CN111514308B - pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒及其制备方法，该pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒通过利用聚羧酸甜菜碱对金纳米棒进行修饰制备而得。本发明的金纳米棒可以通过pH诱导，使得表面电荷翻转为正电荷。由于带正电荷的金纳米棒可以有效的增强对细菌细胞膜的相互作用和通过静电相互作用渗透到生物膜内部，从而提高了光热疗法对浮游细菌和嵌入生物膜的细菌杀菌效果。因此，本发明所得的金纳米棒可以作为新型的抗菌材料来对抗细菌感染及细菌形成的生物膜。

Description

pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米技术及抗菌技术领域，具体涉及一种pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒及其制备方法和应用。
背景技术
长期以来，细菌感染一直是一种主要的致病性疾病，具有很高的发病率和死亡率。抗生素一直被称为治疗致命传染性疾病的“神奇药物”，但由于频繁和过多的使用导致了细菌抗药性的不断加速产生，不仅使得抗菌药物逐步失效，而且还会导致无药可治的“超级细菌”的出现。
目前，开发新型抗生素药物的速度远远落后于抗生素耐药性产生的速度。另外，大多数细菌微生物通过嵌入的方式存在于生物膜中，导致常规抗生素甚至是抗菌纳米材料无法充分发挥抗菌效果，这使得由生物膜引起的慢性和复发性感染疾病造成了极高的死亡率，对患者和社会产生了沉重的经济负担。
因此，开发有效、安全、避免耐药性产生的新型抗菌剂来对抗多耐药性细菌(MDR)的威胁是非常迫切需要的。此外，也要求抗菌剂可以渗透到成熟的生物膜内，杀死嵌入生物膜中的细菌微生物。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种抗菌的金纳米棒，该纳米棒对包括多耐药菌在内的细菌具有优秀的抗菌性，同时还可以渗透入细菌生物膜，实现对生物膜的清除。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)、将十六烷基三甲基溴化铵和HAuCl3混合，再加入NaBH4并进行搅拌，作为种子溶液；
(2)、混合十六烷基三甲基溴化铵和AgNO3，再加入HAuCl3形成均一溶液，然后加入抗坏血酸使得溶液呈无色，作为生长溶液；将少量种子溶液加入生长溶液中进行反应，离心后得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的金纳米棒溶液；
(3)、将三(2-羰基乙基)磷盐酸盐加入聚羧酸甜菜碱溶液，于碱性环境下得到巯基终止的聚合物长链；然后加入步骤(2)所得物，反应完毕后，进行离心和洗涤，得到所述pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中，所述十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl3和NaBH4的浓度分别为0.1M、0.25mM和0.01M；所述十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl3和NaBH4的体积比为50:50:3。
作为本发明的优选技术方案，步骤(2)中，所述十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、HAuCl3和抗坏血酸的浓度分别为0.1M、10mM、 25mM和0.078M；所述十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、HAuCl3和抗坏血酸的体积比为100:1:2:0.7。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中，所述三(2-羰基乙基) 磷盐酸盐的浓度为35mM。
作为本发明的优选的技术方案，步骤(3)中，所述碱性环境为 pH＝8。
作为本发明的优选的技术方案，步骤(2)中，进行所述反应时，于27-30℃下静置过夜；步骤(3)中，进行所述反应时，于搅拌条件、室温的情况下，反应12小时。
在本发明中，可实施的一个技术方案为：
所述聚羧酸甜菜碱及其对应单体的制备方法为：将4-氰基戊二酸二硫代苯甲酸、2,2'-偶氮(异丁腈)和CB-tBu溶解于DMF中，多次进行冷冻、抽吸再解冻过程，然后于油浴锅中在70℃下反应24小时；液氮冷却后，于乙醚中进行沉淀，对沉淀物利用三氟乙酸处理，然后透析纯化，即得；
所述CB-tBu通过如下方法制备而得：将2.5g甲基丙烯酸二甲氨乙酯溶解在20mL乙腈中，缓慢加入4.34g溴乙酸叔丁酯，于50℃进行反应24小时；冷却至室温，将250mL乙醚加入其中产生白色沉淀，通过过滤获得白色结晶状产品CB-tBu。
作为本发明的优选的技术方案，步骤(3)中，所述种子溶液和生长溶液的体积比为100μL:103.7mL。
在本发明中，发明人制备了一种近红外光响应和pH诱导表面电荷翻转的AuNRs用于光热杀灭浮游细菌和消除细菌生物膜。为此，发明人制备了聚羧酸甜菜碱基(简称PCB)的聚甲基丙烯酸酯，并通过金-硫醇键接枝在金纳米棒(简称AuNRs)上。因为聚羧酸甜菜碱的两性离子特征，PCB修饰的AuNRs(简称PCB-AuNRs)在pH～7.4生理条件下表现出优异的稳定性和良好的生物相容性。另一方面，羧基基团在酸性微环境中发生质子化作用从而使PCB-AuNRs表面带有正电荷，增强了纳米颗粒与细菌的相互作用并渗透到生物膜内部。使得所得金纳米棒可以在近红外光的照射下热疗杀死在浮游阶段或嵌入生物膜中的细菌。
本发明的有益效果：
通过用两性离子聚羧酸甜菜碱对金纳米棒进行改性，制备了具有 pH诱导表面电荷翻转功能的、具有优良抗菌效果的金纳米棒。本发明所得金纳米棒在生理条件下表面呈现出负电荷，能够有效地延长在血液中的循环时间并提高了对哺乳动物细胞的生物相容性。
本发明的金纳米棒可以通过pH诱导，使得表面电荷翻转为正电荷。由于带正电荷的金纳米棒可以有效的增强对细菌膜的相互作用和通过静电相互作用渗透到生物膜内部，从而提高了光热疗法对浮游细菌和嵌入生物膜的细菌杀菌效果。因此，本发明所得的金纳米棒可以作为新型的抗菌材料来对抗细菌感染及细菌形成的生物膜。
附图说明
图1为本发明PCB的合成路线图；
图2为本发明PCB-tBu(图中A部分)和PCB(图中B部分)的核磁谱图；图中，“Chemical shift”意为“化学位移”；
图3为本发明AuNRs的表征图；其中，A部分为TGA曲线，B部分为紫外-可见吸收光谱，C部分为PCB-AuNRs的TEM照片，D部分为不同pH条件下PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs的电位变化情况；图中，“Temperature”意为“温度”，“Wavelength”意为“波长”；
图4中的A部分为808激光器照射下PCB-AuNRs31.25μg/mL在不同功率下温度的变化和温度的照片；B部分为PCB-AuNRs在不同浓度下的光热升温情况(1.0W/cm2)；图中，“Time”意为“时间”，“Temperature”意为“温度”；
图5为本发明3T3成纤维细胞与金纳米棒共培养24小时后的细胞存活率结果图；图中，“Concentration of AuNRs solution”意为“金纳米棒溶液浓度”，“Cell viability”意为“细胞存活率”；
图6为本发明AuNRs对E.coli(图中A部分)和S.aureus(图中B 部分)杀菌百分比；图中，“Survive(％)for E.coli”意为“E.coli的存活比例”，“Irradiation Time”意为“辐照时间”，“Survive(％)for S.aureus”意为“S.aureus的存活比例”；
图7为在没有(图中A部分)和存在(图中B部分)PCB-AuNRs的情况下与大肠杆菌共培养8小时后的TEM图像对比；图中圆圈表示 PCB-AuNRs附着在微生物表面(图中C部分)；
图8为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与AuNRs溶液共培养12小时后，在近红外照射1min，通过荧光显微镜观察的结果图；
图9为本发明AuNRs对耐药性细菌ESBL E.coli(图中A部分)和 MRSA(图中B部分)杀菌百分比结果图；图中，“Survive(％)for ESBLE.coli”意为“ESBLE.coli的存活比例”，“Survive(％)for MRSA”意为“MRSA的存活比例”，“Irradiation Time”意为“辐照时间”；
图10的A部分为金黄色葡萄球菌生物膜与AuNR共培养不同时间下案125μg/mL)不同时间下的细菌存活率(A)和生物膜内金的浓度结果；图中B部分为3T3成纤维细胞与金纳米棒共培养24小时后的细胞存活率结果；图中，“Survive(％)for S.aureus”意为“S.aureus的存活比例”；“Mass of Au”意为“金浓度”；
图11为PPEGMA-AuNRs(图中A部分)和PCB-AuNRs(图中B部分) 的荧光模型图；
图12为金黄色葡萄球菌生物膜用PBS(图中A和B部分)， PPEGMA-AuNRs(图中C和D部分),PCB-AuNRs(图中E和F部分) 共培养2h(125μg/mL)；无(图中A、C和E部分)/在(图中B、D和 F部分)近红外激光照射5min；用激光扫描共聚焦显微镜观察活菌(绿色)和死菌(红色)；
图13为金黄色葡萄球菌生物膜与PPEGMA-AuNRs和PCB-AuNRs 共培养不同时间下的共聚焦显微镜图像；用激光扫描共聚焦显微镜观察活菌(绿色)和死菌(红色)；
图14为分别用PBS(图中A部分)、PPEGMA-AuNRs(图中B部分) 和PCB-AuNRs(图中C部分)溶液与金黄色葡萄球菌生物膜共培养2 小时和近红外照射下5min的SEM图像；
图15为本发明荧光分子的合成路径图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明涉及到的略缩词：
三氟乙酸：TFA
4-氰基戊二酸二硫代苯甲酸：CPADB
2,2'-偶氮(异丁腈)：AIBN
十六烷基三甲基溴化铵：CTAB
硝酸银：AgNO3
抗坏血酸：AA
硼氢化钠：NaBH4
聚羧酸甜菜碱：PCB
金纳米棒：AuNRs
CTAB修饰的金纳米棒：CTAB-AuNRs
聚羧酸甜菜碱基团修饰的金纳米棒：PCB-AuNRs
聚乙二醇单甲基丙烯酸酯：PEGMA
聚乙二醇单甲基丙烯酸酯(PEGMA)采用可逆加成-断裂链转移 (RAFT)技术使用与本发明P(CB-tBu)同样的聚合方法进行聚合得到的聚合物：PPEGMA
PPEGMA修饰的金纳米棒：PPEGMA-AuNRs
实施例1 pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒的制备
原料:三氟乙酸(TFA)、溴乙酸叔丁酯、2-(二甲基氨基)甲基丙烯酸乙酯、4-氰基戊二酸二硫代苯甲酸(CPADB)、2,2'-偶氮(异丁腈)(AIBN,99％)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、硝酸银(AgNO3)、抗坏血酸(AA)、氯化金溶液、硼氢化钠(NaBH4)够买于Sigma-Aldrich 公司。胰蛋白酶大豆琼脂培养基(TSA、AOBOX、衡水)、蛋白酶大豆液体培养基(TSB、AOBOX、衡水)作为收料。从Invitrogen公司购买活/死细菌生存试剂盒(L-7012)。
制备方法：
1、金纳米棒的合成(CTAB-AuNRs)
CTAB修饰的金纳米棒(CTAB-AuNRs)通过晶种生长法合成。
种子溶液：通过混合CTAB(0.1M,10mL)和HAuCl3(0.25mM,10 mL)，新鲜制备的NaBH4(0.01M,0.6mL)迅速加入其中强力搅拌2min。
生长溶液：通过混合CTAB(0.1M,100mL)和AgNO3(10mM,1 mL),HAuCl3(25mM,2mL)缓慢的加入其中形成均一的溶液，抗坏血酸(0.078M,0.7mL)缓慢的加入使其变成无色。
在生长溶液中加入100μL种子溶液在27-30℃下静置过夜，通过离心除掉多余的CTAB。
2、PCB-AuNRs的制备
聚羧酸甜菜碱基团修饰的金纳米棒PCB-AuNRs合成通过金属- 硫键取代CTAB-AuNRs上的CTAB分子来实现。
具体而言，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP-HCl)(35mM)加入到 PCB溶液中在pH＝8的条件下去得到巯基终止的聚合物长链 (PCB-SH)。搅拌12h后，PCB-SH(10mg/mL,3mL)加入到3mL的 CTAB-AuNRs溶液中，在室温下反应12h后，离心和洗涤去获得PCB-AuNRs。PPEGMA-AuNRs通过同样的反应步骤获得作为对照组。
实验例1
实验方法
1、产品表征
检测方法：采用Varian(Mercury plus-400)核磁共振波谱仪，以 D2O为溶剂，在室温条件下进行1H核磁共振波谱测定。用Nano-ZS 90zs 90粒径电位仪(MalvernInstruments Ltd.，Worcestershire,UK) 对PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs溶液在不同pH值下进行了电位变化分析。用紫外-可见分光光度计(UnicamUA500,Thermo electronicsCorporation.)在400-900nm范围内进分析。采用电感耦合等离子体质谱法(Agilent7700ce,Agilent Technologies,NYSE:A)研究了 PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs的金的浓度。利用加速电压为200kv 的透射电子显微镜(Tecnai G2 F20透射电子显微镜，荷兰皇家飞利浦电子有限公司，荷兰)对纳米粒子结构进行了观察。用808nm近红外激光在不同功率下对不同浓度的AuNRs溶液进行了光热效应评估。利用红外热像仪(Flir A300，美国)对温度变化进行测量和成像。
2、抗菌测试
实施例1所得金纳米棒溶液(PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs) 的光热杀菌性能通过标准平板计数法和活死细菌染色法来进行研究。革兰氏阴性细菌E.coli(ATCC 35218),革兰氏阳性细菌S. aureus(ATCC 29213)和耐药型细菌MRSA(ATCC 43300),EBSL E.coli (ATCC51299)等作为模型细菌。
首先在琼脂平板上37℃需氧培养24h，然后与营养肉汤培养基孵育过夜，得到浓度为3×108CFU mL-1的细菌悬液。获得的 PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs溶液在紫外灯下消毒30min与细菌悬浮液共培养12h(金纳米棒溶液的最终溶度为31.25ug mL-1，pH＝ 6.0)。获得最终溶液使用808近红外激光器照射0-5min(1W cm-2)， 100μL悬浮液均匀的涂覆在固体培养基上，于37℃培养24h后计数。
活死细菌染色法实验(L-7012,Invitrogen)进行用于去显示细菌细胞的活性通过荧光显微镜(DMI6000B,Leica,Wetzlar,Germany)。 808近红外激光器照射1min后5μL(3μM)propidium iodide和 SYTO-9分别加入到悬浮液中在避光条件下4℃抚育30min。最后， 5μL混合物滴加到盖玻片上用于显微镜观察。以相同条件下的PBS 作为对照。每项试验一式三份。
3、细菌生物膜的培养和存活率测试
生物膜是引起多种慢性细菌感染的主要原因能够固有的抵抗抗生素的渗入和避免被宿主免疫细胞的攻击。为了评估PCB-AuNRs的抗细菌生物膜效果，标准平板计数法用于评估生物膜内残留细菌的活力。简而言之，金黄色葡萄球菌菌株在37℃的胰蛋白酶豆汤(TSB) 中需氧培养24h，然后,将细菌菌悬液用TSB进行连续稀释，并调整到细胞密度为106CFU-1。然后向Fisherbrand细胞爬片上(Sanger Biotechnology Co.,Ltd.)中加入1mL106CFU mL-1的金黄色葡萄球菌悬浮液，培养基每天更新一次，置于37℃恒温培养箱中培养7天形成致密的生物膜。
金纳米棒溶液(PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs)以相同的浓度 125ug/mL滴加到成熟的细胞膜爬片上于37℃在光照/不光照(808nm, 1.0W cm-2)5min的条件下抚育0.5h,2h,12h。然后将膜片小心地放入装有2ml无菌PBS缓冲溶液的单管中。超声8S分离细菌细胞,旋涡混合均匀。随后,100μL悬浮液均匀涂覆在固体培养基上，37℃孵育16h，计数细菌菌落数。
活死细菌染色法实验(L-7012,Invitrogen)进一步显示出生物膜的细菌活性。不同浓度的金纳米棒溶液(125and 62.25ug/mL)和抚育时间(0.5h,2h,12h)被采用在这个研究工作中。上述的细胞爬片接下来与SYTO 9(30μL)和Propidium Iodide(30μL)在避光条件下4℃抚育30min。金纳米棒溶液对细菌生物膜的渗透通过激光共聚焦检测 CLSM(OlympusFV 1000,Japan)。
ICP-MS用于测定AuNPs在酸性细菌生物膜中的滞留数量。简而言之，将浓度为250、125和62.5ug/mL的AuNRs溶液加入细菌生物中，分别在37℃孵育0.5h、2h和12h。细菌生物膜用PBS冲洗三次。采用ICP-MS法测定金的浓度采用王水处理。
4、金纳米棒对生物膜的作用
采用扫描电子显微镜(SEM)直接的可是观察金纳米棒减少细菌生物膜形成的能力和生物膜表面形貌变化。具体操作方法为：首先，将成熟的细菌生物膜用无菌PBS小心地清洗三次；然后，50μL纳米复合材料缓慢的添加并且在静止的条件下于37℃抚育2小时；最后，样品用1ml无菌PBS洗涤3次在近红外照射(808nm,1.0W cm-2)5 分钟，用2.5％(v/v)戊二醛在4℃固定4小时。之后将戊二醛溶液除去，然后增加乙醇浓度(50％、70％、85％、90％、95％和100％)。最后，用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,FEIINSPECTF；America)。50 μL of0.01M PBS在同等条件下作为对照组。
5、TEM观察金纳米棒与细菌的相互作用
为了研究细菌与两性离子金纳米棒的相互作用，我们利用透射电镜观察金纳米棒处理前后微生物的形貌变化。具体操作方法为：将细菌分为两组，实验组:1.0mL纯化的细菌与金纳米棒0.5mL(最终浓度为31.25μg mL-1)在10mL中摇匀后置于摇床上37℃培养8小时，4000rpm离心30分钟，旋涡后用2mL无菌PBS重新稀释；对照组：采用PBS相同条件下作为参考对照组。最后将2.5％戊二醛加入两个离心管中，4℃冰箱过夜，用于固定细菌形态。
6、细菌生物膜渗透模型
为了探究两性离子金纳米棒是粘附在细菌生物膜的表面还是渗入细菌生物膜内部我们设计了这样一个荧光分析模型。为了检验我们将6-氨基荧光素通过共价键接枝在金纳米棒上。简单来说，6-氨基荧光素(0.62mmol,0.215g)溶解在NaOH–MeOH溶液中(1M)在0℃搅拌 30min，丙烯酰氯(1.15mmol,0.1g)逐滴加入，混合物在冰浴下搅拌4 h后，室温搅拌8h。产品通过过滤获得用大量的甲醇和乙醚冲洗，真空避光室温干燥获得产物，荧光标记的聚合物最后用3.5kDa透析袋透析纯化，冷冻干燥获得最终产品。
采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合技术制备了荧光标记共聚物。CPADB作为链转移剂，AIBN作为引发剂，单体CB-tBu和荧光分子(25:1)溶解在DMF中。然后，溶液进行三次冷冻-抽吸-解冻过程。在65℃的油浴恒温条件下进行聚合。反应16h后，液氮冷却终止反应。用乙醚沉淀法得到反应产物。经TFA处理后，用透析法纯化得到标记的共聚物。荧光标记的AuNRs溶液处理生物膜方法参考于上述实验步骤。
7、细胞毒性试验
在研究中选用3T3成纤维细胞(3T3 fibroblast cells,Chinese Academy ofScience Cell Bank for Type Culture Collection,China)作为试验用细胞并培养于含10％的胎牛血清的DMEM培养基中，同时含 100μg mL-1青霉素与100μg mL-1链霉素。整个培养过程于日本三洋 MCO-18AIC细胞培养箱中进行，温度为37℃，含有5％CO2。首先， 3T3成纤维细胞置于96孔板中培养24h，使每个孔板中细胞数量为4 ×103。将最终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8ug Au/mL 的样品加入，在恒温培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24小时。吸弃上清液，每孔加入10μL的MTT溶液，孵育4小时，弃去液体，每孔加入150μLDMSO，避光振荡10min，用酶标仪分别测定其在 545nm处的吸光度值。
实验结果：
1、PCB-AuNRs的合成和表征
如图1所示，P(CB-tBu)采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)技术来制备。首先以2-叔丁基-N-(2-(甲基丙烯氧基)乙基)-N,N-二甲基-2-氧乙基铵(CB-tBu)为单体，CPADB为链转移剂，AIBN为引发剂。经1H NMR计算，得到的P(CB-tBu)平均分子量为17.2KDa。采用三氟乙酸(TFA)用于除去去保护基团2-叔丁基，使聚甲基丙烯酸酯生成终端为羧基的聚羧酸甜菜碱结构(PCB)。PCB-tBu和PCB相对应的代表性峰及分配如图2所示1H NMR所示。作为对照组，聚乙二醇单甲基丙烯酸酯(PEGMA)采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)技术使用与 P(CB-tBu)同样的聚合方法进行聚合，得到的聚合物标记为PPEGMA。将PPEGMA接枝到AuNRs上，得到表面电荷可忽略的AuNRs，即 PPEGMA-AuNRs。与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)稳定AuNRs相比 (CTAB-AuNRs)，PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs能够有效的提高其生物相容性由于十六烷基三甲基溴化铵对哺乳动物细胞具有较高的细胞毒性。热重分析(TGA)实验表明，接枝在AuNRs上的PCB含量约为38％(图3中的A 部分)。紫外-可见光谱显示，PCB和PPEGMA 成功地吸附到AuNRs上，这是由于与CTAB-AuNRs相比发生了红移 (PCB-AuNRs)或蓝移(PPEGMA-AuNRs)(图3中的B部分)。透射电镜证实(TEM)，其呈现出棒状的结构横向尺寸为8nm，纵向尺寸为60nm 并且很好地分散在水中(图3中的C部分)。
在25℃时，通过动态光散射(DLS)测定PCB-AuNRs和 PPEGMA-AuNRs的在不同pH条件下的电位变化情况。如图3中的D 部分所示，PCB-AuNRs的ζ电位随着pH值的降低逐渐增加，在pH 值为8.0约为-10mV，而在pH值5.5为～+28mV，在平衡点为pH 7.4。在生理条件或以上时(pH>7.4)，PCB-AuNRs在很大程度上表现为负电荷，暗示出其在血液中拥有长时间循环。在感染性酸性微环境中，高的表面正电荷会促进PCB-AuNRs附着在微生物细胞上，增强近红外光诱导的PTT光热杀菌效果。此外，带正电荷的PCB-AuNRs也有望渗透到细菌生物膜内部，通过近红外激光诱导局部加热，杀死嵌入的微生物。与此相反，PPEGMA-AuNRs在测试pH值范围内表现出微不足道的表面电荷，这可能会降低其抗菌和抗生物膜的效果。
2、光热升温评估
合成的AuNRs由于其表面等离子体共振(SPR)在近红外吸收带 700～800nm表现出强烈的吸收，暗示其在光热疗法方面具有巨大的潜力。PTT通过近红外激光诱导局部加热通过物理破坏对细菌细胞进行杀灭，从而避免细菌耐药性的产生。在808nm近红外激光照射下，采用红外成像热像仪，对不同浓度下的PCB-AuNRs的温度变化进行了监测和成像。如图4中的A部分和图4中的B部分所示，PCB-AuNRs 具有明显的浓度和激光功率依赖的光热加热效应。在浓度低至 31.25μg/mL,PCB-AuNRs溶液的温度可以在10分钟之内迅速加热到 60℃在1.0W/cm2。
3、对成纤维细胞的细胞毒性和对浮游细菌抗菌性能
如图5所示，PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs与3T3成纤维细胞孵化24小时后即使在浓度为62.5ppm，仍显示90％以上的细胞存活率，暗示出具有优异的生物相容性。这可能是由于这两种纳米复合材料高度的水合作用或非表面电荷特征在pH值7.4。然而，CTAB修饰的AuNRs表现出很高的毒性。
考虑到大多数细菌膜表面带有负电荷，细而菌感染部位总是呈现出酸性微环境。因此，我们期望PCB-AuNRs能够增强与细菌的相互作用通过静电相互作用，从而提高其光热杀菌的效果。首先，我们采用金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，和耐药性细菌MASA为模型细菌，通过平板计数法和活/死细菌染色法，评价了PCB-AuNRs和 PPEGMA-AuNRs的抗菌活性。如图6中的A部分和图6中的B部分所示，经过3min照射后，PCB-AuNRs表现出明显的抗菌性能(有效率为>97％)，而PPEGMA-AuNRs的抗菌活性较低。这表明，细菌表面附近的带正电荷的PCB-AuNRs通过静电吸引促进了对微生物的粘附(带负电荷)。为了探究两性离子金纳米棒(PCB-AuNRs)与细菌微生物之间的相互作用，透射电镜(TEM)用于观察PCB-AuNRs与金黄色葡萄球菌共培养8小时后的细菌形貌变化图像。从图7可以看出， PCB-AuNRs溶液处理前细菌微生物呈现出结构完整的形貌。然而，与PCB-AuNRs共培养一段时间后，细菌微生物的结构发生明显的皱折和扭曲，导致微生物的形态被破坏。然而，细菌细胞内未观察到 PPEGMA-AuNRs，从而表明PCB-AuNRs与细菌细胞之间存在很强的相互作用。更为重要的是，一些PCB-AuNRs被发现可以粘附和聚集在细菌的夹膜中并且进入细菌内部。
活死荧光实验也被用来测量PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs在水溶液中的抗菌效率，结果表明，经过PCB-AuNRs处理的细菌呈现出大量的死细菌，然而PPEGMA-AuNRs处理后的死细菌数量明显减少，而这与标准平板计数法实验结果一致。
多药耐药菌株ESBL E.coli和MRSA作为模型细菌去检验 PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs对耐药型细菌的杀灭效果。结果如图9所示，与对普通游离细菌相比，PCB-AuNRs和PPEGMA-AuNRs 对这两种耐药菌株的抗菌效果发生明显的降低。然而，PCB-AuNRs 对ESBLE.coli和MRSA与PPEGMA-AuNRs相比表现出更好的杀菌效果。这可能是由于PCB-AuNRs在酸性细菌感染环境下发生了电荷翻转，从而增强了与细菌的相互作用，提高了其杀菌性能。如图9所示，ESBL E.coli和MRSA在近红外照射5min后发生了90％以上的死亡，这使的PCB-AuNRs可能成为多药耐药菌的潜在抗菌剂。
4、渗透和抗菌活性
考虑到大多数细菌微生物生活在生物膜内，生物膜是由固着细菌和其分泌的细胞外多聚合物物质(EPS)所组成的协调群落和复合结构。生物膜受到EPS保护作用从而可以有效的阻止抗生素的渗透，从而使细菌对传统抗生素甚至是抗菌纳米颗粒具有强耐受性。EPS的低 pH微环境和负电荷特性促使我们使用PCB-AuNRs来穿透和清除生物膜中的细菌。标准平板计数法、活/死细菌染色法和扫描电镜观察用于去评价PCB-AuNRs和PPEG-AuNRs的抗菌活性。成熟细菌生物膜与PCB-AuNRs和PPEG-AuNRs在相同浓度下125μg/mL抚育不同时间，即0.5h,2h和8h。最后，细菌生物膜在近红外激光(808nm,1.0 W/cm2)5分钟，如图10所示,标准平板计数法实验表明，PCB-AuNRs 展示出了一定的抗菌活性即使在没有激光的照射下。值得注意的是，在808NIR辐照下，PCB-AuNRs处理的生物膜中(8小时)的杀菌率达到90％，而PPEGMA-AuNRs处理的生物膜中细菌存活率仍达 40％，这说明了在近红外辐照下PCB-AuNRs具有更加出色的抗生物膜性能。我们将PCB-AuNRs优异的抗菌性能归功于其在酸性环境中的正表面电荷，促进了其与生物膜基质的结合和渗透。为了验证上述假设，我们用ICP-MS分析了金在生物膜或细菌上的粘附量。如图10 中的B部分所示，在相同浓度和孵育时间下，与PPEGMA-AuNRs 孵育的生物膜相比，PCB-AuNRs孵育的生物膜中金的浓度明显上升，暗示出pH响应的PCB-AuNRs在酸性细菌生物膜中实现电荷翻转，利用静电相互作用紧紧地吸附和滞留在细菌生物膜内部。
然而，以上结果并不能推断出PCB-AuNRs的穿透深度，因为 PCB-AuNRs在生物膜表面的促进粘附(而不是穿透到生物膜深处)也可能导致金的检测浓度增强。为了研究AuNRs对细菌生物膜的穿透深度，我们制备了荧光标记PPEGMA-AuNRs和PCB-AuNRs，合成路线如图15。
荧光标记的PEGMA-AuNRs和PCB-AuNRs与生物膜孵育2小时，然后用PBS洗去未粘附的AuNRs。然后对生物膜进行三维共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察。如图11所示，经过PCB-AuNRs处理后，在所有生物膜上都发现了强烈的绿色荧光，而经过PPEGMA-AuNRs 处理的生物膜上的荧光则少得多，这表明PCB-AuNRs对生物膜具有更强粘附和深度渗透。
随后，我们采用三维共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察PCB-AuNRs的抗生物膜活性。在CLSM图像中，细胞膜内部完整的活性细菌显示绿色荧光，细胞膜受损的死亡细菌显示红色荧光。如图 12中的A部分和图12中的B部分所示，未经处理的对照组的特征是完整的生物膜，整个生物膜上全是活的(绿色)细菌，有/没有近红外辐射。PPEG-AuNRs处理后的生物膜(图12中的C部分和图12中的D 部分)显示近红外辐射后的部分细胞死亡(红色)，提示光热杀灭细菌。值得注意的是，近红外辐射后，PCB-AuNRs在整个生物膜厚度(图12 中的E部分和图12中的F部分)内杀灭细菌，这表明PCB-AuNRs具有穿透整个生物膜和极好的光致杀灭效率。不同处理时间对制备的 AuNRs溶液(62.25ug/mL)的抗菌性能的影响。近红外辐射后如图13 所示。PCB-AuNRs的光热杀伤效率表现出处理时间的依赖性。处理 8h后，成熟生物膜中的细菌完全被杀死。有/没有近红外激光的对照组(PPEGMA-AuNRs)的特征是完整的生物膜，整个生物膜上大部分是活的(绿色)细菌。
利用SEM直观地显示了PPEGMA-AuNRs和PCB-AuNRs的光热抗生物膜效果，结果见图14中的A部分。PBS处理7日龄金黄色葡萄球菌生物膜后，发现细菌生物膜均匀致密。处理过的PPEGMA-AuNRs 和近红外辐照生物膜的结构变化可以忽略不计，表明PEGMA-AuNRs 与生物膜组分之间的相互作用很弱。在近红外激光照射下， PCB-AuNRs处理的生物膜中存在明显的结构破坏和起皱的细菌细胞，这是PCB-AuNRs与生物膜之间强静电相互作用的结果，与平板计数和CLSM结果一致。

Claims (9)

1.一种pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)、将十六烷基三甲基溴化铵和HAuCl3混合，再加入NaBH4并进行搅拌，作为种子溶液；
(2)、混合十六烷基三甲基溴化铵和AgNO3，再加入HAuCl3形成均一溶液，然后加入抗坏血酸使得溶液呈无色，作为生长溶液；将少量种子溶液加入生长溶液中进行反应，离心后得到十六烷基三甲基溴化铵修饰的金纳米棒溶液；
(3)、将三(2-羰基乙基)磷盐酸盐加入聚羧酸甜菜碱溶液，于碱性环境下得到巯基终止的聚合物长链；然后加入步骤(2)所得物，反应完毕后，进行离心和洗涤，得到所述pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒；
所述聚羧酸甜菜碱的制备方法为：将4-氰基戊二酸二硫代苯甲酸、2,2'-偶氮(异丁腈)和CB-tBu溶解于DMF中，多次进行冷冻、抽吸再解冻过程，然后于油浴锅中在70℃下反应24小时；液氮冷却后，于乙醚中进行沉淀，对沉淀物利用三氟乙酸处理，然后透析纯化，即得；
所述CB-tBu通过如下方法制备而得：将2.5g甲基丙烯酸二甲氨乙酯溶解在20mL乙腈中，缓慢加入4.34g溴乙酸叔丁酯，于50℃进行反应24小时；冷却至室温，将250mL乙醚加入其中产生白色沉淀，通过过滤获得白色结晶状产品CB-tBu。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl3和NaBH4的浓度分别为0.1M、0.25mM和0.01M；所述十六烷基三甲基溴化铵、HAuCl3和NaBH4的体积比为50:50:3。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、HAuCl3和抗坏血酸的浓度分别为0.1M、10mM、25mM和0.078M；所述十六烷基三甲基溴化铵、AgNO3、HAuCl3和抗坏血酸的体积比为100:1:2:0.7。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为35mM。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述碱性环境为pH＝8。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述反应时，于27-30℃下静置过夜；和/或，步骤(3)中，进行所述反应时，于搅拌条件、室温的情况下，反应12小时。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述种子溶液和生长溶液的体积比为100μL:103.7mL。
8.由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒。
9.权利要求8所述的pH诱导电荷翻转型抗菌金纳米棒在制备光热杀菌和清除细菌生物膜物质的应用。
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