1/20(DSPE/CB)摩尔比表示大约5000Da PCB与一个DSPE分子缀合，这与通过NMR和GPC方法确定的未缀合的PCB的分子量一致。
DSPE-PCB脂质体
在典型的制剂中，以所需的摩尔比将脂组分(例如包括DSPC和DSPE-PCB或商业的DSPE-PEG)混合到2,2,2-三氟乙醇中。通过蒸发形成薄的脂膜。通过在60°C下加入PBS、随后进行3个冻融循环而实现脂膜的水合。在60°C下，将所产生的脂质体通过装配有聚碳酸酯膜(80nm)的
Figure BDA00001747467700301
微型挤压机挤出20次。在PBS中测量颗粒大小及其多分散性指数(PDI)，在水中测量ζ电位。图5A-5D中显示了不同制剂的典型的脂质体大小和ζ电位。一般地，这些脂质体为100nm左右，具有低的PDI数。用Waters Alliance 2695分离组件、通过尺寸排阻色谱(SEC)分析这些脂质体，所述分离组件装配有Waters 2414折射指数检测仪和定制的尺寸排阻柱(TricornTM 10/600柱，填装了SephacrylTMS-500HR色谱介质，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。移动相是25°C下、1ml/min的低速的PBS溶液。应当注意，所测试的DSPE-PCB和DSPE-PEG二者单独在含水溶液中时都将形成胶束。图5A和5B(DSPE-PCB)与图5C和5D(DSPE-PEG)的比较显示出，在相同的分子量内，DSPE-PCB能够更多地掺入到脂质体中而不导致胶束化。在37°C下、在PBS中孵育脂质体以测试其对于凝聚的稳定性。图6显示，仅经DSPE-PCB和DSPE-PEG缀合物修饰的脂质体能够保护脂质体不进行长期凝聚，而缺少这些缀合物的制剂在数小时内开始凝聚。
表1.不同制剂的大小和ζ电位特性。5K或2K代表PCB或PEG聚合物的MW。通过一式三份测量数据并显示为平均值±标准偏差。
Figure BDA00001747467700311
对于DSPE-PCB脂质体的体内循环研究.通过在脂质体配制过程中加入1mol%1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)(Avanti)而荧光标记表2中所列出的所有脂质体。所有这些脂质体制剂都在150nm以下，具有接近单一多分散。在大鼠上评估这些制剂的循环特征。将Sprague Dawley(150g)大鼠随机分组(组大小为3)并用3-5%异氟烷使其麻醉。将200μl每种含有2.3μmol磷脂的脂质体制剂注射通过尾静脉。在5min，4h，8h，24h和48h时，用3-5%的异氟烷暂时麻醉大鼠并从左或右大隐（sophenous）静脉取50-100μl血液。48h后，通过CO2吸入使大鼠安乐死。称量所收集的血液并将其与水/乙腈混合物混合。简短离心之后，以557nm处的激发，就583.6nm处的荧光发射测量上清液。建立了校准曲线以定量这些血液样品中的脂质体剂量。通过一室药物动力学模型使剂量数据vs.时间相符，并且计算了循环半衰期和曲线下面积(AUC)数据，显示在表3中。与DSPE-PEG对应物相比，观察到了DSPE-PCB脂质体的显著更长的循环。例如DSPC/DSPE-PCB 5K(9/1)具有的半衰期为9-10小时，比DSPC/DSPE-PEG5K(9/1)的半衰期（为3-4小时）长得多。
表2.不同制剂的大小和ζ电位特性。5K或2K代表PCB或PEG聚合物的MW。通过一式三份测量数据并显示为平均值±标准偏差。
Figure BDA00001747467700321
表3.不同制剂的体内循环特征。5K或2K代表PCB或PEG聚合物的MW。通过一式三份测量数据并显示为平均值±标准偏差。%ID代表%注射的剂量。
Figure BDA00001747467700322
实施例2
代表性纳米颗粒药物递送系统两性PLGA两性离子嵌段共聚物的制 备和特征
在这个实施例中，描述了本发明的代表性纳米颗粒药物递送系统的制备和特征。
材料.2-溴异丁酰溴，t-Boc-氨乙基醇，2-(二甲基氨基)乙基丙烯酸甲酯，溴乙酸叔丁酯，Cu(I)Br，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(HMTETA)，N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)，2,2,2-三氟乙醇(TFE)和4-氨基苯β-D-半乳糖苷(NH2-半乳糖)购自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。三氟乙酸(TFA)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Acros Organics USA，Morris Plains，NJ。D,L-丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)（具有50:50单体比例）购自Durect Corporation，Pelham，AL。多西他赛(Dtxl)购自LC Laboratories，Woburn，MA。5-(氨甲基)荧光素盐酸和22-(N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-二降-5-胆烯-3β-醇(NBD)购自Invitrogen，Carlsbad，CA。
纳米颗粒制备
2-氨乙基2-溴异丁酸.如下合成具有NH2官能团的ATRP引发剂。简要地，在冰浴中将3.57g 2-溴异丁酰溴加入8ml亚甲基氯中的2.5g t-Boc-氨乙基醇和1.73g三乙胺的溶液中。反应4h后，将盐过滤掉并用饱和的碳酸氢钠溶液提取滤过物。使亚甲基氯相在硫酸镁上干燥并蒸发。用15ml三氟乙酸(TFA)处理所产生的t-Boc-氨乙基2-溴异丁酸2h并在加入乙醚后结晶(产率95%)。1H NMR(DMSO-d6)δ(ppm):1.93(s，6H，-C(CH3)2Br)，3.16(s，2H，TFA-·NH3 +CH2CH2OCO)，4.31(t，J=5Hz，2H，TFA-·NH3 +CH2CH2OCO)，8.22(s，3H，TFA-·NH3 +CH2CH2OCO)。
2-叔丁氧基-N-(2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基)-N,N-二甲基-2-氧代 乙烷铵(CB-tBu单体).使5g 2-(二甲胺)乙基丙烯酸甲酯和8.68g溴乙酸叔丁酯在20ml乙腈中，于50°C、在N2保护下反应24h。向反应混合物中加入250ml乙醚后，分离并干燥所形成的白色晶体。将所产生的CB-tBu单体立即储存在-20°C的干燥器中(产率96%)。1H NMR(D2O)δ(ppm):1.44(s，9H，-OC(CH3)3)，1.87(s，3H,CH2=C(CH3)COO-)，3.31(s，6H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，3.98(t，J=3Hz，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，4.28(s，2H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，4.60(t，J=3Hz，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，5.73和6.10(s，2H，CH2=C(CH3)COO-)。
PCB-tBu聚合物的合成.如下进行CB-tBu单体的ATRP:将74mgCu(I)Br和148.6mg HMTETA置于Schlenk管中并进行三次真空-氮循环。然后，加入7ml脱气的DMF以制成溶液A。类似地，将1.8g CB-tBu单体和80mg 2-氨乙基2-溴异丁酸置于另一个Schlenk管中，完全排除氧，随后加入8ml脱气的DMF以制成溶液B。通过在N2保护下将溶液B转移至溶液A中而使聚合开始。在60°C下反应24h后，首先在乙醚中沉淀聚合物，然后重复地将其溶解在少量的乙醇中并在丙酮中沉淀以去除残留的单体、引发剂和催化剂。进一步使用前，使所产生的PCB-tBu在真空下干燥。
PLGA-b-PCB-tBu缀合.缀合过程是通过NHS/EDC化学作用。简要地，使3.2g COOH封端的PLGA(0.20dl/g)，86.4mg NHS和147.2mgEDC在6ml亚甲基氯中、在室温下反应4h。然后，加入5ml乙醚以获得白色沉淀。用冷的乙醚/甲醇混合物(2/1，v/v)清洗所产生的PLGA-NHS以去除任何NHS和EDC残余物，然后在使用前进行真空干燥。用过量的三乙胺处理TFA-·NH3 +封端的pCBMA-tBu以去除TFA保护。通过过滤纯化NH2封端的pCBMA-tBu，将其沉淀到乙醚中并真空干燥。在50μl三乙胺的存在下、在7ml乙腈中，使878mg NH2封端的PCB-tBu和1.68g PLGA-NHS于60°C下缀合20h。使所产生的PLGA-PCB-tBu在冷的甲醇中沉淀。通过重复清洗循环而去除PCBMA-tBu污染物。证实了PLGA-PCBMA-tBu缀合的形成并通过下列1H NMR乙腈-d3)δ(ppm)确定了重量比(PLGA/PCB)为6/1(摩尔比12.4/1):1.55(m，3H，-COCH(CH3)O-，在PLGA中，和9H，-OC(CH3)3在PCB-tBu中)，3.65(br，6H，-CH2N(CH3)2CH2COOC(CH3)3，在PCB-tBu中)，4.85(m，2H，-COCH2O-，在PLGA中)，5.22(m，1H，-COCH(CH3)O-，在PLGA中)。使用前使聚合物在真空中干燥。
tBu酯基团的水解.在对照实验中，用TFA处理PLGA直至6h未显示出显著的分子量变化，且1h TFA处理后，PCB-tBu在1H NMR(D2O)中在1.44ppm处未显示出信号，这表明tBu酯基团被完全去除了。为了证实在TFA处理之后，甲基丙烯酸酯的酯键未被破坏，在TFA中水解CB-tBu单体1h且通过下列1H NMR(D2O)δ(ppm)将经水解的产物鉴别为CB两性离子单体:1.89(s，3H,CH2=C(CH3)COO-)，3.31(s，6H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，3.98(t，J=3Hz，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，4.48(s，2H，-CH2N(CH3)2CH2COO-)，4.54(s，2H，CH2=C(CH3)COOCH2CH2N(CH3)2CH2-)，5.75和6.06(s，2H，CH2=C(CH3)COO-)。为了获得PLGA-co-PCB，用TFA处理PLGA-co-PCB-tBu1h以去除tBu酯基团。将所产生的PLGA-co-PCB沉淀到乙醚中，并重复地再溶解到小量的TFE中及在乙醚中沉淀。真空干燥之后，共聚物准备好用于配制NP。通过下列1H NMR(三氟乙酸-d)δ(ppm)将重量比(PLGA/PCB)确定为10/1:5.50(m，1H，-COCH(CH3)O-，在PLGA中)，5.10(m，2H，-COCH2O-，在PLGA中)，1.77(d，3H，-COCH(CH3)O-，在PLGA中)，3.64(br，6H，-CH2N(CH3)2CH2COO-，在PCB中)。
通过装配有Waters Ultrahydrogel 1000柱和Waters 2414反射检测器的Waters Alliance 2695分离组件来确定PCB均聚物(源自PCB-tBu聚合物的水解)的分子量和分布。移动相是35°C下、流速为0.7ml/min的100mM NaCl含水溶液。使用来自Polymer Laboratories的聚氧化乙烯作为标准。凝胶渗透色谱显示出分子量(Mn)为13640，具有1.12的多分散性。
PLGA-PCB NP的配制.使用了溶剂置换(纳米沉淀)方法来配制NP。以0.5mg/ml的浓度将PLGA-PCB共聚物溶解在TFE/MeOH 1/1v/v共溶剂中。在1000rpm搅拌下、以逐滴的方式将水(水:有机溶剂体积比为4:1)转移到共聚物溶液中。2h后，将溶剂替换为PBS并通过AmiconUltra-4离心滤器(Millipore，Billerica，MA，US)、以100,000Da MW的截断，将所产生的PLGA-PCB NP浓缩至所需的浓度。如J.Cheng，B.A.Teply，I.Sherifi，J.Sung，G.Luther，F.X.Gu，E.Levy-Nissenbaum，A.F.Radovic-Moreno，R.Langer，O.C.Farokhzad，Biomaterials 2007，28，869中所描述的制备PLGA NP。通过在有机溶剂中与聚合物混合而将多西他赛加载到NP中，随后进行上述程序以配制PLGA-PCB/Dtxl NP。通过Zetasier Nano-ZS(Malvern InstrumentsLtd，Malvern，WR，UK)一式三份地确定NP的平均直径、多分散性指数(PDI)和ζ电位。使用0至1.00范围内的PDI来表征NP大小分布。当PDI<0.10时，认为NP是单分散的。
药物加载和释放动力学.在含有多西他赛的聚合物(PLGA或PLGA-PCB)的纳米沉淀之后，使含有加载了药物的NP的制备溶液和游离药物经过Microcon离心滤器(Millipore，Billerica，MA)，具有100,000Da MW的截断。比较滤过物(含有游离药物)以及所述制备溶液中的药物含量以确定药物加载(药物/聚合物，w/w)。在药物释放研究中，以100μl(0.33mg/ml)/管将加载了Dtxl的NP溶液置于Slide-A-Lyzer MINI透析微管(3500Da MW截断，Pierce，Rockford，IL)中。在37°C下相对于1L PBS透析那些管，伴随轻柔的搅拌。每24h更新PBS。在不同的时间点，取三个微管来确定被NP保留的药物含量。将所有的含水样品与等体积的乙腈过夜混合以在进行HPLC之前完全释放所述药物。一式三份，通过装配有反相C18柱(Econosil，250x4.6mm，5μm，Alltech，Deerfield，IL，USA)和UV检测仪(波长为227nm)的WatersAlliance 2695分离组件来定量多西他赛的含量。移动相是室温下流速为0.5ml/min的水和乙腈(v/v 50/50)。游离Doc的滞留时间为13.75min。
用染料分子和靶向配体使PLGA-PCB NP官能化.可通过EDC/NHS化学作用将目的分子固定到PLGA-PCB NP上。为了缀合染料分子，用400mMEDC和200mM NHS在水中孵育NP 20min，并用纯水清洗以去除未反应的EDC和NHS。使100μl水中0.5mg经NHS活化的NP与10mM硼酸钠缓冲液（pH=9）中浓度为10mg/ml的25μl的5-(氨甲基)荧光素盐酸(Invitrogen，Carlsbad，CA，US)在黑暗处反应2.5h。用pH 9缓冲液和水清洗所产生的染料-NP缀合物，将其重悬于水中，并以0.5mg/ml的浓度用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。为了固定靶向配体，将22-(N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-23,24-二降-5-胆烯-3β-醇(NBD)配制为PLGA-PCB NP，其中起初的药物加载为0.25wt%。用水中的400mM EDC和200mM NHS将所产生的PLGA-PCB/NBD NP活化20min。使100μl水中的0.5mg经NHS活化的NP与10μl 10mM硼酸钠缓冲液（pH=9）中浓度为25mg/ml的NH2-半乳糖反应1h。用pH 9缓冲液和PBS清洗所产生的半乳糖-NP缀合物，并在细胞孵育之前重悬于PBS中。在5%CO2下、于37°C，使HepG2细胞在完全MEM培养基(Hyclone，Logan，UT)中生长在24孔板中以允许50%汇合，所述完全MEM培养基中补充了非必需氨基酸，丙酮酸钠和10%胎牛血清(FBS)。然后用预温热的PBS清洗细胞并用400μl/孔含有NP、不含FBS补充的MEM培养基(PLGA-PCB/NBD-半乳糖NP浓度:1.25mg/ml)进行孵育。2h之后，用PBS清洗细胞并补充以400μl/孔含有FBS的培养基。在37°C下孵育20h之后，使用Nikon TE2000U显微镜观测细胞。对于对照实验，没有EDC，而所有其它的条件和程序都完全相同。
PLGA-PCB NP的细胞毒性测定.使用MTT细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)评价NP的细胞毒性。简要地，在5%CO2下、于37°C，使HepG2细胞在完全MEM培养基中生长在96孔板中以允许80-90%汇合，所述完全MEM培养基中补充了非必需氨基酸，丙酮酸钠和10%FBS。对于每一个孔，用PBS清洗细胞，并用含有不同浓度的PLGA-PCB或PLGA NP的200μl完全培养基孵育24h。用PBS清洗细胞以去除NP，并用100μl完全培养基加上50μl 12mM MTT储液再孵育4h。然后，用150μl DMSO代替含有MTT的培养基，在37°C下进行10min以溶解所形成的晶体。使用SpectraMax M5微板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在570nm处测量吸光度(Abs)，用纯的DMSO作为空白读取。将没有NP孵育的细胞用作对照，且一式三份地评估了NP处理后的细胞存活，其为:细胞存活(%)=Abs样品/Abs对照x100。
虽然阐释和描述了阐释性的实施方案，将领会可在其中进行各种改变而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (54)

  1. 如下限定了要求保护排他的所有权或特权的本发明的实施方案:
    1.嵌段共聚物，其包含:
    (a)两性离子聚合物嵌段，其包括聚(羧基甜菜碱)，聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱);和
    (b)疏水性嵌段。
  2. 2.权利要求1的共聚物，其中所述两性离子聚合物嵌段包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
    Figure FDA00001747467600011
    其中
    R1选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
    R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
    L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[-(CH2-CR4)n-]共价偶联的连接子;
    L2是将阴离子中心[A(=O)-O-]与阳离子中心共价偶联的连接子;
    A是C，S，SO，P或PO;
    M+是与(A=O)O-阴离子中心相缔合的反离子;
    X-是与阳离子中心相缔合的反离子；和
    n是1至约10,000的整数。
  3. 3.权利要求2的共聚物，其中R1，R2和R3独立地选自C1-C3烷基。
  4. 4.权利要求2的共聚物，其中L1选自-C(=O)O-(CH2)n-和-C(=O)NH-(CH2)n-，其中n是1-20。
  5. 5.权利要求2的共聚物，其中L2是-(CH2)n-，其中n是1-20的整数。
  6. 6.权利要求2的共聚物，其中n是10至约1,000的整数。
  7. 7.权利要求2的共聚物，其中M+是金属，铵，或有机离子。
  8. 8.权利要求2的共聚物，其中X-选自卤离子，羧酸根，烷基磺酸根，水杨酸根，乳酸根，二(三氟甲基磺酰基)酰胺阴离子，硝酸根，高氯酸根，四氟硼酸根，六氟磷酸根，三氟甲基磺酸根。
  9. 9.权利要求2的共聚物，其中R1，R2和R3是甲基，L1是-C(=O)O-(CH2)2-，L2是-(CH2)-，A是C或SO。
  10. 10.权利要求1的共聚物，其中所述疏水性嵌段包含生物相容性聚合物。
  11. 11.权利要求1的共聚物，其中所述疏水性嵌段包含均聚物或共聚物。
  12. 12.权利要求1的共聚物，其中所述疏水性嵌段包括选自下列的聚合物：乳酸乙醇酸共聚物，聚己酸内酯，聚乙交酯，聚乳酸，聚-3-羟基丁酸酯，聚二氧杂环己酮，聚三亚甲基碳酸酯，乙交酯己内酯共聚物，乙交酯三亚甲基碳酸脂共聚物和二氧杂环己酮-三亚甲基碳酸酯-乙交酯共聚物。
  13. 13.权利要求1的共聚物，其中所述疏水性嵌段具有约1,000至约200,000的数平均分子量。
  14. 14.嵌段共聚物，其包含:
    (a)混合荷电共聚物嵌段，其含有混合荷电共聚物;和
    (b)疏水性嵌段。
  15. 15.权利要求14的共聚物，其中所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
    Figure FDA00001747467600021
    其中
    R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
    R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
    A(=O)-OM)是阴离子中心，其中A是C，S，SO，P或PO，且M是金属或有机反离子;
    L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
    L4是将阴离子中心[A(=O)-OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
    X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
    n是1至约10,000的整数;且
    p是1至约10,000的整数。
  16. 16.权利要求14的共聚物，其中R1-R8独立地选自C1-C3烷基。
  17. 17.权利要求14的共聚物，其中L3选自-C(=O)O-(CH2)n-和-C(=O)NH-(CH2)n-，其中n是1-20。
  18. 18.权利要求14的共聚物，其中L4是-(CH2)n-，其中n是1-20的整数。
  19. 19.权利要求14的共聚物，其中n是10至约1,000的整数。
  20. 20.权利要求14的共聚物，其中p是10至约1,000的整数。
  21. 21.权利要求14的共聚物，其中M+是金属，铵或有机离子。
  22. 22.权利要求14的共聚物，其中X-选自卤离子，羧酸根，烷基磺酸根，水杨酸根，乳酸根，二(三氟甲基磺酰基)酰胺阴离子，硝酸根，高氯酸根，四氟硼酸根，六氟磷酸根，三氟甲基磺酸根。
  23. 23.权利要求14的共聚物，其中R1-R8是甲基，L3是-C(=O)O-(CH2)2-，L4是-(CH2)-，A是C或SO。
  24. 24.权利要求14的共聚物，其中所述疏水性嵌段包括生物相容性聚合物。
  25. 25.权利要求14的共聚物，其中所述疏水性嵌段包含均聚物或共聚物。
  26. 26.权利要求14的共聚物，其中所述疏水性嵌段包括选自下列的聚合物：乳酸乙醇酸共聚物，聚己酸内酯，聚乙交酯，聚乳酸，聚-3-羟基丁酸酯，聚二氧杂环己酮，聚三亚甲基碳酸酯，乙交酯己内酯共聚物，乙交酯三亚甲基碳酸脂共聚物和二氧杂环己酮-三亚甲基碳酸酯-乙交酯共聚物。
  27. 27.权利要求14的共聚物，其中所述疏水性嵌段具有约1,000至约200,000的数平均分子量。
  28. 28.两性离子缀合物，其包含与聚(羧基甜菜碱)、聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱)共价偶联的脂。
  29. 29.权利要求28的缀合物，其中所述聚(羧基甜菜碱)、聚(磺基甜菜碱)或聚(磷酰基甜菜碱)包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
    Figure FDA00001747467600041
    其中
    R1选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
    R2和R3独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
    L1是将阳离子中心[N+(R5)(R6)]与聚合物主链[-(CH2-CR4)n-]共价偶联的连接子;
    L2是将阴离子中心[A(=O)-O-]与阳离子中心共价偶联的连接子;
    A是C，S，SO，P或PO;
    M+是与(A=O)O-阴离子中心相缔合的反离子;
    X-是与阳离子中心相缔合的反离子;且
    n是1至约10,000的整数。
  30. 30.权利要求28的缀合物，其中所述脂是二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰甘油。
  31. 31.权利要求28的缀合物，其中所述脂选自二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-一甲基-磷酰乙醇胺，16-O-二甲基-磷酰乙醇胺，18-1-反式-磷酰乙醇胺，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(反式DOPE)。
  32. 32.权利要求28的缀合物，其中所述脂是二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
  33. 33.混合荷电共聚物缀合物，其包含与混合荷电共聚物共价偶联的脂。
  34. 34.权利要求33的缀合物，其中所述混合荷电共聚物包含多个重复单元，每一个重复单元具有下式:
    Figure FDA00001747467600051
    其中
    R4和R5独立地选自氢，氟，三氟甲基，C1-C6烷基和C6-C12芳基;
    R6，R7和R8独立地选自烷基和芳基，或与其所连接的氮一起形成阳离子中心;
    A(=O)-OM)是阴离子中心，其中A是C，S，SO，P或PO，且M是金属或有机反离子;
    L3是将阳离子中心[N+(R6)(R7)(R8)]与聚合物主链共价偶联的连接子;
    L4是将阴离子中心[A(=O)-OM]与聚合物主链共价偶联的连接子;
    X-是与阳离子中心相缔合的反离子;
    n是1至约10,000的整数;和
    p是1至约10,000的整数。
  35. 35.权利要求33的缀合物，其中所述脂是二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰甘油。
  36. 36.权利要求33的缀合物，其中所述脂选自：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-一甲基-磷酰乙醇胺，16-O-二甲基-磷酰乙醇胺，18-1-反式-磷酰乙醇胺，1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(反式DOPE)。
  37. 37.权利要求33的缀合物，其中疏水性部分是二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
  38. 38.核-壳聚合物颗粒，其包含多种权利要求1-27中任一项的嵌段共聚物。
  39. 39.权利要求38的颗粒，其还包含治疗剂和/或诊断剂。
  40. 40.权利要求38或39的颗粒，其还包含靶向试剂。
  41. 41.胶束，其包含多种权利要求28-37中任一项的缀合物。
  42. 42.权利要求41的胶束，其还包含治疗剂和/或诊断剂。
  43. 43.权利要求41或42的胶束，其还包含靶向试剂。
  44. 44.脂质体，其包含多种权利要求28-37中任一项的缀合物。
  45. 45.权利要求44的脂质体，其还包含治疗剂和/或诊断剂。
  46. 46.权利要求44或45的脂质体，其还包含靶向试剂。
  47. 47.聚合物囊泡，其包含多种权利要求1-27中任一项的嵌段共聚物。
  48. 48.权利要求47的聚合物囊泡，其还包含治疗剂和/或诊断剂。
  49. 49.权利要求47或48的颗粒，其还包含靶向试剂。
  50. 50.组合物，其包含权利要求38-40中任一项的核-壳聚合颗粒和药学上可接受的载体或稀释剂。
  51. 51.组合物，其包含权利要求41-43中任一项的胶束和药学上可接受的载体或稀释剂。
  52. 52.组合物，其包含权利要求44-46中任一项的脂质体和药学上可接受的载体或稀释剂。
  53. 53.组合物，其包含权利要求47-49中任一项的聚合物囊泡和药学上可接受的载体或稀释剂。
  54. 54.用于递送治疗剂或诊断剂的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求50-53中任一项的组合物。
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