CN107802845B - 一种使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法 - Google Patents

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Abstract

在非极性溶剂体系下合成的疏水性纳米粒子具有优异的物理和化学性能，在生物医学应用方面具有巨大的潜能。但是，表面疏水性配体的存在限制了它们在生理条件下的应用。本发明提供了一个简易的方法，使用具有良好生物相容性的羧基化处理的丝素蛋白分子作为相转换试剂，实现疏水性纳米粒子向亲水性的相转换。该丝素蛋白分子为两亲性聚合物，具有高含量羧基官能团，赋予其快速地将疏水性纳米粒子由有机相转移到水相体系，并呈现完美的单分散性和稳定性。使用羧基化处理的丝素蛋白分子作为相转换试剂，不仅无毒，而且只需进行简单的分离，便可制得稳定性高和分散性好的亲水性纳米粒子，并以此为模板构建多功能化的诊断治疗纳米体系。

Description

一种使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法
技术领域
本发明属于纳米材料制备以及生物医学应用领域，具体涉及以羧基化处理的丝素蛋白溶液作为相转换试剂用于疏水性纳米粒子的相转换，并将获得的丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子作为模板构建多功能化的诊断治疗纳米体系。
背景技术
无机纳米粒子具有独特的物理和化学性质，在生物医学诊断治疗领域呈现出巨大的潜在应用价值。例如，超顺磁性氧化铁纳米粒子可以用作磁共振成像的T 2造影剂和影像介导的药物递送系统。量子点可以用作生物成像和生物传感的荧光探针。当前，高质量且颗粒尺寸分布均匀的金属无机纳米粒子通常是在非极性溶剂中合成，导致这种条件合成的纳米粒子表面包裹疏水性配体，这些配体使得纳米粒子水溶性和生物相容性都较差，且容易团聚，限制了金属无机纳米粒子在生物应用领域的应用。为了提高其生物医学的应用，多种两亲性聚合物被用于对疏水性纳米粒子进行相转换，使其转相为亲水性纳米粒子。如血清白蛋白（BSA）是研究较多的纳米粒子转相试剂。但是，用血清白蛋白作为转相试剂时，比较困难获得单分散亲水性转相颗粒，大部分亲水性转相颗粒在转相过程中会趋向形成聚集体，严重影响它们的性能和应用。
丝素蛋白是来源于家蚕的天然蛋白质，具有良好的生物相容性、适宜的生物降解性等生物医学方面的性能，已经被FDA批准可应用于医用设备。本发明将羧基化处理的丝素蛋白分子作为相转换试剂，能够使疏水性纳米粒子快速转换成亲水性纳米粒子，赋予其良好的单分散性和长期稳定性。在国内外有关方面的文献和专利中，还未有用羧基化处理的丝素蛋白分子进行疏水性纳米粒子相转换的报道。
发明内容
本发明目的在于制备稳定性高和分散性好的亲水性纳米粒子，提供了一种使用羧基化处理的丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子进行相转换的方法，并以此为模板构建多功能化的诊断治疗纳米体系。本发明克服了现有相转换试剂所需转相时间长、转相颗粒分散性和稳定性差等方面的问题，成功对疏水性纳米粒子进行快速相转换，转换后的亲水性纳米粒子具有良好的单分散性和长期稳定性。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子进行相转换的简易方法的具体步骤为：
（1）制备羧基化处理的丝素蛋白溶液，具体操作为：（a）蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为1%～20%的丝素蛋白水溶液；（b）将丝素蛋白水溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰，然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰，经透析，制备成质量浓度为0.01%～20%的羧基化处理的丝素蛋白溶液。
（2）将步骤（1）得到的羧基化处理的丝素蛋白溶液与疏水性纳米粒子溶液相混合，经震荡（或超声）后得到丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子。具体操作为：将1～100 µg/mL疏水性纳米粒子溶液与步骤（1）制得的质量浓度为0.01%～20%的羧基化处理的丝素蛋白溶液进行混合，放在室温下剧烈震荡（或超声）2小时后，移去有机溶剂，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子。
所述的疏水性纳米粒子为氧化铁纳米粒子或CdS/ZnS量子点或Au−Fe3O4复合纳米颗粒。
所述的疏水性纳米粒子是分散在有机溶剂中。
制得的丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子作为模板在构建多功能化的诊断治疗纳米体系中的应用，包括用作核磁共振成像或荧光成像的造影剂以及疏水性或亲水性药物的纳米载体。
本发明的显著优点在于：
本发明将羧基化处理的丝素蛋白分子作为相转换试剂，转相过程快速简便，转换后的亲水性纳米粒子具有良好的单分散性和稳定性。同时，丝素蛋白具有良好的生物相容性，这使得转相后的纳米粒子在生理环境下也具有良好的生物相容性，赋予其生物医学的应用价值。
尤其重要的是，以羧基化处理的丝素蛋白溶液作为相转换试剂，能够快速的实现纳米粒子的相转换，转换时间只需要2小时以内，显著快于其他形态的丝素蛋白溶液以及其他转相试剂。基于这些显著的优点，本发明提供的相转换方法将为扩大疏水性纳米粒子在生物医学上的应用提供一个新的机遇。
附图说明
图1 相转换后氧化铁纳米粒子分散在水中的透射电镜图；
图2 相转换后氧化铁纳米粒子分散在水中的核磁共振成像；
图3 相转换前后CdS/ZnS量子点在溶剂中的分散性。
具体实施方式
为了验证设计的可行性，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明应用不仅限于此。
实施例1
使用丝素蛋白分子对疏水性氧化铁磁性纳米粒子进行相转换
将蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为5%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白水溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰。然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰。经透析，制备成质量浓度为0.05%的羧基化处理的丝素蛋白溶液。将含有80µg/mL氧化铁纳米粒子的0.2 mL氯仿溶液缓慢加入0.2 mL质量浓度为0.05%的羧基化处理的丝素蛋白溶液中，放在室温下剧烈震荡1小时后，氧化铁纳米粒子从氯仿层转到水层。然后将水溶液移到微型管中，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的丝素蛋白功能化的亲水性氧化铁纳米粒子。以羧基化处理的丝素蛋白溶液作为相转换试剂，能够快速的实现氧化铁纳米粒子的相转换，转换时间只需要1小时，显著快于其他形态的丝素蛋白溶液，如高β-sheet结构的丝素蛋白溶液所需转相时间为12小时。转相后的氧化铁磁性纳米粒子呈现良好的单分散性，在水溶液状态下能够稳定保存12个月，不发生沉淀聚集。而以BSA和高β-sheet结构的丝素蛋白溶液转相后得到的氧化铁纳米粒子放置3个月后发生沉淀。同时，将转相后的氧化铁磁性纳米粒子与细胞共孵育，在高纳米粒子浓度下（300 μg/mL）与细胞共培养24小时后，细胞的存活率仍在95%以上，呈现出良好的生物相容性。图1 为相转换后氧化铁纳米粒子分散在水中的透射电镜图。图2为相转换后氧化铁纳米粒子分散在水中的核磁共振成像。
实施例2
使用丝素蛋白分子对CdS/ZnS量子点纳米粒子进行相转换
将蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为10%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白水溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰。然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰。经透析，制备成质量浓度为6%的羧基化处理的丝素蛋白溶液。将含有10µg/mL CdS/ZnS量子点的2 mL环己烷溶液缓慢加入1 mL质量浓度为 6%的羧基化处理的丝素蛋白溶液中，放在室温下超声0.5小时后，CdS/ZnS量子点纳米粒子就从环己烷层转到水层。然后将水溶液移到微型管中，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的丝素蛋白功能化的亲水性CdS/ZnS量子点纳米粒子。以羧基化处理的丝素蛋白溶液作为相转换试剂，能够快速的实现CdS/ZnS量子点纳米粒子的相转换，转换时间只需要0.5小时，显著快于其他形态的丝素蛋白溶液，如高β-sheet结构的丝素蛋白溶液所需转相时间为12小时。转相后的CdS/ZnS量子点纳米粒子呈现良好的单分散性，在水溶液状态下能够稳定保存12个月，不发生沉淀聚集。而以BSA和高β-sheet结构的丝素蛋白溶液转相后得到的CdS/ZnS量子点纳米粒子放置1个月后发生沉淀。同时，将转相后的CdS/ZnS量子点纳米粒子与细胞共孵育，在高纳米粒子浓度下（200 μg/mL）与细胞共培养24小时后，细胞的存活率仍在95%以上，呈现出良好的生物相容性。图3为相转换前后CdS/ZnS量子点纳米粒子在溶剂中的分散性。
实施例3
使用丝素蛋白分子对疏水性Au−Fe3O4复合纳米颗粒进行相转换
将蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为18%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白水溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰。然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰。经透析，制备成质量浓度为15%的羧基化处理的丝素蛋白溶液。将含有30µg/mL Au−Fe3O4复合纳米颗粒的5 mL氯仿溶液缓慢加入10 mL质量浓度为15%的羧基化处理的丝素蛋白溶液中，放在室温下剧烈震荡2小时后，Au−Fe3O4复合纳米颗粒就从氯仿层转到水层。然后将水溶液移到微型管中，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的丝素蛋白功能化的亲水性Au−Fe3O4复合纳米颗粒。以羧基化处理的丝素蛋白溶液作为相转换试剂，能够快速的实现Au−Fe3O4复合纳米颗粒的相转换，转换时间只需要2小时，显著快于其他形态的丝素蛋白溶液，如高β-sheet结构的丝素蛋白溶液所需转相时间为12小时。转相后的Au−Fe3O4复合纳米颗粒呈现良好的单分散性，在水溶液状态下能够稳定保存12个月，不发生沉淀聚集。而以BSA和高β-sheet结构的丝素蛋白溶液转相后得到的Au−Fe3O4复合纳米颗粒放置2个月后发生沉淀。同时，将转相后的Au−Fe3O4复合纳米颗粒与细胞共孵育，在高纳米粒子浓度下（500 μg/mL）与细胞共培养24小时后，细胞的存活率仍在90%以上，呈现出良好的生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）制备羧基化处理的丝素蛋白溶液；
（2）将步骤（1）得到的羧基化处理的丝素蛋白溶液与疏水性纳米粒子溶液相混合，经震
荡或超声后得到丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子；
具体包括如下具体步骤：
（1）制备羧基化处理的丝素蛋白溶液，具体操作为：（a）蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，
制备成质量浓度为1%～20%的丝素蛋白水溶液；（b）将丝素蛋白水溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰，然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰，
经透析，制备成质量浓度为0 .01%～20%的羧基化处理的丝素蛋白溶液；
（2）制备丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子，具体操作为：将1～100µg/mL疏水性纳米
粒子溶液与步骤（1）制得的质量浓度为0 .01%～20%的羧基化处理的丝素蛋白溶液进行混
合，放在室温下剧烈震荡或超声2小时后，移去有机溶剂，离心洗涤，即得到分散在水溶液中的丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：所述的疏水性纳米粒子为氧化铁纳米粒子或CdS/ZnS量子点或Au−Fe3O4复合纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：所述的疏水性纳米粒子是分散在有机溶剂中。
4.根据权利要求1所述的使用丝素蛋白分子对疏水性纳米粒子相转换的方法，其特征在于：制得的丝素蛋白功能化的亲水性纳米粒子作为模板在构建多功能化的诊断治疗纳米体系中的应用，包括用作核磁共振成像或荧光成像的造影剂以及疏水性或亲水性药物的纳米载体。
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