CN105327356A - 一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性多聚糖纳米凝胶材料及其制备方法，提供了一种基于磁力作用的靶向控释细胞生长因子的手段。将磁性四氧化三铁纳米颗粒包埋于多聚糖纳米凝胶中，实现了纳米凝胶的碱基配对交联，得到了一种结构稳定的磁性多聚糖纳米凝胶材料。本发明通过外加磁力作用而靶向控释细胞生长因子，且避免使用化学交联剂，保证被包埋药物的生物活性，显著改善材料的使用安全性。本发明制备简单、操作易行，工艺具有温度低、固化速度快、处理周期短等优点，在药物控释、组织工程与再生医学方面有应用价值。

Description

一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法。

背景技术

天然多聚糖具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域。常用的天然多聚糖包括：透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、壳聚糖、肝素及纤维素等。

在组织工程和再生医学领域，常采用多聚糖微凝胶和纳米凝胶，用于包埋细胞生长因子和基因，以提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力。采用合适的控释手段，可实现细胞生长因子在体内的靶向传递，达到理想的治疗效果。但是，现有材料还无法实现细胞生长因子等活性蛋白药物在体内的靶向传递。

文献1(高分子材料科学与工程，2007，23(1)，189～191)报道了一种磁性壳聚糖微粒材料用于负载5-氟尿嘧啶的研究，采用交联-聚合法，将四氧化三铁颗粒、5-氟尿嘧啶和100mL壳聚糖的醋酸溶液一起剧烈搅拌使其充分混合，然后在超声波的作用下，缓慢滴加到80mL的橄榄油和阴离子分散剂中，随后加入浓度50％的戊二醛溶液为交联剂，在60℃～90℃条件下反应1～2小时，得到了具有磁感应性能的纳米微球，测得其载药量为21.3％，药物包封率为55.4％，30小时内的累积释药率为67.6％。

文献2(重庆医科大学学报，2010，35(11)：1690～1692)报道了一种超顺磁性壳聚糖纳米粒的制备方法，采用化学共沉淀法制备磁性壳聚糖纳米粒，先配制氢氧化钠溶液、乙酸钠缓冲液和壳聚糖乙酸溶液，再称取硫酸亚铁铵4.7g，硫酸铁铵9.67g，一并与220mL醋酸钠缓冲液和80mL壳聚糖乙酸溶液混匀备用。在氮气环境下加入80mL氢氧化钠溶液于三颈反应瓶中，机械搅拌，并将温度升至55℃，缓慢加入壳聚糖缓冲液与硫酸亚铁、硫酸亚铁铵和乙酸钠缓冲液的混合溶液，反应30分钟，最后得到磁性壳聚糖纳米粒，结果显示其具有一定的超顺磁性，饱和磁化强度约为7emu/g。

文献3(化工进展，2013，32(10)：2440～2445)报道了一种磁性壳聚糖微球的合成及其在固定血管紧张素转化酶方面的应用，先采用化学共沉淀法制备四氧化三铁颗粒，将壳聚糖溶于2％的乙酸溶液中，加入四氧化三铁颗粒混合，超声分散，高速搅拌条件下，缓慢将壳聚糖混合溶液滴加到装有液体石蜡和司班80的三口烧瓶中，搅拌30分钟，加入交联剂戊二醛，继续搅拌1小时，调节pH值到9，搅拌1小时后，磁铁分离收集得到磁性壳聚糖微球材料，结果显示该磁性微球平均粒径为901nm，并具有一定的超顺磁性，饱和磁化强度约为8emu/g。

文献4(ActaBiomaterialia，2011，7(8)，3050～3059)报道了一种透明质酸-肝素多聚糖复合微球材料用于运载细胞生长因子的研究，采用反相乳液聚合法，将透明质酸和肝素分别溶于浓度为0.5M的氢氧化钠溶液，分别加入乳化剂并剧烈震荡，随后将两者混合，继续充分震荡下加入化学交联剂二乙烯基砜，室温下剧烈搅拌1小时，最后将反应溶液倒入丙酮中析出多聚糖微球，测得其平均粒径为1微米左右，最高载药浓度为186.6ng/mg。

上述多聚糖纳米或微球凝胶材料的制备方法存在以下缺陷：

(1)采用戊二醛或二乙烯基砜等化学试剂进行交联，该类化学交联剂具有细胞毒性，虽然能使多聚糖微球或凝胶材料在结构上比较稳定，但是毒性残留易导致细胞生长因子变性，难以满足临床使用。

(2)所制备的多聚糖纳米或微球材料磁通量小、定位效果差，难以实现靶向传递药物的目的。

(3)载药量小、缓释性能差，特别是微球粒径偏大而仅能滞留于靶区血管内释放药物，导致在人体内应用效果不佳。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，达到靶向智能传递细胞生长因子的目的，同时避免使用有毒化学交联剂，保证材料的使用安全性。

实现本发明的技术解决方案为：采用反相乳液技术，制备磁性多聚糖纳米凝胶，通过碱基配对作用，实现纳米凝胶的无毒交联。包括以下步骤：

步骤1、室温下配制肝素水溶液，滴加胸腺嘧啶盐酸溶液，在50℃～80℃下搅拌反应得到碱基化肝素；

步骤2、室温下配制壳聚糖水溶液，滴加腺嘌呤盐酸溶液，在50℃～80℃下搅拌反应得到碱基化壳聚糖；

步骤3、室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，通入氮气，滴加氨水调节pH，在60℃～80℃下搅拌得到四氧化三铁粒子；

步骤4、将碱基化肝素和壳聚糖分别溶于石蜡油，各自加入司班80和四氧化三铁粒子，超声下混合乳化并搅拌挥发，最后倒入异丙醇中析出纳米凝胶。

步骤1中所述肝素溶液的质量浓度为0.6～2％，胸腺嘧啶盐酸溶液的质量浓度为0.1～0.2％，其体积为肝素溶液的1/5～1/2，搅拌时间为12～24小时。

步骤2中所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.3～1％，腺嘌呤盐酸溶液质量浓度为0.1～0.2％，其体积为壳聚糖溶液的1/10～1/5，搅拌时间为12～24小时。

步骤3中所述氯化亚铁和氯化铁的摩尔质量比为1.75，pH范围为10～11，搅拌时间为1～3小时。

步骤4中所述碱基化肝素和壳聚糖溶于石蜡油的质量浓度分别都为0.5～2.0％，加入乳化剂司班80的量为石蜡油溶液的1/10～1/5，乳化时间为5～10分钟，搅拌速度为1000～1500rpm。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

(1)本纳米凝胶材料经过碱基配对而得，交联过程中不与细胞生长因子发生化学反应，能有效保持其生物活性；

(2)制备过程中避免使用了有毒化学交联剂，杜绝了纳米凝胶中的毒性残留，保证了材料的安全性；

(3)加入了磁性颗粒，使纳米凝胶材料具有超顺磁性，成为主动靶向制剂，磁通量大，定位效果好，可实现磁性能靶向投递药物的目的，进而更好地促进组织的再生与修复。

(4)引入了肝素组分，其既可保护细胞生长因子，又能与另一组分进行静电结合而稳定凝胶材料；

(5)载药量大、包封率高，并具有良好的缓释性能，满足细胞生长因子的传递要求。

(6)本发明工艺和设备简单、操作安全易行，具有制备温度低和处理周期短等优点，适合商业化生产。

本发明所用到的试剂来源：肝素、壳聚糖、胸腺嘧啶、腺嘌呤，购于Sigma公司；骨形态发生蛋白、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，购于R&DSystems公司；司班80、乙酸乙酯，分析纯，南京化学试剂有限公司；异丙醇、正己烷、丙酮，分析纯，上海化学试剂有限公司；盐酸、氨水，分析纯，上海化学试剂厂。氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司。

形貌观察：将制备的磁性纳米凝胶喷金(Cressington108Auto)，在扫描电子显微镜(JSM-6330F,JEOL)上观察微观形貌。

磁性纳米凝胶的粒径通过纳米粒度分析仪(MalvernZetasizerNanoZS)测算。

磁性纳米凝胶的磁化曲线使用磁性振动样品磁强计(LakeShore7400)测定。

细胞生长因子的吸附与释放：将骨形态发生蛋白溶于磷酸盐缓冲液，得到不同浓度(1，3，5，7和10微克/毫升)的系列溶液，将纳米凝胶分别置于37℃的系列溶液中孵育2小时，随后取出纳米凝胶，用磷酸盐缓冲液清洗；进行释放测试时，将吸附蛋白药物后的纳米凝胶置于37℃的磷酸盐缓冲液中，在不同时间点吸取磷酸盐缓冲液，按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒标准操作流程执行定量分析。

其中，磷酸盐缓冲液的配制方法为：称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中。

本发明采用ANOVA方差分析法，显著差异值p设为≤0.05。

下面结合附图对本发明做进一步详细的描述：

附图说明

图1是磁性纳米凝胶制备示意图。

图2是磁性纳米凝胶的扫描电子显微图。

图3是磁性纳米凝胶的粒径分布。

图4是磁性纳米凝胶的磁化曲线。

图5是磁性纳米凝胶吸附细胞生长因子的能力。

图6是磁性纳米凝胶中细胞生长因子的释放曲线。

具体实施方式

本发明提供的一种磁性多聚糖纳米凝胶的制备方法，其具体步骤包括：

步骤1、室温下配制质量/体积浓度为0.6～2％的肝素水溶液，滴加质量浓度为0.1～0.2％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/5～1/2，在50℃～80℃下搅拌反应12～24小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

步骤2、室温下配制质量/体积浓度为0.3～1％的壳聚糖水溶液，滴加质量浓度为0.1～0.2％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/10～1/5，在50℃～80℃下搅拌反应12～24小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

步骤3、室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至10～11，在60℃～80℃下搅拌1～3小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

步骤4、分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量浓度为0.5～2.0％溶于石蜡油，加入1/10～1/5体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化5～10分钟，以1000～1500rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例1：

(1)室温下配制质量/体积浓度为2％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.2％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/2，在50℃下搅拌反应24小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素，制备示意图见图1；

(2)室温下配制质量/体积浓度为0.5％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.2％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/5，在50℃下搅拌反应24小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖，制备示意图见图1；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至10，在80℃下搅拌1小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为1％溶于石蜡油，加入1/10体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化5分钟，以1500rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

所得磁性纳米凝胶的形貌见图2，粒径分布见图3，结果显示纳米凝胶粒径分布均匀，平均粒径为109nm，表明碱基配对能实现材料的有效交联，所得纳米凝胶材料具有稳定的结构，此外，纳米凝胶粒径较小，可注入血管至特定靶向部位。图4为磁性纳米凝胶的磁化曲线，可看出该磁化曲线基本重合，没有磁滞现象，磁化曲线呈对称的S型，表现为典型的超顺磁性，其饱和磁化强度达到37.4emu/g，说明该纳米凝胶具有良好的磁响应性，满足磁性靶向投递应用。图5为磁性纳米凝胶在不同投药浓度条件下吸附骨形态发生蛋白(细胞生长因子)的载药量，酶联免疫结果显示该材料载药量大、效率高，同时显示负载的骨形态发生蛋白生物活性良好，说明本交联过程未与药物发生化学反应而使其变性，材料中的肝素能有效结合骨形态发生蛋白，并能提供保护其生物活性的作用。图6为骨形态发生蛋白从磁性多聚糖纳米凝胶中的释放行为，结果显示24小时内骨形态发生蛋白累积释放量约为21％，具有良好的药物缓释性能，表明材料中的肝素组分能有效结合骨形态发生蛋白，起到了稳定和阻滞释放效果，因此该材料可用于细胞生长因子的传递。

实施例2：

(1)室温下配制质量/体积浓度为0.6％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.1％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/5，在60℃下搅拌反应12小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

(2)室温下配制质量/体积浓度为0.3％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.1％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/6，在60℃下搅拌反应12小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至11，在80℃下搅拌2小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为0.5％溶于石蜡油，加入1/8体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化5分钟，以1000rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

实施例3：

(1)室温下配制质量/体积浓度为0.8％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.15％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/4，在70℃下搅拌反应16小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

(2)室温下配制质量/体积浓度为0.4％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.15％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/8，在70℃下搅拌反应16小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至10，在70℃下搅拌3小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为1.0％溶于石蜡油，加入1/8体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化6分钟，以1200rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

实施例4：

(1)室温下配制质量/体积浓度为1％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.12％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/4，在80℃下搅拌反应16小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

(2)室温下配制质量/体积浓度为0.5％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.12％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/8，在80℃下搅拌反应16小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至10，在60℃下搅拌2小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为0.15％溶于石蜡油，加入1/6体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化8分钟，以1300rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

实施例5：

(1)室温下配制质量/体积浓度为0.18％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.15％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/3，在70℃下搅拌反应20小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

(2)室温下配制质量/体积浓度为0.8％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.15％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/6，在70℃下搅拌反应20小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至11，在80℃下搅拌3小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为0.18％溶于石蜡油，加入1/6体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化10分钟，以1200rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

实施例6：

(1)室温下配制质量/体积浓度为2％的肝素水溶液，滴加质量/体积浓度为0.2％的胸腺嘧啶盐酸溶液，其体积为肝素溶液的1/3，在60℃下搅拌反应18小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化肝素；

(2)室温下配制质量/体积浓度为1％的壳聚糖水溶液，滴加质量/体积浓度为0.2％的腺嘌呤盐酸溶液，其体积为壳聚糖溶液的1/10，在60℃下搅拌反应18小时，用氨水将反应液调至中性，随后用乙酸乙酯进行萃取，蒸干得到碱基化壳聚糖；

(3)室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，它们的摩尔质量比为1.75，通入氮气，滴加氨水pH调至11，在80℃下搅拌3小时，磁铁分离收集，用去离子水清洗，室温真空干燥得到四氧化三铁粒子；

(4)分别将碱基化肝素和壳聚糖以质量/体积浓度为2.0％溶于石蜡油，加入1/5体积的司班80，然后超声下加入等多聚糖质量的四氧化三铁粒子，随后等体积混合乳化8分钟，以1400rpm搅拌挥发过夜，将搅拌完成后的乳液倒入异丙醇中，磁铁收集纳米颗粒，用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后室温真空干燥。

以上实施例涵盖了最具代表性的实验数据。

Claims (5)

1.一种磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1、室温下配制肝素水溶液，滴加胸腺嘧啶盐酸溶液，在50℃～80℃下搅拌反应得到碱基化肝素；

步骤2、室温下配制壳聚糖水溶液，滴加腺嘌呤盐酸溶液，在50℃～80℃下搅拌反应得到碱基化壳聚糖；

步骤3、室温下将氯化亚铁和氯化铁溶于水，通入氮气，滴加氨水调节pH，在60℃～80℃下搅拌得到四氧化三铁粒子；

步骤4、将碱基化肝素和壳聚糖分别溶于石蜡油，各自加入司班80和四氧化三铁粒子，超声下混合乳化并搅拌挥发，最后倒入异丙醇中析出纳米凝胶。

2.根据权利要求1所述的磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤1中所述肝素溶液的质量浓度为0.6～2％，胸腺嘧啶盐酸溶液的质量浓度为0.1～0.2％，其体积为肝素溶液的1/5～1/2，搅拌时间为12～24小时。

3.根据权利要求1所述的磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤2中所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.3～1％，腺嘌呤盐酸溶液质量浓度为0.1～0.2％，其体积为壳聚糖溶液的1/10～1/5，搅拌时间为12～24小时。

4.根据权利要求1所述的磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤3中所述氯化亚铁和氯化铁的摩尔质量比为1.75，pH范围为10～11，搅拌时间为1～3小时。

5.根据权利要求1所述的磁性多聚糖纳米凝胶材料的制备方法，其特征在于，步骤4中所述碱基化肝素和壳聚糖溶于石蜡油的质量浓度分别都为0.5～2.0％，加入乳化剂司班80的量为石蜡油溶液的1/10～1/5，乳化时间为5～10分钟，搅拌速度为1000～1500rpm。