CN109549933A - 一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用，属于药物递送领域。生物大分子负载在所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道内，堵孔剂封堵介孔二氧化硅纳米粒子的孔道。所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子表面接枝酸敏性分子；所述纳米粒子的孔道直径为5nm‑50nm。在pH值小于等于阈值的条件下，酸敏性化学键断裂，纳米粒子表面的电荷由负电荷转变为正电荷；在静电排斥作用下，带正电荷的堵孔剂从介孔二氧化硅纳米粒子表面脱离，暴露出孔道，使生物大分子迅速释放。本发明有效地解决了生物大分子在到达靶细胞前泄漏或无法在细胞内特定条件下可控释放的问题，实现了负载的生物大分子在特定pH条件下的控制释放。

Description

一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物递送领域，更具体地，涉及一种pH响应控释生物大分子的纳米载体及其制备方法与应用，其可在pH小于等于阈值时迅速智能地释放生物大分子。
背景技术
生物大分子包括蛋白质类药物、多糖类药物、核酸类药物等，多用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病、肝炎、神经退行性疾病、出血等重大疾病。与化学合成小分子药物相比，生物大分子药物具有活性高、特异性强、不良反应少、生物功能明确和安全可靠等优点。然而生物大分子在应用中仍面临着诸多难题，如稳定性差、膜渗透性差，在复杂的生物体内环境中半衰期短、清除率高。因此，开发高效无毒、生物相容性好的生物大分子载体，实现生物大分子在细胞内特定条件下的可控释放是亟待解决的问题。
随着纳米技术的发展，纳米材料越来越广泛地被用于临床疾病的预防、诊断和治疗。纳米材料具有表面可修饰性高、比表面积大、理化性质稳定、生物相容性好等优点，是良好的药物载体，可有效提高药物的生物半衰期。此外，经表面修饰的纳米材料，还可以增强药物的靶向性，减少其毒副作用。相比于其他纳米载体，介孔二氧化硅纳米粒子具有可调的孔径、高孔容及高比表面积，可以保证药物的有效负载和封装。然而传统的介孔二氧化硅纳米粒子的孔径大多小于6nm，难以负载蛋白质等尺寸较大的生物大分子。尽管目前已有一些文献报道了扩大介孔二氧化硅纳米粒子孔径的方法，但较大的孔径也使蛋白质类等尺寸较大的生物大分子易于从较大的孔道中脱离，导致生物大分子在到达靶细胞前发生泄漏，难以实现生物大分子的有效运输，无法满足临床需求。
发明内容
本发明解决了介孔二氧化硅纳米粒子无法高效运载蛋白质等尺寸较大的生物大分子的技术问题，实现了蛋白质等尺寸较大的生物大分子在特定pH环境下的可控释放。
按照本发明的第一方面，提供了一种pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子表面接枝酸敏性分子，所述酸敏性分子与介孔二氧化硅纳米粒子通过共价键连接；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道直径为5nm-50nm。
优选地，所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；当pH小于等于pH阈值时，所述酸敏性分子的酸敏性化学键断裂，带羧基的一端从介孔二氧化硅纳米粒子表面脱落，氨基暴露在介孔二氧化硅纳米粒子表面，使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
按照本发明的另一方面，提供了一种负载生物大分子的pH响应的纳米载体，所述负载生物大分子的pH响应的纳米载体含有权利要求1或2所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子、生物大分子和堵孔剂；所述生物大分子负载在所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道内；所述堵孔剂通过静电吸引作用与pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子自组装，所述堵孔剂封堵pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道。
优选地，所述堵孔剂为带正电荷的聚合物纳米粒子或表面带正电荷的无机纳米粒子；
优选地，所述带正电荷的聚合物纳米粒子为氨基化的聚乳酸纳米粒子、氨基化的聚ε-己内酯纳米粒子、氨基化的聚碳酸酯纳米粒子、氨基化的聚乙醇酸纳米粒子、氨基化的聚磷酸酯纳米粒子、氨基化的聚苯乙烯纳米粒子、氨基化的聚乙二醇纳米粒子、氨基化的聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒子、氨基化的聚-4-乙烯吡啶纳米粒子、聚乙烯亚胺纳米粒子、聚赖氨酸纳米粒子、壳聚糖纳米粒子和氨基化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子中的至少一种；
优选地，所述表面带正电荷的无机纳米粒子为表面修饰带正电荷的聚合物的无机纳米粒子；所述带正电荷的聚合物为氨基化的聚乳酸、氨基化的聚ε-己内酯、氨基化的聚碳酸酯、氨基化的聚乙醇酸、氨基化的聚磷酸酯、氨基化的聚苯乙烯、氨基化的聚乙二醇、氨基化的聚甲基丙烯酸甲酯、氨基化的聚-4-乙烯吡啶、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖和氨基化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种；所述无机纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、硫化铜纳米粒子、氧化铁纳米粒子、氧化钆纳米粒子和量子点纳米粒子中的至少一种。
优选地，所述生物大分子为蛋白质类药物、核酸类药物或多糖类药物；
优选地，所述蛋白质类药物为蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质、黏蛋白、胶原蛋白和蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述核酸类药物为反义寡核苷酸、RNA干扰剂、适配体、抗基因和核酶中的至少一种；
优选地，所述多糖类药物为右旋糖酐、肝素、硫酸软骨素和透明质酸中的至少一种。
按照本发明的另一方面，提供了所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，含有以下步骤：
(1)在碱性条件下，硅源以表面活性剂和扩孔剂自组装形成的聚集体为介孔模板，发生水解缩合反应；然后除去所述介孔模板，得到介孔二氧化硅纳米粒子；
(2)酸敏性分子与步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米粒子发生水解缩合反应，得到pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子。
优选地，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵；所述扩孔剂为三甲基苯、胺、癸烷或乙酸乙酯；所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述的负载生物大分子的pH响应的纳米载体的制备方法，含有以下步骤：
(1)在碱性条件下，硅源以表面活性剂和扩孔剂自组装形成的聚集体为介孔模板，发生水解缩合反应；然后除去所述介孔模板，得到介孔二氧化硅纳米粒子；
(2)酸敏性分子与步骤(1)所述的介孔二氧化硅纳米粒子发生水解缩合反应，得到pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子；
(3)带正电荷的聚合物通过自组装形成的纳米粒子作为堵孔剂，或在无机纳米粒子表面修饰带正电荷的聚合物作为堵孔剂；
(4)向步骤(2)得到的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的溶液中加入生物大分子溶液，充分混合后，使所述生物大分子在pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子孔道中负载；再加入步骤(3)所述的堵孔剂，所述堵孔剂通过静电吸引作用吸附在pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的表面，得到负载生物大分子的pH响应的纳米载体。
优选地，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵；所述扩孔剂为三甲基苯、胺、癸烷或乙酸乙酯；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
按照本发明的另一方面，提供了所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子用于负载生物大分子的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)与现有技术相比，本发明提供一种pH响应控释生物大分子的纳米载体及其制备与应用。通过对介孔二氧化硅纳米粒子进行扩孔调控、表面修饰酸敏性化学键和利用堵孔剂封堵孔道等方法，构筑可负载生物大分子的纳米载体，实现对生物大分子的有效封装和可控释放。采用扩孔剂对介孔二氧化硅纳米粒子进行扩孔，有利于生物大分子进入孔道，实现药物负载；同时，在介孔二氧化硅纳米粒子表面修饰酸敏性分子，使其具备pH响应电荷反转功能，然后利用带正电荷的堵孔剂与表面为负电荷的介孔二氧化硅纳米粒子之间的静电相互作用，封堵孔道，实现对治疗肿瘤、心脑血管疾病、免疫性疾病、肝炎、神经退行性疾病、出血等重大疾病的生物大分子的有效封装和担载，避免药物的提前泄露和释放。在pH值小于等于阈值(微酸性)的条件下，介孔二氧化硅纳米粒子表面修饰的酸敏性化学键断裂，带羧基的一端从介孔二氧化硅纳米粒子表面脱落，氨基暴露在介孔二氧化硅纳米粒子表面，使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；在静电排斥作用下，带正电荷的堵孔剂从介孔二氧化硅纳米粒子表面脱离，暴露出孔道，使生物大分子迅速释放。通过这一巧妙的设计，本发明有效地解决了现有的介孔二氧化硅纳米粒子无法负载生物大分子和在特定条件下控释生物大分子的问题，从而将药物高效地递送到病灶部位。
(2)本发明中的pH响应阈值与酸敏性分子响应的pH值相对应，即，当pH值小于或等于酸敏性化学键的pH响应阈值时，介孔二氧化硅纳米粒子表面的酸敏性化学键断裂，导致其表面电荷反转，其与堵孔剂之间的静电吸引作用转变为静电排斥作用，暴露出孔道，触发生物大分子的释放。因此，针对药物释放的不同环境，我们可以选择pH响应阈值不同的酸敏性化学键，实现生物大分子的智能释放：如2,3-二甲基马来酸酐与氨基形成的酰胺键响应pH约为6.8，腙键响应pH约为5.5。
附图说明
图1为负载细胞色素C的纳米载药体系的扫描电子显微镜照片。
图2为pH响应介孔二氧化硅纳米粒子在不同pH值下表面电荷的变化。
图3为pH响应纳米载体在不同pH值下的蛋白质累积释放曲线。
图4为负载生物大分子的pH响应的纳米载体的制备流程图。
图5为氮气吸附孔径分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
pH响应控释蛋白质类药物的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，该制备方法主要包括以下步骤：
(1)3-氨丙基三乙氧基硅烷与2,3-二甲基马来酸酐反应，得到含酸敏性酰胺键的硅烷偶联剂。具体的，将3-氨丙基三乙氧基硅烷加入干燥的四氢呋喃溶液中，加入三乙胺调节溶液pH为8.5，加入等同物质的量的2,3-二甲基马来酸酐，在25℃条件下反应24小时。
(2)以乙酸乙酯为扩孔剂，采用十六烷基三甲基溴化铵和扩孔剂为模板，自组装形成介孔结构，硅源在碱性条件下发生水解和缩合，随后除去模板，得到介孔二氧化硅纳米粒子。具体的，将100mg十六烷基三甲基溴化铵溶解于50mL水溶液中，搅拌15min充分溶解，快速加入350uL氢氧化钠(浓度为2M)、200uL正硅酸四乙酯和10mL乙酸乙酯，在25℃条件下反应12小时。反应结束后离心，在超声条件下用体积比1:10的盐酸/乙醇溶液洗三次，再用水溶液洗三次，以除去模板剂，即可得到孔径为5nm-50nm的介孔二氧化硅纳米粒子。图5是氮气吸附孔径分析图。
将含酸敏性酰胺键的硅烷偶联剂修饰在介孔二氧化硅纳米粒子表面，得到pH响应表面电荷反转的介孔二氧化硅纳米粒子。具体的，将含25mg介孔二氧化硅纳米粒子的水溶液冷冻干燥后，分散于10mL干燥的甲苯溶液中，再加入含酸敏性酰胺键的硅烷偶联剂，在70℃条件下反应5小时。反应结束后，分别用二甲基甲酰胺溶液、四氢呋喃溶液、水溶液清洗三次，以除去多余的反应物，得到pH响应电荷反转的介孔二氧化硅纳米粒子。
(3)经水热法或种子生长法制备金纳米球；利用配体交换法，在金纳米球的表面修饰两端分别为氨基、巯基封端的聚乙二醇(HS-PEG-NH2)，得到表面带正电荷的金纳米球，作为堵孔剂备用。具体的，采用水热法制备15nm金纳米球：将100mL水和10mg氯金酸加入250mL圆底烧瓶，加热沸腾回流。在剧烈搅拌下，加入3mg柠檬酸钠(1wt％)，并保持溶液沸腾回流50分钟，得到直径为15nm的金纳米球。随后离心提纯，转速12000rpm，时间30分钟，浓缩液备用。采用种子生长法制备8nm金纳米球：将19mL水、0.5mL氯金酸溶液(10mM)和0.5mL柠檬酸钠(10mM)依次加入20mL样品瓶，混合均匀，在磁力搅拌条件下迅速加入新鲜配置的0.6mL硼氢化钠冰水溶液(0.1M)，继续搅拌3分钟，在25℃下静置3小时，得到纳米金种溶液。将24mL十六烷基三甲基溴化铵(0.2M)加入28.5mL水中，充分溶解，再加入1.5mL的氯金酸溶液(10mM)，混合均匀。再剧烈搅拌下加入新鲜配置的0.4mL抗坏血酸溶液(0.1M)，待溶液变成无色后，迅速加入20mL纳米金种溶液，持续搅拌1小时，在25℃静置12小时。随后离心提纯，转速14000rpm，时间30分钟，浓缩液备用。
采用配体交换法对金纳米粒子进行表面修饰。具体的，在超声条件下，将金纳米粒子浓缩液逐滴滴入两端分别为氨基、巯基封端的聚乙二醇(HS-PEG-NH2)的水溶液中，持续超声30分钟后，在25℃静置熟化12小时。随后离心提纯，以除去多余的两端分别为氨基、巯基封端的聚乙二醇(HS-PEG-NH2)，最后分散于水中，得到表面带正电荷的金纳米球。
采用聚合物受限组装法制备聚合物纳米粒子。具体的，将10mg含氨基的聚合物溶于三氯甲烷(10g/L)，加入10mL聚乙烯醇的水溶液(3g/L)中，利用超声波细胞破碎仪或者过膜乳化的方法制备得到聚合物乳液液滴，室温下使乳液中的三氯甲烷挥发。随后离心(14000rpm)除去溶液中的聚乙烯醇，得到带正电荷的聚合物纳米粒子。
(4)向pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的水溶液中加入细胞色素C的水溶液，避光搅拌24h，实现细胞色素C在介孔二氧化硅纳米粒子孔道中的负载；再加入带正电荷的金纳米球，通过静电吸引作用吸附在介孔二氧化硅纳米粒子的表面，形成一种pH响应的纳米载体。利用扫描电子显微镜对所制备的纳米载体进行表征(图1)。图4为负载生物大分子的pH响应的纳米载体的制备流程图。
实施例2-6
不同pH响应阈值的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法。介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法与实施例1相同。将含不同酸敏性化学键的硅烷偶联剂与介孔二氧化硅纳米粒子发生水解缩合反应，得到不同pH响应阈值的介孔二氧化硅纳米粒子。表1列举了几种不同酸敏性化学键的pH响应阈值。
表1
实施例7
pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子表面电荷反转测试。
将实施例1中制备的含酸敏性酰胺键的介孔二氧化硅纳米粒子分散于20mL不同pH值的缓冲液中(pH＝6.8、7.4)，按一定的时间间隔分别取出1mL溶液，用激光粒度仪实时监测pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的zeta电位(图2)。结果表明，含酸敏性酰胺键的介孔二氧化硅纳米粒子在pH＝6.8的缓冲溶液中，表面电位不断增加，并在30min内实现了从负电性向正电性的转变。而在pH＝7.4的缓冲溶液中，虽然介孔二氧化硅纳米粒子电势也略有增加，但在观测时间内始终保持负电性。说明所述的介孔二氧化硅纳米粒子在微酸性环境中具有明显的pH响应电荷反转的效果。
实施例8
pH响应控制释放蛋白质类药物。
将实施例1中制备的负载细胞色素C的pH响应的纳米载体，分散于20mL不同pH值的缓冲液中(pH＝5.0、7.4)，按一定的时间间隔取出1mL溶液，并加入1mL的新鲜缓冲溶液，测定取出溶液中细胞色素C的含量，计算出不同时间点细胞色素C的累积释放量(图3)。结果表明，pH响应的纳米载体在pH＝7.4的缓冲溶液中，药物的释放量低于30％；在pH＝5.0的缓冲溶液中，药物释放迅速，累计释放量达到45％。说明所述的纳米载体实现了蛋白质类药物的pH响应释放。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子表面接枝酸敏性分子，所述酸敏性分子与介孔二氧化硅纳米粒子通过共价键连接；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道直径为5nm-50nm。
2.如权利要求1所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子，其特征在于，所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；当pH小于等于pH阈值时，所述酸敏性分子的酸敏性化学键断裂，带羧基的一端从介孔二氧化硅纳米粒子表面脱落，氨基暴露在介孔二氧化硅纳米粒子表面，使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
3.一种负载生物大分子的pH响应的纳米载体，其特征在于，所述负载生物大分子的pH响应的纳米载体含有权利要求1或2所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子、生物大分子和堵孔剂；所述生物大分子负载在所述pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道内；所述堵孔剂通过静电吸引作用与pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子自组装，所述堵孔剂封堵pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的孔道。
4.如权利要求3所述的负载生物大分子的pH响应的纳米载体，其特征在于，所述堵孔剂为带正电荷的聚合物纳米粒子或表面带正电荷的无机纳米粒子；
优选地，所述带正电荷的聚合物纳米粒子为氨基化的聚乳酸纳米粒子、氨基化的聚ε-己内酯纳米粒子、氨基化的聚碳酸酯纳米粒子、氨基化的聚乙醇酸纳米粒子、氨基化的聚磷酸酯纳米粒子、氨基化的聚苯乙烯纳米粒子、氨基化的聚乙二醇纳米粒子、氨基化的聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒子、氨基化的聚-4-乙烯吡啶纳米粒子、聚乙烯亚胺纳米粒子、聚赖氨酸纳米粒子、壳聚糖纳米粒子和氨基化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子中的至少一种；
优选地，所述表面带正电荷的无机纳米粒子为表面修饰带正电荷的聚合物的无机纳米粒子；所述带正电荷的聚合物为氨基化的聚乳酸、氨基化的聚ε-己内酯、氨基化的聚碳酸酯、氨基化的聚乙醇酸、氨基化的聚磷酸酯、氨基化的聚苯乙烯、氨基化的聚乙二醇、氨基化的聚甲基丙烯酸甲酯、氨基化的聚-4-乙烯吡啶、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖和氨基化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种；所述无机纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、硫化铜纳米粒子、氧化铁纳米粒子、氧化钆纳米粒子和量子点纳米粒子中的至少一种。
5.如权利要求3所述的负载生物大分子的pH响应的纳米载体，其特征在于，所述生物大分子为蛋白质类药物、核酸类药物或多糖类药物；
优选地，所述蛋白质类药物为蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质、黏蛋白、胶原蛋白和蛋白酶抑制剂中的至少一种；
优选地，所述核酸类药物为反义寡核苷酸、RNA干扰剂、适配体、抗基因和核酶中的至少一种；
优选地，所述多糖类药物为右旋糖酐、肝素、硫酸软骨素和透明质酸中的至少一种。
6.权利要求1或2所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)在碱性条件下，硅源以表面活性剂和扩孔剂自组装形成的聚集体为介孔模板，发生水解缩合反应；然后除去所述介孔模板，得到介孔二氧化硅纳米粒子；
(2)酸敏性分子与步骤(1)得到的介孔二氧化硅纳米粒子发生水解缩合反应，得到pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子。
7.权利要求6所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵；所述扩孔剂为三甲基苯、胺、癸烷或乙酸乙酯；所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
8.权利要求3-5任一所述的负载生物大分子的pH响应的纳米载体的制备方法，其特征在于，含有以下步骤：
(1)在碱性条件下，硅源以表面活性剂和扩孔剂自组装形成的聚集体为介孔模板，发生水解缩合反应；然后除去所述介孔模板，得到介孔二氧化硅纳米粒子；
(2)酸敏性分子与步骤(1)所述的介孔二氧化硅纳米粒子发生水解缩合反应，得到pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子；
(3)带正电荷的聚合物通过自组装形成的纳米粒子作为堵孔剂，或在无机纳米粒子表面修饰带正电荷的聚合物作为堵孔剂；
(4)向步骤(2)得到的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的溶液中加入生物大分子溶液，充分混合后，使所述生物大分子在pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子孔道中负载；再加入步骤(3)所述的堵孔剂，所述堵孔剂通过静电吸引作用吸附在pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子的表面，得到负载生物大分子的pH响应的纳米载体。
9.如权利要求8所述的负载生物大分子的pH响应的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵；所述扩孔剂为三甲基苯、胺、癸烷或乙酸乙酯；所述酸敏性分子用于使介孔二氧化硅纳米粒子表面的电荷由负电荷转变成正电荷；所述酸敏性分子的pH阈值为5.0-6.8；
优选地，所述酸敏性分子为含有酰胺键的分子、含有腙键的分子或含有席夫碱基团的分子；所述含有酰胺键的分子的结构式如式Ⅰ所示，所述含有腙键的分子的结构式如式Ⅱ所示，所述含有席夫碱基团的分子的结构式如式Ⅲ所示；
其中，R1和R2各自独立地为H、CH3或CH2COOH；R3为碳原子数量小于等于18的含有羧基的碳链。
10.权利要求1或2所述的pH响应的介孔二氧化硅纳米粒子用于负载生物大分子的应用。
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