CN103497347B - 一种双功能壳聚糖微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双功能壳聚糖微球的制备方法，是将超顺磁性Fe3O4纳米粒子的乙醇分散液和壳聚糖的去离子水溶液混合，分散均匀后得到混合液，电喷配制的混合液，用span-80的大豆油溶液接收，得到磁性壳聚糖微球分散液；向所述壳聚糖微球分散液中滴加交联剂溶液，滴完后于室温反应1.5-2.5小时，得到双功能壳聚糖微球。本发明壳聚糖微球尺寸均一、大小可控、形貌规整。本发明使用自发荧光物质代替了有机染料和量子点的外界引入荧光，从而避免所形成的壳聚糖微球在应用时对细胞产生的毒性，阻止了对细胞的二次受害。

Description

一种双功能壳聚糖微球的制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种壳聚糖微球的制备方法，具体地说是一种双功能壳聚糖微球的制备方法，本发明双功能壳聚糖微球同时具有超顺磁性和自发荧光性质。

二、背景技术

磁性的壳聚糖微粒，是一种典型的多功能材料，它很好地将壳聚糖的生物相容性和磁性结合在一起，因而其已被广泛的应用于生物医药研究领域。比如，靶向治疗[Jana Chomoucka.,et al.,Pharmacological Research,2010,62(2),144-149.]、病灶位置的检测[H.P.Shao.,et al.,IEEETransactions on Magnetics,2005,41(10),4102-4104.]、以及化疗和热诊疗[Ji-Ho Park.,et al.,Journal of Magnetism and Magnetic Materials,2005,293,328–333.]等。值得一提的是，研究者们常倾向于把荧光性能也引入到磁性的壳聚糖中，从而进一步提高材料的应用能力，应用于生物大分子检测，既能对反应物进行快速分离和纯化，又能在靶向治疗的时候能够通过荧光检测这种传递的效率[L.L.Li.,et al.,Nanotechnology,2007,18,405102.]，或者是被用于双模式检测、光学治疗，以提高检测的精确性或治疗方式的多样性[W.B.Tan.,et al.,Advanced Materials,2005,17,2375-2380.]。

早期的研究中，制备的磁性荧光微球的荧光主要来源于有机染料或者量子点，这些物质对细胞有一定毒性。近年来，Ma等人[Ma.,et al.,Advanced Functional Materials,2007,17,3153-3158.]发现交联的壳聚糖有自发荧光性质。

发明人在实验的时候发现像乳化、雾化干燥、碱沉淀等传统工艺在制备双功能壳聚糖微球的时候存在一定的局限性。例如乳化工艺中，磁性纳米粒子只是具有较好的水分散性[M.Mahmoudi.,et al.,Advanced Drug Delivery Reviews,2011,63,24–46.]，而水溶液里，乳化过程中纳米粒子并不能稳定分散在胶粒里。而雾化干燥或碱沉淀技术中，很难制备出单分散性好的交联微粒[G.H.Ma.,et al.,Macromolecular Symposia,2010,288,41–48.]。

三、发明内容

本发明旨在提供一种双功能壳聚糖微球的制备方法，所要解决的技术问题是使壳聚糖微球具有超顺磁性和自发荧光性质，并且壳聚糖微球分散均匀，尺寸均一，形貌可控，无细胞毒性。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明双功能壳聚糖微球的制备方法，按以下步骤操作：

1）将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液和壳聚糖的去离子水溶液混合，分散均匀后得到混合液，所述混合液中超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的浓度为2.5-10mg/mL，所述混合液中壳聚糖的浓度为15-25mg/mL；混合液中乙醇和去离子水的体积比优选1:1。

本发明使用超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液的原因是：

a、超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子在乙醇中分散好且稳定；b、提高壳聚糖溶液的粘度，降低导电性，有利于电喷。

2）电喷步骤1）配制的混合液，用质量浓度0.5-4wt%的span-80的大豆油溶液接收，得到磁性壳聚糖微球分散液；

3）向所述壳聚糖微球分散液中滴加质量浓度0.2-2.5%的交联剂溶液，滴完后于室温反应1.5-2.5小时，得到双功能壳聚糖微球；步骤2）中电喷的混合液的体积（即接收的混合液的体积）与所述交联剂溶液的体积之比为1.5:10。

步骤1）中向所述混合液中加入乙酸辅助溶解，乙酸的质量是壳聚糖质量的1-5倍。

步骤2）中电喷时使用的针头型号为7#、8#或9#针头，电喷时的接收距离为8-25cm，电压15-35kV。

步骤2）电喷过程中在针头下方固定一直径为6cm的铜环，铜环的圆心与针头处于同一垂直线上，铜环距针头的垂直距离为1-5cm，铜环起到限制微球喷射范围和提高电喷稳定性的作用。

步骤2）中用于接收的span-80的大豆油溶液的体积是电喷的混合液体积的20-100倍。

所述交联剂选自戊二醛、甲醛、丁二醛或京尼平。

本发明使用的7#针头的内径为0.40mm，外径为0.70mm；8#针头的内径为0.50mm,外径为0.80mm；9#针头的内径为0.60mm，外径为0.90mm。

本发明电喷时以针头与电极间的高度作为接收距离，因为针头与电极间会产生电场，从而影响磁性壳聚糖微球的尺寸。用于接收的质量浓度0.5-4wt%的span-80的大豆油溶液简称为接收液。所谓电极即为放置接收液的铝箔。

本发明使用的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子为常规共沉淀方法制备得到，参考文献[Liu X.,etal.,J Magn Magn Mater2004;270:1-6.]，具体制备步骤如下：

称量2.705g(0.01mol)FeCl₃·6H₂O和0.995g(0.005mol)FeCl₂·4H₂O溶于100ml去离子水中，转移到250ml三颈瓶中，在氮气保护下强力搅拌并逐步升温到80℃，待恒温5分钟后，用恒压滴定管缓慢滴加5mL浓氨水（25wt%），待滴定完的2min后测定溶液pH值，调节pH值至8-9，在氮气的保护下继续恒温反应20min。反应结束后磁性分离产品，水洗3次至溶液中性，换用乙醇清洗2次，得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子1g。将制得的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子分散于100mL乙醇溶液中得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液。

电喷法制备高聚物微球是近十几年才兴起的加工工艺，然而它始一出现即向我们展示出其在医药领域的优越性。这种微球不仅对可稳定分散于溶液体系中的药物有很好的承载能力，对可稳定分散的生物大分子和无机粒子也都具有极高的囊括和固定的能力[N.Bock.,et al.,Progress in Polymer Science,2012,37(11),1510–1551.]。

本发明首先通过电喷法制备磁性壳聚糖微球，再使壳聚糖交联，在固定微球形态的同时赋予壳聚糖微球磁性和荧光双重性质。

本发明制备的具有超顺磁性和自发荧光性质的双功能壳聚糖微球，其粒径可以在1-10μm间变化，根据选择不同的电喷针头型号，电压，接收距离，就可以简单而快捷的获得不同粒径的微球。

本发明制备的壳聚糖微球的自发荧光性质解决了传统加入有机染料和量子点引入荧光造成的细胞毒性问题。本发明壳聚糖微球的可设计性强，操作过程方便，实验设备简单，实验取材环保经济。壳聚糖微球尺寸均一、大小可控、形貌规整，荧光特性比较稳定，磁性较佳。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明制得的壳聚糖微球是一种具自发荧光性质和超顺磁性的双功能微球，其相比单一性能的壳聚糖微球更具适用性。将本发明壳聚糖微球应用于生物大分子检测，既能对反应物进行快速分离和纯化，又能在靶向治疗的时候能够通过荧光检测这种传递的效率，或者是被用于双模式检测、光学治疗，以提高检测的精确性或治疗方式的多样性。

2、本发明制得的壳聚糖微球尺寸均一、大小可控、形貌规整。

3、本发明采用电喷方式制备双功能的壳聚糖微球，其产品功能的可设计性强，操作过程方便，实验设备简单，实验取材环保经济。

4、本发明使用自发荧光物质代替了有机染料和量子点的外界引入荧光，从而避免所形成的壳聚糖微球在应用时对细胞产生的毒性，阻止了对细胞的二次受害。

四、附图说明

图1为电喷过程的流程示意图。

图2为本发明实施例1制备的双功能壳聚糖微球的扫面电子显微镜照片（a）及其粒径分布图（b）。从图2a可以看到壳聚糖微球尺寸约为2μm左右，分散较为单一；图2b中壳聚糖微球的粒度表征数据得到壳聚糖微球尺寸为2μm左右。

图3为本发明制备的双功能壳聚糖微球的分散液直观图片（a）及磁性能（b）。其中图b是当有磁体靠近分散液时，分散液中的壳聚糖微球在磁场的作用下产生定向移动，最终聚集于靠近磁体一端的玻璃壁上，由此可以看出壳聚糖微球具备优异的顺磁性。

图4为本发明制备的双功能壳聚糖微球的在不同激发波长下的荧光电子显微镜图片。其中图a激发滤光片为330-380nm，图b激发滤光片为450-490nm，图c激发滤光片为450-490nm，图d激发滤光片为510-560nm，对应的观察范围为425-475nm，500-550nm，≥515nm，≥590nm。从图4中可以看出交联后的磁性壳聚糖能够发射荧光，而且在不同波长的激发光激发下，能够依次发出蓝色、绿色、黄色、红色的荧光。测试过程中，激发光的强度和照相时曝光时间是相同的，因此可见壳聚糖微球最大发射波长在绿光区。

图5为本发明实施例2制备的双功能壳聚糖微球的扫描电子显微镜图片，由图5可看出壳聚糖微球的粒径在1μm左右。

五、具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。

实施例1：

1、超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

称量2.705g(0.01mol)FeCl₃·6H₂O和0.995g(0.005mol)FeCl₂·4H₂O溶于100ml去离子水中，转移到250ml三颈瓶中，在氮气保护下强力搅拌并逐步升温到80℃，待恒温5分钟后，用恒压滴定管缓慢滴加5mL浓氨水（25wt%），待滴定完的2min后测定溶液pH值，调节pH值至8-9，在氮气的保护下继续恒温反应20min。反应结束后磁性分离产品，水洗3次至溶液中性，换用乙醇清洗2次，得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子1g。将制得的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子分散于100mL乙醇溶液中得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液，备用。

2、双功能壳聚糖微球的制备

1）将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液10mL、9.7mL去离子水、0.300g壳聚糖以及0.3mL乙酸加入50mL单颈瓶中，搅拌分散24h后得到混合液，为均匀的黑色溶液。

2）电喷步骤1）配制的混合液，针头型号为9#，接收距离为13cm，电压28kV，在针头下方固定一直径（内径）为6cm的铜环，铜环的圆心与针头处于同一垂直线上，铜环距针头的垂直距离为3cm，使得微球电喷更加均匀和稳定，用80mL质量浓度2wt%的span-80的大豆油溶液接收，机械搅拌，电喷时间为1h，喷液量为1.5mL，得到磁性壳聚糖微球分散液，为了；

3）将步骤2）得到的壳聚糖微球分散液移入250mL三颈瓶中，室温下机械搅拌，并缓慢滴加质量浓度0.5%的戊二醛溶液10mL，滴加时间为15min，滴完后于室温反应2h；反应结束后通过离心对壳聚糖微球进行分离，离心速率为6000r/min，时间为10min，然后用丙酮洗涤以除去大豆油和表面活性剂，重复洗涤3次，再用去离子水洗涤2次，得到双功能壳聚糖微球，洗涤时采用磁分离。本实施例制备的双功能壳聚糖微球粒径在2μm左右，扫描电子显微镜照片见图2。

实施例2：

1、超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的制备

称量2.705g(0.01mol)FeCl₃·6H₂O和0.995g(0.005mol)FeCl₂·4H₂O溶于100ml去离子水中，转移到250ml三颈瓶中，在氮气保护下强力搅拌并逐步升温到80℃，待恒温5分钟后，用恒压滴定管缓慢滴加5mL浓氨水（25wt%），待滴定完的2min后测定溶液pH值，调节pH值至8-9，在氮气的保护下继续恒温反应20min。反应结束后磁性分离产品，水洗3次至溶液中性，换用乙醇清洗2次，得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子1g。将制得的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子分散于100mL乙醇溶液中得到超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液，备用。

2、双功能壳聚糖微球的制备

1）将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液10mL、9.7mL去离子水、0.300g壳聚糖以及0.3mL乙酸加入50mL单颈瓶中，搅拌分散24h后得到混合液，为均匀的黑色溶液。

2）电喷步骤1）配制的混合液，针头型号为7#，接收距离为13cm，电压30kV，在针头下方固定一直径（内径）为6cm的铜环，铜环的圆心与针头处于同一垂直线上，铜环距针头的垂直距离为3cm，使得微球电喷更加均匀和稳定，用80mL质量浓度2wt%的span-80的大豆油溶液接收，机械搅拌，电喷时间为1h，喷液量为1.5mL，得到磁性壳聚糖微球分散液，；

3）将步骤2）得到的壳聚糖微球分散液移入250mL三颈瓶中，室温下机械搅拌，并缓慢滴加质量浓度0.5%的戊二醛溶液10mL，滴加时间为15min，滴完后于室温反应2h；反应结束后通过离心对壳聚糖微球进行分离，离心速率为6000r/min，时间为10min，然后用丙酮洗涤以除去大豆油和表面活性剂，重复洗涤3次，再用去离子水洗涤2次，得到双功能壳聚糖微球，洗涤时采用磁分离。本实施例制备的双功能壳聚糖微球粒径在1μm左右，扫描电子显微镜照片见图5。

实施例3：

本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤2）中使用的针头型号为8#，电压为30kv。本实施例制备的双功能壳聚糖微球粒径在1.5μm左右。

实施例4：

本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤2）中使用的针头型号为7#，电压为35kv。本实施例制备的双功能壳聚糖微球粒径在0.5μm左右。

实施例5：

本实施例的制备过程同实施例1，不同的是步骤2）中使用的针头型号为9#，电压为20kv。本实施例制备的双功能壳聚糖微球粒径在2.6μm左右。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均就包含在本发明的保护范围之内。

如改变针头型号为7#，8#,调节电压等电喷工艺条件，都属于本发明的所属范畴。

Claims (1)

1.一种双功能壳聚糖微球的制备方法，其特征在于按以下步骤操作：

1）将超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液和壳聚糖的去离子水溶液混合，分散均匀后得到混合液，所述混合液中超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的浓度为2.5-10mg/mL，所述混合液中壳聚糖的浓度为15-25mg/mL；向所述混合液中加入乙酸辅助溶解，乙酸的质量是壳聚糖质量的1-5倍；

2）电喷步骤1）配制的混合液，用质量浓度0.5-4wt% 的span-80的大豆油溶液接收，得到磁性壳聚糖微球分散液；电喷时使用的针头型号为7#、8#或9#针头，电喷时的接收距离为8-25cm，电压15-35 kV；电喷过程中在针头下方固定一直径为6cm的铜环，铜环的圆心与针头处于同一垂直线上，铜环距针头的垂直距离为1-5cm，铜环起到限制微球喷射范围和提高电喷稳定性的作用；用于接收的span-80的大豆油溶液的体积是电喷的混合液体积的20-100倍；

3）向所述壳聚糖微球分散液中滴加质量浓度0.2-2.5%的交联剂溶液，滴完后于室温反应1.5-2.5小时，得到双功能壳聚糖微球；电喷的混合液的体积与所述交联剂溶液的体积之比为1.5:10；所述交联剂选自戊二醛、甲醛、丁二醛或京尼平。