KR101882589B1 - 나노 복합체, 이를 포함하는 코팅용 조성물, 나노 복합체의 제조 장치 및 방법 - Google Patents

나노 복합체, 이를 포함하는 코팅용 조성물, 나노 복합체의 제조 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 나노 복합체, 이를 포함하는 조영제 조성물, 나노 복합체의 제조 장치 및 방법에 관한 것으로서, 본 출원의 나노 복합체는 우수한 저장 안정성, 유전자 전달 성능 및 낮은 세포 독성을 가져 인체 내 다양한 용도로 사용가능하며, 높은 세포적 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가지므로, MRI 및/또는 CT용 조영제로 사용 시 강한 영상 신호를 유도하여 우수한 콘트라스트를 가지는 영상을 구현할 수 있다.

Description

나노 복합체, 이를 포함하는 코팅용 조성물, 나노 복합체의 제조 장치 및 방법{NANOCOMPOSITE, COMPOSITION FOR CONTRAST AGENT COMPRISING THE SAME, APPARATUS FOR MANUFACTURING NANOCOMPOSITE, AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}
본 출원은 나노 복합체, 이를 포함하는 조영제 조성물, 나노 복합체의 제조 장치 및 방법에 관한 것이다.
입경이 10 내지 500 nm 범위 내에서 미세하게 합성 및 변형된 나노 입자는 치료 및/또는 진단을 목적으로 다양하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 입자의 넓은 활성 부위는, 세포 또는 조직의 효율적인 진단 및 치료를 위한 약물, 단백질, 프로브 물질 등의 기능성 물질과의 결합 및 이들 물질의 운송 능력을 향상시킬 수 있다. 비록 상기 나노입자를 제조하기 위한 다양한 접근이 시도되고 있으나, 상기 물질의 물성 및 효율을 향상시키기 위한 연구가 추가로 요구되고 있다.
최근 생체적합성 플랫폼으로서 안정적이고, 안전한 물리 화학적 특성을 보이며, 높은 수율로 생산 가능한 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA)이 주목받고 있다. 또한, 최근 상기 특성을 향상시키거나 보완하기 위하여 다른 기능성 성분을 가지는 고분자를 결합시키거나 연결기 위한 시도가 이루어지고 있다.
특히, 고분자가 결합된 금속 입자는 치료 또는 진단 분야에 용이하게 적용된다. 구체적으로, 최근에는 생기능 유기 성분이 결합된 다양한 금속 나노 입자들을 화학 또는 광열 치료를 위해 사용되고 있다. 이는 상기 나노 입자들이 근적외선 조사 하에서 세포 내 존재 할 때, 나노 입자의 표면 플라즈몬 공명 가열(Surface Plasmon Resonance Heating) 현상이 발생되기 때문이다. 상기 근적외선은 물 또는 헤모글로빈 내에서 높은 전달효율을 가지기 때문에, 비 침습적 방법들(Non-Invasive Methods)을 이용해 암세포를 죽이거나 깊숙한 조직에 침투시키는데 적합하다. 상기 근적외선 조사에 의해 유도된 높은 열에너지는 온도 반응성 약물 방출(Thermoresponsive Drug Release) 및 고열 효과(Hyperthermic Effect)를 발생하기 때문에 암세포를 치료하거나 죽일 수 있다.
상기 다양한 금속 나노 입자 중에서, 특히, 금과 철은 비 염증성 제제(Nonproinflammatory Agent)로 잘 알려져 있기 때문에, 상기 금 또는 철을 포함하는 나노 입자는 종종 치료 진단 응용분야에 나노 캐리어 또는 방사선 조사 센서로도 사용되고 있고, 예를 들어, 조영제 또는 온열 치료제에 이용되어 왔다. 구체적으로, 상기 철 나노 입자는 자기 공명 영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging) 장치, 약물 표적화 및 세포 형질 전환 등의 다양한 바이오 의학 분야에 이용되고 있고, 금 나노 입자는 컴퓨터 단층 촬영(Computer　Tomography, CT) 장치 등에 이용되고 있다.
또한, 기존에는 상기 금속 나노 입자를 제조하기 위한 방법으로 금속 입자의 현탁을 기반으로 하는 많은 습식 화학 공정(Wet Chemistry Formulations)이 제안되어 왔지만, 이러한 공정은 오로지 짧은 시간 동안만 사용될 수 있다. 더욱이, 유기 또는 고분자 성분이 포함된 금속 나노입자들은 일반적으로 가수분해에 의해 점진적으로 분해되기 때문에 불안정하다. 따라서, 현탁액 또는 콜로이드 형태의 생기능성 나노입자는 적합하지 않다. 또한, 콜로이드 형태의 나노 입자는 저장 동안 응집되는 경향으로 인해, 물질의 성질을 변화되기 때문에, 바이오 분야에 사용되기에 부적합하다. 특히, 기존 습식 화학 공정의 경우, 맞춤형(On-Demand) 나노 입자의 기능을 변화하기 위해서는 복합한 공정을 수행해야 되는 단점이 존재한다.
ACS Appl. Mater, Interfaces, 4(5), 제2693-2698쪽 (2012.04.17) Small, 10(12), 제2476-2486쪽 (2014.06.18)
본 출원은 우수한 저장 안정성, 유전자 전달 성능 및 낮은 세포 독성을 가지며 인체 내 다양한 용도로 사용가능하며, 높은 세포적 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가지므로, MRI 및/또는 CT용 조영제로 사용 시 강한 영상 신호를 유도하여 우수한 콘트라스트를 가지는 영상을 구현할 수 있는 나노 복합체 및 이를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 출원은 나노 복합체에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 나노 복합체는 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 코어 및 상기 코어를 둘러싸고 있는 생체적합성 고분자를 포함하는 쉘을 포함하고, 상기 나노 복합체의 프랙탈 차원값을 특정 범위 내로 조절함으로써, 우수한 저장 안정성, 유전자 전달 성능 및 낮은 세포 독성을 가져 인체 내 다양한 용도로 사용가능하며, 높은 세포적 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가지므로, MRI 및/또는 CT용 조영제로 사용 시 강한 영상 신호를 유도하여 우수한 콘트라스트를 가지는 영상을 구현할 수 있다.
본 출원에서 용어 「나노」는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 「나노 복합체」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 직경을 가지며, 2 종류 이상의 물질을 조합함으로써 물리적 또는 화학적으로 원래 소재와는 다른 우수한 기능을 갖는 물질을 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 평균 직경을 갖는 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 출원의 나노 복합체(100)의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 1과 같이, 본 출원의 일 구현예에 따른 나노 복합체(100)는 코어(110) 및 쉘(120)을 포함한다. 하나의 예시에서 상기 나노 복합체는 코어-쉘의 2중 구조를 가지는 입자일 수 있다. 예를 들면, 상기 나노 복합체는 나노 입자 또는 상기 나노 입자의 응집체를 제조하여 코어(110)를 형성하며, 상기 코어(110)에 생체적합성 고분자를 결합시켜 상기 코어(110)를 둘러싸는 쉘(120)을 형성함으로써 제조된 것일 수 있다. 상기에서 「코어」는 상기 2중 구조의 내측에 존재하는 부분을 의미하며, 상기 「쉘」은 상기 코어(110)를 둘러싸는 외측 부분을 의미한다. 또한, 상기에서 「둘러싼다」는 입자의 외주 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것을 의미하며, 상기에서 외주 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것은 예를 들면, 외주 표면의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이 덮이도록 형성되는 것을 의미한다.
상기 코어(110)는 나노 입자 또는 상기 나노 입자의 응집체(Agglomerate)를 포함하며, 상기 나노 입자는 반자성체(Diamagnetism Substance), 상자성(Paramagnetism Metal) 금속 및 강자성 금속(Ferromagnetism Metal)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함한다. 예를 들어, 상기 코어(110)는 반자성체으로 이루어진 나노 입자 또는 응집체일 수 있고, 상자성 금속으로 이루어진 금속 나노 입자 또는 응집체일 수 있으며, 강자성 금속으로 이루어진 금속 나노 입자 또는 응집체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 코어는 반자성체와 상자성 금속의 복합 나노 응집체, 반자성체와 강자성 금속의 복합 나노 응집체, 상자성 금속과 강자성 금속의 복합 금속 나노 응집체 또는 반자성체, 상자성 및 강자성 금속의 복합 나노 응집체일 수 있다. 상기 코어가, 전술한 나노 입자 또는 응집체를 포함함에 따라, 상기 나노 복합체는 우수한 X-선 흡수성을 가질 수 있고, 또한, 상기 나노 복합체의 자기적 성질이 적절하게 조절되어 우수한 포화 자화 특성을 가질 수 있으므로, MRI용 및/또는 CT용 조영제로 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 「반자성체」는 외부 자기장을 인가시켰을 때, 자화(Magnetiszation)의 방향이 상기 외부 자기장의 방향과 반대로 형성되는 물질을 의미한다. 또한, 상기에서 용어 「상자성 금속」은 외부 자기장이 인가되면 자기장의 방향으로 자화되어 자기적 성질을 가지지만, 외부 자기장이 사라지면 자기적 성질을 잃어버리는 금속을 의미한다. 또한, 상기에서 용어 「강자성 금속」은 외부 자기장이 없는 상태에서도 자화되어 자기적 특성을 가지는 금속을 의미하며, 예를 들어, 자기장에 의해 그 방향으로 강하게 자화되고, 자기장을 제거해도 잔류 자화를 남겨 자기 히스테리시스를 나타내는 금속을 의미한다.
하나의 예시에서, 상기 반자성체는 X-선 흡수성을 가지는 물질일 수 있다. 본 명세서에서 용어 「X-선(X-ray)」은 파장이 0.01 내지 10　nm 이고,　주파수는 30×1015 Hz 내지 30×1018 Hz　내인　전자기파를 의미하고, 이는　자외선보다 짧은 파장의 영역의 전자기파를 의미한다.
본 출원의 나노 복합체는 상기 X-선 흡수성을 가지는 반자성체를 포함할 수 있으며, 이에 따라 우수한 X-선 흡수성을 가질 수 있다. 일반적으로, MRI(Magnetic Resonance Imaging) 또는 CT(Computer　Tomography) 영상은 발광부와 흡광부의 밝기 차이를 기록하는 것이고, X-선 흡수성이 우수하다는 것은 흡광부의 영상신호가 강하다는 것을 의미한다. 따라서, 본 출원에 따른 나노 복합체는 X-선 CT(X-ray Computer　Tomography) 또는 MRI의 조영제로 적용 시 강한 영상 신호를 유도하여 콘트라스트(Contrast) 효과가 우수한 영상을 구현할 수 있다.
상기에서 용어 「조영제(Contrast Medium)」는 위, 장관, 혈관, 뇌척수강, 관절강 등에 투입하여 MRI 장치 및 CT 장치와 같은 방사선 검사시에 조직이나 혈관을 구분하기 용이하도록 해주는 기능성 약품을 의미한다.
하나의 예시에서, 상기 X-선 흡수성을 갖는 반자성체는 금(Au), 은(Ag), 비스무트(Bi) 및 탄탈륨(Ta)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 X-선 흡수성 금속은 금(Au)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 예시에서, 상기 X-선 흡수성 반자성체는 상기 금속의 합금, 금속 황화물 또는 금속 산화물을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 합금은 금-은(Au-Ag)합금일 수 있고, 상기 금속 황화물은 황화비스무트(Bi2S3)일 수 있으며, 상기 금속 산화물은 산화탄탈륨(Ta2O5)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 금(Au)의 경우, X-선 흡수가 강할 뿐 아니라, 비교적 인체에 유해하지 않는 금속으로써, 인체 내 혈액으로 주입되는 조영제 또는 광열 치료제(Photothermal Therapy Agent) 등에 적합하게 이용될 수 있다.
본 출원의 나노 복합체는 상기 상자성 금속 및/또는 강자성 금속을 포함할 수 있으며, 이에 따라 우수한 자기장 흡수성 및 포화 자화 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, MRI는 체내에 있는 수소 원자 핵이 강력한 자기장에 놓였을 때 자기 에너지를 흡수해서 나오는 신호를 영상화하는 촬영기술이다. 즉, MRI용 조영제에는 상기 자기 에너지를 흡수하여 강한 신호를 유도하는 기능이 요구된다. 따라서, 상기 상자성 금속 및/또는 강자성 금속을 포함하는 본 출원의 나노 복합체는 MRI용 조영제 조성물에도 적합하게 사용될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 상자성 금속은 백금(Pt), 주석(Sn), 텅스텐(W), 몰리브덴(Mo), 알루미늄(Al), 망간(Mn), 팔라듐(Pd), 로듐(Rh), 루테늄(Ru), 지르코늄(Zr), 유로퓸(Eu) 및 디스프로슘(Dy)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 상자성 금속은 백금일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 백금의 경우, 자기장 흡수가 강할 뿐 아니라, 비교적 인체에 유해하지 않는 금속으로써, 인체 내 혈액으로 주입되는 조영제 또는 광열 치료제(Photothermal Therapy Agent) 등에 적합하게 이용될 수 있다.
상기 강자성 금속은 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co) 및 가돌리늄(Gd) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전이 금속을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 강자성 금속은 철일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 다른 예시에서, 본 출원의 나노 복합체는 상기 반자성체와 강자성 금속; 또는 반자성체와 상자성 금속을 포함할 수 있으며, 이 경우, 우수한 X-선 흡수능 및 자기장 흡수능을 구현할 수 있기 때문에, MRI-CT 듀얼 영상 장치의 조영제에 적용될 수 있으며, 강한 영상 신호를 유도하여 콘트라스트 효과가 우수한 영상을 구현할 수 있다.
상기 쉘(120)은 생체적합성 고분자를 포함할 수 있다. 상기 쉘(120)은 생체적합성 고분자를 포함함으로써, 코어(110)에 존재하는 금속에 의해 유발되는 세포독성을 최소화할 수 있으며, 이에 따라 상기 나노 복합체는 우수한 생체적합성을 가질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 생체적합성 고분자는 인체 내에서 낮은 세포 독성을 가지는 고분자라면, 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 구현예에서 상기 생체적합성 고분자는 합성 고분자, 천연 고분자 및 천연 고분자 유래 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 고분자를 포함할 수 있다.
상기 합성 고분자는 폴리(베타-히드록시 에틸 메타아크릴레이트)[Poly(Beta-Hydroxyethyl Methacrylate), PHEMA]; 폴리아크릴아미드(Polyacrylamide, PA); 폴리비닐 알코올(Polyvinyl Alcohol, PVA); 폴리아크릴 산(Polyacrylic Acid, PAA), 그 염 및 그 유도체; 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP); 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethyleneoxide, PEO); 폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol, PEG); 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly(Ethylene Oxide-b-Propylene Oxide), PEO-PPO); 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine); 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine); 폴리락트산(PLA); 폴리글리콜산(PGA); 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 공중합체; 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine) 및 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 고분자로는 생체적합성을 가지는 것이라면, 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 천연 고분자는 키토산(Chitosan), 그 염 및 그 유도체; 덱스트란 및 그 유도체; 아카시아 검(Acacia Gum); 트라가칸친(Tragacanthin); 히알루론 산(Hyaluronic Acid), 그 염 및 그 유도체; 펙틴(Pectin), 그 염 및 그 유도체; 알긴산(Alginic Acid), 그 염 및 그 유도체; 아가(Agar); 갈락토만난(Galactomannans), 그 염 및 그 유도체; 잔 탄(Xanthan), 그 염 및 그 유도체; 베타-사이클로덱스트린(Beta-Cyclodextrin), 그 염 및 그 유도체; 및 아밀 로즈(Amylose, 수용성 전분), 그 염 및 그 유도체; 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 천연 고분자 유래 고분자는 글리콜 키토산(Glycol Chitosan), 그 염 및 그 유도체; 카복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl Cellulose, CMC), 그 염 및 그 유도체; 히드록시에틸 셀룰로오스(Hydroxyethyl Cellulose, HEC), 그 염 및 그 유도체; 히 드록시프로필 셀룰로오스(Hydroxypropyl Cellulose, HPC), 그 염 및 그 유도체; 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (Hydroxypropyl Methylcellulose, HPMC); 메틸셀룰로오스(Methylcellulose), 그 염 및 그 유도체; 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(Cellulose Acetate Phthalate), 그 염 및 그 유도체; 젤라틴(Gelatin), 그 염 및 그 유도체; 프로타민 설페이트(Protamine Sulfate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 프로타민 설페이트(Protamine Sulfate)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체적합성 고분자는 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민　설페이트(Protamine Sulfate), 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 고분자는 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민　설페이트(Protamine Sulfate) 및 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine)을 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 쉘에 포함되는 생체적합성 고분자는, 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민　설페이트(Protamine Sulfate) 및 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 상기 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민　설페이트(Protamine Sulfate) 및 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine)을 포함하는 생체적합성 고분자 혼합물(PM, Polymer Mixture)을 바람직하게 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 나노 복합체의 형성 과정에서, 상기 생체적합성 고분자와 전술한 나노 입자 사이의 계면 장력(Interfacial Tension)은 나노 입자들 사이의 계면 장력에 비해 높게 형성하기 때문에, 코어가 내부에 형성되도록 유도하면서, 동시에 상기 생체적합성 고분자는 상기 코어를 효과적으로 둘러쌀 수 있고, 이러한 코어-쉘 구조의 특유의 구조적 형상으로 인해, 본 출원의 나노 복합체는 전술한 MRI 장치, CT 장치 또는 MRI-CT 듀얼 영상 장치의 조영제로 적용 시 우수한 생체적합성 및 우수한 콘트라스트(Contrast) 성능을 나타낼 수 있다.
상기 나노 복합체는 코어-쉘 구조 이외에도, 특유의 구조적 형상(Morphology)을 가질 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 나노 복합체의 프랙탈 차원(Fractal Dimension, df) 값은 1.6 내지 2.8일 수 있고, 예를 들어, 1.7 내지 2.6 또는 1.9 내지 2.5일 수 있으며, 바람직하게는 1.6 내지 2.3일 수 있다. 본 출원에서 용어 「프랙탈 차원」이란, 주지된 바와 같이, 임의 형상 입자에 대한 형상 정보를 나타내는 지표를 의미하고, 예를 들어, 프랙탈 차원 값이 클수록 입자의 형상이 구형임을 의미할 수 있고, 프랙탈 차원 값이 작을수록 비구형임을 의미할 수 있다.
상기 프랙탈 차원 값은 하기 일반식 1에 의해 결정될 수 있다.
[일반식 1]
Figure 112016128767046-pat00001
상기 일반식 1에서, k는 비례 상수를 나타내고, db는 나노 복합체의 평균 입경 이동도(Mobility Equivalent Diameter)를 나타내며,
Figure 112016128767046-pat00002
는 나노 복합체의 유효 밀도(Effective Density)를 나타낸다. 단, db는 1이 아니며, k는 반응 조건에 따라 적절히 변경될 수 있으며, 예를 들어, 104 이하의 정수일 수 있다. 또한, 상기 k 값의 하한은 0이 아닌 정수이면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 0.01 이상, 0.001 이상 또는 0.0001 이상일 수 있다.
상기 일반식 1에서 계산되는 프랙탈 차원(df)값이 예를 들어, 1에 가까운 값을 가지게 되면 입자의 형상이 직선 모양의 1차원적인 형태를 가지는 것을 의미하고, 3에 가까운 값을 가지게 되면 입자의 형상이 구형의 3차원적인 형태를 가지는 것을 의미한다.
예시적인 본 출원의 나노 복합체는, 상기 나노 복합체의 프랙탈 차원 값이 전술한 범위 내로 조절됨으로써, 상기 나노 복합체는 비구형의 형상, 예를 들면 포도 송이와 같은 번치(Bunch) 또는 헤어리(Hairy) 형상을 가질 수 있다. 나아가, 본 출원의 나노 복합체가 조영제 조성물에 적용되는 경우, 상기 비구형의 구조적 형상으로 인해 높은 세포 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가질할 수 있다. 반면, 프랙탈 차원 값이 전술한 범위를 벗어나는 경우, 입자의 형상이 구형 또는 직선형을 갖게 되어, 나노 복합체가 조영제 조성물에 적용되는 경우, 조영제의 세포 흡수성 및 자화 특성(Saturation Magnetization)이 저하될 수 있다. 나아가 나노 복합체의 비구형의 형상은 약물 또는 유전자와의 효과적인 결합을 위한 더 큰 기능적 표면을 제공할 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 나노 복합체는 적어도 하나 이상의 코어-쉘 구조를 가지는 나노 복합체가 결합된 구조체일 수 있다.
상기 나노 복합체의 프랙탈 차원 값은, 코어를 형성하는 나노 입자 응집체가 비구형 형상을 가지도록 제어하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 기체 상 스파크 방전에 의해 형성된 나노 입자는 형성 즉시, 서로 충돌하여, 비구형 형상의 응집체를 형성할 수 있으며, 상기 생체 적합성 고분자는 상기 비구형 형상의 응집체의 형상을 따라 캡슐화됨 함에 따라, 본 출원의 나노 복합체도 비구형의 형상을 가질 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 출원의 나노 복합체는 또한, 전술한 프랙탈 차원 값을 가짐에 따라, 구형의 입자에 비해 우수한 광 흡수성을 나타낼 수 있다. 하나의 예시에서, 비구형 형상의 상기 나노 복합체는 전술한 우수한 X-선 흡수성 이외에도 우수한 근적외선(Near-Infrared, NIR) 흡수성도 가질 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 복합체는, 온열 치료(Thermal Therapy) 또는 광열 치료(Photothermal Therapy) 분야에 적합하게 이용될 수 있다. 상기에서 용어 「근적외선」은 800 nm 내지 1200 nm 파장 영역의 빛을 의미한다.
하나의 예시에서, 상기 나노 복합체는 평균 직경이 30 nm 내지 300 nm일 수 있고, 예를 들어, 50 nm 내지 250 nm, 80 nm 내지 200 nm 또는 80 nm 내지 150 nm일 수 있다.
하나의 예시에서, 본 출원에 따른 나노 복합체의 비표면적은 50 m2/g 내지 1000 m2/g일 수 있고, 예를 들면, 100 m2/g 내지 800 m2/g, 200 m2/g 내지 600 m2/g 또는 250 m2/g 내지 500 m2/g일 수 있다. 상기 「비표면적」은 이동성 입자 주사 정립기(Scanning Mobility Particle Sizer(SMPS), 3936, TSI, USA)로 측정한 나노 입자의 농도 및 평균 입경 및 표준 편차 값으로부터 계산될 수 있다. 상기 나노 복합체의 비표면적이 전술한 범위 내로 조절됨에 따라, 상기 나노 복합체는 보다 우수한 유전자 전달 성능을 가질 수 있다.
본 출원은 또한, 조영제 조성물을 제공한다. 본 출원의 조영제 조성물은 전술한 나노 복합체를 포함할 수 있으며, 상기 나노 복합체가 상기 조성물 내에 분산되어 있을 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 복합체에서 설명한 내용과 중복되는 내용은 생략하기로 한다.
예시적인 본 출원의 조영제 조성물은, 전술한 나노 복합체를 포함함으로써, 우수한 저장 안정성, 유전자 전달 성능 및 낮은 세포 독성을 가지며 인체 내 다양한 용도로 사용 가능하다. 또한, MRI 장치, CT 장치 또는 MRI-CT 듀얼 영상 장치 분야의 조영제로 적용되는 경우, 높은 세포적 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가지므로, MRI 및/또는 CT용 조영제로 사용 시 강한 영상 신호를 유도하여 우수한 콘트라스트를 가지는 영상을 구현할 수 있다.
또한, 본 출원은 또한 나노 복합체의 제조 장치에 관한 것이다. 본 출원의 나노 복합체의 제조장치는 전술한 나노 복합체의 제조에 이용될 수 있으며, 따라서 상기 나노 복합체에서 설명한 내용과 중복되는 부분의 설명은 생략하기로 한다. 예시적인 본 출원의 나노 복합체의 제조 장치에 의하면, 간단하고 친환경적인 공정을 통하여, 연속적으로 전술한 나노 복합체를 제조할 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 출원의 나노 복합체의 제조 장치를 설명하며, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 출원의 나노 복합체의 제조 장치의 범위가 첨부된 도면에 의해 제한되는 것은 아니다.
도 2는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조장치를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2와 같이, 본 출원의 제조 장치는 방전부(10), 분무부(20) 및 추출부(30)를 포함한다.
상기 방전부(10)는, 스파크 방전에 의해 나노 입자를 발생시키기 위한 부분으로서, 소정 간격으로 이격 배치되어 간격을 형성하고 있으며, 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 한 쌍의 도전성 로드(11) 및 상기 도전성 로드(11)에 전압을 인가하는 전원부(12)를 포함한다.
상기 한 쌍의 도전성 로드(11)는 서로 이격 배치되어 간극(Gap)을 형성하고 있다. 예를 들면, 상기 방전부(10)에서는 스파크 방전이 일어나며, 상기 스파크 방전에 의해 상기 도전성 로드(11) 사이에서 국부적으로 발생되는 높은 온도에 의하여, 나노입자가 발생된다. 본 출원에서 사용되는 용어 「간극」또는 「간격」은 움직이거나 고정된 두 부품 사이의 틈을 의미하며, 예를 들어, 상기 간격은 각각 이격 배치 되어 있는 한 쌍의 도전성 로드(11) 사이의 틈을 의미한다.
상기 도전성 로드(11)를 구성하는 재료로는, 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재료라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 전술한 나노 복합체에서 설명한 코어에 존재하는 금속과 중복된 내용에 대해서는 생략하기로 한다.
상기 도전성 로드(11) 사이의 간격, 예를 들어, 상기 도전성 로드(11) 간 최단거리인 전극 갭(Electrode Gap)은, 그 거리가 작을수록 점화요구전압이 낮아지며, 그 거리가 커질수록 고전압이 요구된다. 또한, 전극 갭이 좁으면 스파크를 발생시키는데 필요한 전압은 감소하지만, 짧은 스파크는 혼합기에 점화 최소 에너지를 전달하여 실화를 일으킬 수 있으므로, 실험에 의해 적정 거리를 설정하는 것이 필요하다. 하나의 예시에서, 상기 전극 사이의 갭은, 0.1 내지 10 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전원부(12)는 상기 각각의 도전성 로드(11)에 전압을 인가하기 위한 부분으로서, 하나의 예시에서 상기 전원부(12)로부터 상기 도전성 로드(11)에 인가되는 전압은 2 내지 5 kV이고, 전류량은 0.5 내지 5 mA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 전원부(12)에서는 상기 한 쌍의 도전성 로드(11)에 인가되는 전압을 일정하게 조절할 수 있다. 이에 따라, 나노입자를 정량적으로 공급함으로써, 우수한 공급 안정성으로 나노입자를 제조할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 전원부(12)는, 상기 도전성 로드(11)에 고전압을 인가하기 위한 전기 회로를 포함할 수 있다. 상기 전기 회로는 고전압 공급원(HV), 외부 커패시터(C) 및 저항(R)으로 구성된 정전압원(Constant High Voltage Source) 구조를 가지며, 다수의 저항, 다수의 커패시터 및 회로전류의 고속 스위칭이 가능한 회로를 이용하여 나노입자의 크기를 조절할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방전부(10)는 소정 간격을 두고 이격 배치된 한 쌍의 전극(11)을 구비하며, 비록 도시되지는 않았지만, 캐리어 기체 공급 시스템(Carrier Air Supply System) 등의 기체 공급 장치와, MFC(Mass Flow Controller) 등의 유량계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 기체 공급 장치 및 유량계에 의해 비활성 기체 또는 질소가 반응 챔버(1)로 정량적으로 공급될 수 있다.
상기 도전성 로드(11)에 고전압을 인가하면 스파크 방전에 의해 상기 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재료가 기화 또는 입자화되어 상기 도전성 로드 사이의 간격을 통해 흐르는 비활성 기체, 산소 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 기체 흐름을 따라 후술할 분무부(20)로 유입될 수 있다. 예를 들어, 상기 방전부(10)의 도전성 로드(11)로 전압이 인가되면, 방전부(10)의 한 쌍의 도전성 로드(11) 사이의 간격에서 상기 금속이 기화되며, 비활성 기체 또는 질소 등의 캐리어 기체를 따라 이동한 기화된 금속은, 상기 간격을 벗어남에 따라, 응축되고, 이에 따라, 나노입자가 형성된다. 상기 비활성 기체로는 아르곤(Ar) 또는 헬륨(He) 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방전부(10)로부터 생성되는 나노 입자의 입경은, 인가전압, 주파수, 전류, 저항, 커패시턴스 값 등의 스파크 생성 조건; 상기 비활성 기체의 종류 및 유량; 분무부(20)에서의 용액 분사 속도; 또는 스파크 전극의 형상 등에 따라, 10 nm 내지 500 nm 범위 내로 조절될 수 있고, 예를 들면, 20 nm 내지 450 nm, 30 nm 내지 400 nm 또는 50 nm 내지 150 nm 범위 내로 조절될 수 있다.
상기 분무부(20)는, 상기 나노 입자에 생체적합성 고분자 용액을 분무하여 생체적합성 고분자를 상기 금속 입자에 부착시키기 위한 부분이다. 상기 생체적합성 고분자는, 전술한 나노 복합체에서 설명한 쉘에 존재하는 생체적합성 고분자와 중복된 내용에 대해서는 생략하기로 한다.
하나의 예시에서, 상기 분무부(20)는 분무 노즐(21)을 포함할 수 있다. 상기 분무 노즐(21)은 상부 분무 노즐 및 하부 분무 노즐로 구성될 수 있다. 상기 노즐의 입경은 특별히 제한되지 않으나, 0.1 내지 1.0 mm일 수 있다. 상기 분무부(20)에서는 상기 분무 노즐(21)을 통해 반응 챔버(1) 내로 상기 생체적합성 고분자를 포함하는 용액이 액적(Droplet) 형태로 분무되며, 이에 따라, 상기 방전부(10)에서 발생된 나노 입자는 상기 액적에 의하여 캡슐화될 수 있다.
상기 분무부(20)는 생체적합성 고분자와 용매를 혼합하여 용액을 제조하는 교반기(22)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 교반기(22)는 고속 교반이 가능한 장치면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 200 내지 4000 rpm이며, 초음파를 인가하여 교반이 가능한 장치라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 용매는 생체적합성 고분자를 액적 형태로 분무시키기 위하여 혼합되는 조성으로, 상기 생체적합성 고분자들과 상용성이 우수하다면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 디클로로메텐, 물, 희석초산, 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS) 및 오일일 수 있다.
본 출원의 제조 장치는, 용매 제거 수단(30)을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 용매 제거 수단(30)은 예를 들어, 추출 로(Furnace) 또는 건조 장치를 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 추출 로(30)는 나노 복합체의 액적으로부터 용매를 추출시키기 위한 부분이다. 비록 도시되어 있지 않지만, 상기 추출 로는 투입구 및 배출구를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추출 로는 추출 용매 상기 투입구를 통해 추출 로로 유입될 수 있고, 상기 배출구는 추출 용매에 의해 추출된 혼합물을 배출할 수 있다.
또한, 상기 추출 로(30)의 예로, 관형 흐름 반응기(Tubular Flow Reactor)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 분무부(20)에서 형성된 금속 입자를 포함하는 액적이 관형 흐름 반응기를 통과하면서 용매가 추출됨에 따라 나노 복합체로 형성될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 관형 흐름 반응기 내부는 50℃ 내지 150℃의 온도 범위 내로 유지될 수 있고, 상기 분무부(20)로부터 관형 흐름 반응기 내부로 유입되는 액적은 상기 관형 반응기를 통과하면서 용매가 추출될 수 있다.
본 출원의 제조 장치는 또한, 상기 추출부(30)를 통과한 나노 복합체를 수집하는 수집부(40)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 수집부(40)에서는 기판 또는 필터 등을 사용하여 나노 복합체를 포집할 수 있다. 상기 기판은 나노 복합체를 포집할 수 있는 기판이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 기판은 알루미늄 호일, 실리콘, 유리 또는 운모 등을 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 기판에는 입자 포집 효율을 증가시키기 위해, 전기장 또는 온도장이 인가될 수 있다. 예를 들면, 상기 전기장이 인가되는 경우, 입자와 기판 간의 전하가 반대가 되도록 유도되어 입자의 기판 부착력을 증가시킬 수 있고, 상기 온도장이 인가되는 경우, 입자와 기판간의 온도차가 유도되어 입자의 기판 부착력을 증가시킬 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방전부(10), 분무부(20) 및 용매 제거 수단(30)은 비활성 기체 또는 질소 분위기 하에서 유지될 수 있다. 상기 비활성 기체 또는 질소 분위기 하에서 유지된다는 것은 다른 의미로, 본 출원에 따른 나노 입자가 비활성 기체 또는 질소의 흐름에 따라 방전부(10), 분무부(20), 추출부(30)로 순차로 이동하는 것을 의미할 수 있다.
본 출원은 또한, 나노 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 출원의 나노 복합체의 제조방법은 전술한 나노 복합체의 제조장치를 이용하여 수행될 수 있으며, 따라서, 상기 나노 복합체 및 나노 복합체의 제조 장치에서 설명한 내용과 중복되는 부분의 설명은 생략하기로 한다. 예시적인 본 출원의 나노 복합체의 제조방법에 의하면, 간단하고 친환경적인 공정을 통하여, 연속적으로 나노 복합체를 제조할 수 있다.
도 3은 본 출원의 나노 복합체의 제조방법을 예시적으로 나타낸 도면이다. 도 3과 같이, 예시적인 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법은, 방전 단계, 분무 단계를 포함한다.
상기 방전 단계는, 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 한 쌍의 도전성 로드에 각각 전압을 인가하여, 스파크 방전시켜 나노 입자를 발생시키기 위한 단계로서, 하나의 예시에서, 상기 방전 단계에서는, 상기 전극에 스파크 방전 전압을 인가하여 전극 표면으로부터 금속 입자를 생성할 수 있다. 상기 스파크 방전 전압은 전극 간격, 인가전류, 정전용량 등에 의해 적절히 조절될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방전 단계에서, 예를 들어, 전극간의 간격이 1 mm 인 경우, 2.5 내지 3.5 kV의 전압을 인가 시 5000℃ 내외의 고열이 발생될 수 있으며, 이에 따라, 상기 전극을 구성하는 금속이 승화된 후, 상기 고열이 발생되는 간격을 벗어남에 따라, 상온으로 급속히 응축되면서 나노 입자가 형성될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 본 출원의 제조 방법은, 상기 전극 사이로 비활성 기체 또는 질소를 공급하는 기체 공급 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기체 공급 단계를 통해, 상기 비활성 기체 또는 질소가 공급되는 동시에, 상기 공급되는 비활성 기체 또는 질소의 흐름을 따라 상기 금속 입자가 후술할 캡슐화 단계 및 추출 단계로 이동할 수 있다.
상기 분무 단계는, 상기 방전 단계에서 형성된 나노 입자에 전술한 생체적합성 고분자를 포함하는 용액을 분무하는 단계이며, 상기 분무 단계에서, 상기 용액 내에 상기 나노 입자는 캡슐화될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 분무 단계는, 생체적합성 고분자를 용매와 혼합하는 혼합 단계를 포함할 수 있고, 상기 혼합 단계에서 제조된 용액은 상기 방전 단계에서 형성된 나노 입자를 캡슐화할 수 있다.
상기 혼합 단계에서, 상기 생체적합성 고분자 및 용매는 200 내지 4000 rpm 의 속도로 교반될 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 혼합 단계에서 혼합된 용액 내의 생체적합성 고분자의 부피 분율(Volume Fraction)은 전체 혼합 용액 100 부피에 대하여, 0.01 내지 50 부피일 수 있다.
상기 용매는 생체적합성 고분자를 액적 형태로 분무시키기 위하여 혼합되는 조성으로, 상기 생체적합성 고분자들과 상용성이 우수하다면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 디클로로메텐, 물, 희석초산, 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS) 및 오일일 수 있다.
도 3과 같이, 예시적인 본 출원의 나노 복합체의 제조 방법은, 추출 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 추출 단계에서, 용매 추출법 또는 건조를 통해 용매를 추출할 수 있다. 상기 용매를 추출함으로써, 상기 용매가 추출된 나노 복합체는 분말 형태로 존재할 수 있어 우수한 저장 안정성을 가질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 건조는 예를 들어, 60℃ 내지 250℃, 70℃ 내지 200℃ 또는 80℃ 내지 170℃의 온도 범위 내에서 수행될 수 있다. 상기 건조온도가 200℃를 초과하는 경우, 생체적합성 고분자가 변형 또는 분해될 수 있고, 상기 건조 온도가 60℃ 미만인 경우, 목적하는 용매가 충분히 제거되지 않을 수 있다.
또한, 본 출원의 제조 방법은 상기 분말 형태의 나노 복합체를 기판 또는 필터에 수집하는 수집 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 제조 방법에 있어서, 상기 방전 단계 및 분무 단계는 비활성 기체의 흐름 하에서 수행될 수 있다.
본 출원의 나노 복합체는, 우수한 저장 안정성, 유전자 전달 성능 및 낮은 세포 독성을 가져 인체 내 다양한 치료제로 사용가능하며, 높은 세포적 흡수성, 광 흡수성 및 우수한 포화 자화 특성을 가지므로, MRI 및/또는 CT용 조영제로 사용 시 강한 영상 신호를 유도하여 우수한 콘트라스트를 가지는 영상을 구현할 수 있다.
도 1은 본 출원의 나노 복합체의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 출원의 예시적인 나노 복합체의 제조장치를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 출원의 나노 복합체의 제조방법을 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 제조된 나노 복합체 및 및 비교예에서 제조된 나노 입자의 입자 크기 분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 비교예 2에서 제조된 금-철(Au-Fe) 나노 복합체의 X-선 분말회절 패턴을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 및 비교예에서 제조된 나노 복합체 및 나노 입자의 투과 전자 현미경 이미지이다.
도 7 내지 도 10은 각각 실시예에서 제조된 나노 복합체 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자의 푸리에 변환 적외선 분광 분석 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 실시예 1에서 제조된 나노 복합체와 pDNA의 복합물(PM Capped Au-Fe/pDNA complexes)의 겔 전기 영동 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예에서 제조된 나노 복합체 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자의 힐라 세포 내의 질량 농도에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
도 13은 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자 나노 입자의 유전자 전달 성능을 측정 결과이다.
도 14는, 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체 및 비교예 1의 생체적합성 고분자 나노입자의 형광 현미경 이미지이다.
도 15는 실시예 1 및 3에서 제조된 나노 복합체 샘플의 자화를 상온에서 진동형 샘플 자력계로 측정한 결과이다.
도 16은 실시예 3의 철 나노 복합체와 실시예 1의 금-철 나노 복합체의 팬텀의 MRI 영상과 질량 농도에 따른 이완성 기울기 그래프이다.
도 17은 실시예 2의 금 나노 복합체와 실시예 1의 금-철 나노 복합체의 팬텀의 CT 영상과 질량 농도에 따른 이완성 기울기 그래프이다.
이하 실시예 및 비교예를 통하여 상기 기술한 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
도 2의 장치를 이용하여 도 3의 방법에 따라, 도 1과 같은 형상을 가지는 나노 복합체를 제조하였다.
구체적으로, 도 3과 같이, 질소 가스를 방전부로 통과시켰다. 상기 질소가스의 유량은 질량 유량계(Mass Flow Controller, MFC)(Tylan, US)에 의해 3.0 L/min으로 유지하였으며, 상기 질소 가스를 금(Au) 로드 및 철(Fe) 로드(직경 3 mm, 길이 100 mm, Nilaco, Japan)로 이루어진 한 쌍의 전극 사이로 통과시켰다. 이 때, 한 쌍의 전극 사이의 간격은 1 mm로 하였고, 상기 전극에 전원을 인가하여 스파크 용발(Spark Ablation)에 의하여 금-철(Au-Fe) 복합 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 상기 스파크 용발을 위해 저항 0.5 MΩ, 전기 용량 1.0 nF, 전류 1.2 mA, 전압 2.6 kV, 진동수 380 Hz의 조건의 전원이 상기 전극에 인가되었다.
상기 스파크에 의해 발생된 금-철 복합 나노입자를 함유하는 질소 가스(순도 99.99% 초과)의 흐름은 분무부로 이동되어 생체적합성 고분자를 함유하는 용액을 분사하기 위한 작동 가스로 사용되었다. 구체적으로, 상기 생체적합성 고분자를 함유하는 용액은 0.2 g의 폴리(락트산-co-글리콜산)(Poly(lactic-co-glycolic acid)), PLGA)(Sigma-Aldrich, USA), 0.02 g의 프로타민 설페이트(Protamin Sulfate, Prot)(Sigma-Aldrich, USA)을 99.8 mL의 디클로로메텐(DCM, Sigma-Aldrich, USA) 용매에 용해시켜 제조된 제 1 용액과 폴리-l-리신(Sigma-Aldrich, USA)을 0.1 w/v%의 농도로 물에 용해시켜 제조된 제 2 용액 0.2 mL를 혼합하여 제조하였다. 상기 혼합 용액을 지름이 0.3 mm인 분출구를 가지는 분사 노즐을 통해 액적 형태로 분무하였으며, 구체적으로, 상기 금-철 복합 나노입자는 충돌 분무기의 오리피스를 통과하면서, 상기 분사된 액적과 혼합되어 금-철 복합 나노입자를 캡슐화 하여 하이브리드 액적을 형성하였다.
상기 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 복합 나노입자의 하이브리드 액적을 질소 가스의 흐름에 따라 온도가 90℃로 유지되는 관형 흐름 반응기(Tubular Flow Reactor)의 내부로 통과시키면서 상기 액적으로부터 다이클로로메텐을 추출하여 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)를 제조하였다. 상기 용매가 추출된 나노 복합체를 유리 기판(7059, Corning, US) 상에 수집하였다.
제조된 나노 복합체의 프랙탈 차원 값은 1.8로 계산되었다.
상기 완전한 증발 조건은, 액적의 증발에 요구되는 시간을 고려하고, 그것을 관형 흐름 반응기 내의 적절한 체류 시간과 비교하여 예측하였다. 증발하는 액적으로부터 증기로 기체를 포화시키기 위한 특성 시간은 하기 일반식 2 및 일반식 3를 통하여 계산하였다.
[일반식 2]
Figure 112016128767046-pat00003
상기 일반식 2에서, τ는 증발하는 액적으로부터 증기로 기체를 포화시키는 시간이고, Dd는 액적의 직경이며, σv는 증기 확산계수이고, C(Dd)는 액적의 수 농도이다.
[일반식 3]
Figure 112016128767046-pat00004
상기 일반식 3에서, ρs 및 ρp는 각각 용매 및 고체 입자의 농도이고, w는 액체 내 고체의 분율이다.
실시예 2
금(Au) 로드 및 철(Fe) 로드로 이루어진 한 쌍의 전극 대신에, 한 쌍의 금(Au) 로드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노 복합체(Au@PM)를 제조하였다.
제조된 나노 복합체의 프랙탈 차원 값은 2.3으로 계산되었다.
실시예 3
(Au) 로드 및 철(Fe) 로드로 이루어진 한 쌍의 전극 대신에, 한 쌍의 철(Fe) 로드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 생체적합성 고분자로 캡슐화된 철 나노 복합체(Fe@PM)를 제조하였다.
제조된 나노 복합체의 프랙탈 차원 값은 1.6으로 계산되었다.
비교예 1
방전부에서 금속 나노 입자를 발생시키는 단계를 수행하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 생체적합성 고분자 나노 입자(PM)를 제조하였다.
제조된 나노 입자의 프랙탈 차원 값은 3.0으로 계산되었다.
비교예 2
분무부에서 생체적합성 고분자를 함유하는 용액을 분사하는 것을 수행하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 캡슐화 되지 않은 금-철(Au-Fe) 복합 나노 입자를 제조하였다.
제조된 나노 입자의 프랙탈 차원 값은 1.6으로 계산되었다.
비교예 3
분무부에서 생체적합성 고분자를 함유하는 용액을 분사하는 것을 수행하지 않는 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 캡슐화 되지 않은 금(Au) 나노 입자를 제조하였다.
제조된 나노 입자의 프랙탈 차원 값은 2.4로 계산되었다.
비교예 4
분무부에서 생체적합성 고분자를 함유하는 용액을 분사하는 것을 수행하지 않는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 캡슐화 되지 않은 철(Fe) 나노 입자를 제조하였다.
제조된 나노 입자의 프랙탈 차원 값은 1.6으로 계산되었다.
실험예 - 다공성 나노 복합체 및 나노 입자의 특성 평가
<입자 크기 분포>
제조된 에어로졸 입자의 크기 분포는 정전 분류기(Electrostatic Classifier)(3080, TSI, US), 응축 미세입자 계수기(Ultrafine Condensation Particle Counter)(3776, TSI, US) 및 에어로졸 전하 중화기(Aerosol Charge neutralizer)(4530, HCT, Korea)로 구성된 이동성 입자 주사 정립기(Scanning Mobility Particle Sizer, SMPS)를 사용하여 측정하였다. 이동성 등가 입경(Mobility Equivalent Diameter)을 측정하기 위하여 사용된 SMPS 시스템은 0.3 L/min의 샘플 유량, 1.0 L/min의 시스 유량(Sheath Flow) 및 135초의 주사 시간(Scan Time) 동안 작동시켰다(측정 범위: 7.91 내지 333.8 nm). 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 46 내지 180 kV의 가속 전압 범위에서 얻었다. TEM 검사를 위해 샘플은 나노 입자 수집기(Nano Particle Collector)(NPC-10, HCT, Korea)를 사용하여, 0.5 L/min의 샘플 유량 및 5 kV의 작동 전압에서 직접 정전 기상 샘플링(Direct Electrostatic Gas-phase Sampling)에 의해 제조되었다. 적외선 분광기(IR) 분석을 위하여 샘플들은 기공 크기가 0.2 ㎛이고 직경이 47 mm인 폴리테트라플루오로에틸렌 배지 기질(Media Substrate)(11807-47-N, Sartorius, Germany)을 이용하여 물리적 여과, 예를 들어, 주로 기질의 표면 상의 입자의 확산에 의한 기계적 여과에 의해 준비되었다. 흡광도 모드에서 4000 내지 400 cm-1의 범위의 샘플에 대한 스펙트럼을 얻었다. 샘플들은 또한 Lakeshore 7404 진동형 시료 자력계(Vibrating Sample Magnetometer, VSM, USA)을 통한 자력의 측정에 의해 특징지어졌다. 샘플과 유전자 복합체(Sample-Gene Complexes)의 제타 포텐셜(Zeta Potential)은 제타 포텐셜 분석기(Nano ZS-90, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 결정되었다. 상기 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체(PM-Capped Metal Nanoagglomerates)는 유전자와 혼합되었고, 30분 동안 실온에서 배양되었다. 이후, 상기 복합체를 이중 탈이온수에 적당한 농도로 희석하였다. 제타 포텐셜 측정은 25℃에서 수행되었고, 제조업체에서 제공된 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
< 아가로스 겔 지연 분석( Agarose Gel Retardation Assay)>
상이한 중량비 하에서 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 유전자 응축 능력이, 0.5 ?g/mL의 브롬화 에티듐(Ethidium Bromide)를 함유하는 트리스-아세테이트-에틸렌디아민테트라아세트산 완충액(트리스(Tris) 242 g, 빙초산 57.1 mL 및 에틸렌디아민테트라아세트산 0.5 mM, pH 8.0)을 사용하여 1% 아가로스 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 실시예의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체 및 유전자를 상이한 중량비로 함유하는 복합체는, 혼합, 볼텍싱(Voltexing), 및 30분 동안 실온에서 배양하여 제조되었다. 상기 각각의 복합체 약 100 ng을 아가로스 겔에 채웠다. 청색 염료를 채운 겔(New England BioLabs, USA)은 각 웰(Well)에 첨가되었고, 아가로스 겔 전기영동은 50분 동안 80 V의 정전압에서 수행되었다. 그 다음, 생성된 겔의 유전자 밴드는 365 nm의 파장에서 자외선 투과 발광기(Ultraviolet Transilluminator) 하에서 가시화되었다.
< 인비트로 컴퓨터 단층촬영(Computed Tomography , CT) 및 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)>
대비되는 강화 효과를 평가하기 위하여, 상이한 질량 농도의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 수분산 물이 4.7 T 소동물 MRI 스캐너(Small Animal MRI Scanner)(Bruker)로 평가되었다. T2-가중 이미징(T2-Weighted Imaging)은 8 ms의 TE, 0.5 mm의 슬라이스 두께, 3×3 cm의 관측시야(Field of View) 및 128×128의 매트릭스 크기로, 반전 회복 그래디언트 에코 시퀀스(Inversion Recovery Sequence)를 사용하여 수행되었다.
CT 스캔은 0.625 mm의 슬라이스 두께로 100 kV 및 80 mA에서 작동되는 GE Light Speed VCT 이미징 시스템(GE Medical Systems)을 사용하여 수행되었다. 상이한 질량 농도의 분산물은 2.0 mL의 에펜도르프 튜브(Eppendorf Tubes) 내에서 제조되었으며, 자체 설계된 스캐닝 홀더(Self-Designed Scanning Holder)에 위치되었다. 감 샘플에 대하여 대비되는 강화가 하우스필드 단위(Hounsfield Units)로 결정되었다.
< 인비트로 세포 독성 및 형질 주입( Transfection )>
생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 세포독성은 MTS 분석에 의해, HEK 293 세포를 사용하여 평가되었다. 상기 세포는 37℃, 5%의 CO2 및 95%의 상대 습도에서 10%의 소태아혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM Carlsbad, USA) 200 mL에서 배양되었다. 상기 세포는 96-웰 미량정량판(96-Well Microtiter Plate)(Nunc, Germany)에 1×105 cell/well의 밀도로 뿌려졌다. 24시간 후, 배양 배지는 1 mg/mL의 실시예의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체를 함유하는 혈청 보충 배양 배지(Serum Supplemented Culture Media)로 교체되었고, 세포는 24시간 동안 배양되었다. 그 후, 30 ㎕의 MTS 시약은 각 웰에 첨가되었다. 세포는 추가로 2 시간 동안 배양되었다. 이 후, 흡광도는 490 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)(Spectra Plus, TECAN, Switzerland)를 사용하여 측정되었다. 세포 생존율(%)은 실시예의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체가 없는 배지 내의 비처리된 비교 세포와 비교하였고, 하기 일반식 4에 의하여 계산되었다.
[일반식 4]
[A]test = [A]control×100%
상기 일반식 4에서, 상기 [A]test는 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체가 있는 웰의 흡광도이고, [A]control은 비교 웰들의 흡광도이다.
실시예의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 HEK 93 세포의 형질 주입 성능은 반딧불이 발광효소(Firefly Luciferase) 및 GFP 유전자를 포함하는 pDNA를 사용하여 측정되었다. 세포는 10%의 FBS를 함유하는 RMPI 1640 배지(Gifco, USA)의 24-웰 플레이트(24-Well Plate)에 1×106 cell/well의 밀도로 뿌려졌고, 형질 주입(Transfection) 이전에 80%의 융합에 도달하도록 성장시켰다. 상기 형질 주입 전, 배지는 10%의 FBS를 함유하는 새로운 배지로 교환되었다. 세포는 37℃에서 4시간 동안 2 ㎍의 pDNA를 함유하는 실시예의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체 용액으로 처리되었고, 최종 부피는 배지에 의하여 500 ㎕로 조절되었다. 10%의 FBS의 새로운 배지로 교환한 후, 세포는 48시간동안 더 배향되었다. 이 후, 성장 배지는 제거되었고, 세포는 200 ㎕의 Reporter Lysis Buffer(Promega, USA)에 실온에서 30분 동안 교반되었다. 용해물(Lysates)은 튜브로 이동되었고, 5분 동안 13,000 rpm에서 원심 분리되었다. 발광효소 활성(Luciferase Activity)은 루미노미터(Luminometer)(TD-20/20, Promega, USA)로 측정되었다. 총 단백질은 BCA 단백질 분석 키트(BCA Protein Assay Kit)(ThermoFisher Scientific, USA)에 의하여 결정되었다. 최종 발광효소 활성은 상대 발광 단위 (RLU)/mg 단백질로 나타내었다. 역 형광 현미경(Inverted Fluorescent Microscope)(Nikon Eclipse TE2000-S, Japan)은 293 세포에서 실시예의 나노 복합체의 GFP 발현을 관찰하기 위하여 사용되었다.
모든 실험은 3회 수행되었고, 그 결과는 평균 및 표준 편차로 보고되었다. 통계 분석은 스튜던트 테스트(Student's T-Test)를 사용하여 수행되었다. 차이는 p<0.05에서 유의한 것으로 고려되었다.
측정 결과 및 분석
평균 입경, 표준 편차(Standard Deviation, SD) 및 수 농도를 확인하기 위하여, 제조된 에어로졸 상태의 입자 크기 분포(Particle Size Distribution)를 이동성 입자 주사 정립기(Scanning Mobility Particle Sizer, SMPS)(3936, TSI, Shoreview, MN, USA)를 사용하여 분석하였다.
도 4는 실시예 제조된 나노 복합체 및 비교예에서 제조된 나노 입자의 입자 크기 분포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
또한, 실시예 및 비교예에서 제조된 나노 복합체와 나노 입자의 평균 입경, 표준 편차 및 수 농도의 측정결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 평균 입경(nm) 표준 편차(-) 수 농도(cm-3)
실시예 1(Au-Fe@PM) 122.1 1.66 1.95×107
실시예 2(Au@PM) 107.3 1.69 2.30×107
실시예 3(Fe@PM) 126.1 1.67 1.99×107
비교예 1(PM) 105.2 1.77 2.06×107
비교예 2(Au-Fe) 26.8 1.49 2.00×107
비교예 3(Au) 21.4 1.46 1.94×107
비교예 4(Fe) 18.3 1.40 1.10×107
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노입자(Au@PM)의 평균 입경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 107.3 nm, 1.69 및 2.30×107 cm- 3로 측정되었으며, 비교예 3의 은 나노입자의 평균 입경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 21.4 nm, 1.46 및 1.94×107 cm-3이었으며, 비교예 1의 개별 생체적합성 고분자 입자의 평균 입경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 105.2 nm, 1.77 및 2.06×107 cm-3로 측정되었다.
비교예 1의 생체적합성 고분자로만 이루어진 나노 입자와 실시예 2에서 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노입자(Au@PM)의 유사한 크기는, 충돌 분무기(Collison Atomizer) 내 오리피스(Orifice) 근처에서의 생체적합성 고분자 포함하는 액적과 금 입자의 정량적 결합 때문이다. 상기 오리피스를 가로지르는 압력, 밀도 및 속도의 급격한 변화는 생체적합성 고분자 매트릭스 내로 금 입자가 재분배 가능한 자극(Impulse)을 생성할 수 있고, 그 결과 크기가 변화한다.
또한, 상기 표 1 및 도 4의 결과에서 보여지는 바와 같이, 단일 모드의 입자 크기의 분포는 금 입자들보다 생체적합성 고분자 입자들에 더 가까운 분포를 보이고, 이는 생체적합성 고분자 입자의 수 농도가 자가 조립된 모든 금 입자들을 캡슐화하기에 충분하다는 것을 의미한다. 생체적합성 고분자로 캡슐화된 입자의 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS)(Nano ZS90, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)측정을 추가로 수행되었다. 생기능성 측정을 수행하기 전에 기체 상 샘플 입자들은 유리판 상에 직접 도포되었다. 실험 결과, 모든 평가된 입자들의 모두 유체 역학적 직경의 편차가 5.3% 이하로 나타났으며, 1 내지 14일의 저장 기간동안 유의한 변화가 없었다. 이로부터 나노 입자들이 추가적인 실험을 보장하는 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
비록 도시되어 있지 않지만, 분말 회절 표준 연합 위원회(Joint Committee On Powder Diffraction Standards)의 데이터와 비교해보면, 38.2, 44.4, 64.6 및 77.5에서의 금 입자의 특성 밴드는 각각 금(Au) 결정질 면(Crystalline Facets)의 (111), (200), (220) 및 (311)으로부터의 회절 신호(Diffraction Signals)와 일치한다. 또한 철 입자의 경우, 43.5 및 50.6에서의 특성 밴드는 각각 γ-철(γ-Fe) 결정질 면의 (111) 및 (200)로부터의 회절 신호에 대응되었고, 반면에 44.44 및 64.8에서의 특성 밴드는 각각 α-철 면의 (110) 및 (200)의 회절 신호로부터 기인하였다.
도 5는 비교예 2에서 제조된 금-철(Au-Fe) 나노 복합체의 X-선 분말회절(D/MAX-2500, Rigaku, Japan) 패턴을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 금-철(Au-Fe) 나노 복합체의 경우 금(Au) 피크는 철(Fe) 피크가 겹쳐져 있으며, 이는 합금(Alloy) 대신 단순한 이원 금속 혼합물(Binary Metal Mixture)가 형성되었음을 의미한다.
리트벨트 분석법(Rietveld Refinement)을 이용하여 측정된 금-철 나노 복합체의 격자 파라미터(Lattice Parameter)는 0.39765 nm이었다. 분석 결과, 프로파일 인자(Profile Factor, Rp=7.43%) 및 가중 프로파일 인자(Weighted Profile Factor, Rwp=5.92%)의 유사 구성(Analogous Configuration)과 비슷하였고, 이는 현재 분석이 적절함을 암시한다.
도 6은 실시예 및 비교예에서 제조된 나노 복합체 및 나노 입자의 투과 전자 현미경 이미지이다.
도 6에 도시된 바와 같이, 에어로졸 경로(Aerosol Route)를 통한 생체적합성 고분자로 캡슐화된 나노 복합체의 형성을 이해하기 위해서, 탄소가 코팅된 구리 그리드 상에 준비된 실시예 및 비교예의 나노 복합체 및 나노 입자를 투과 전자 현미경(TEM, CM-100, FEI/Philips, Hillsboro, OR, USA)을 이용하여 분석하였다. 상기 나노 복합체 및 나노 입자들은 상업용 에어로졸 수집기(Aerosol Collector)(NPC-10, HCT, Icheon, South Korea)를 사용하여 그리드 상에 정전기적으로 증착되었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 투과 전자 현미경 이미지는 충돌 분무기 내에서 생체적합성 고분자 액적 내 주입된 금속 입자들은 여러 개의 1차 입자들로 구성된 응집체임을 보여주는 반면, 서로 잘 분리되어 있는 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자들은 구형이면서 매끄러운 표면을 가지는 것을 보여준다. 상기 금속 나노 응집체들은, 동일한 크기의 개별적 나노 결정보다 높은 세포적 흡수(금 나노 응집체의 경우)와 우수한 포화 자화(Saturation Magnetization)(철 나노 응집체 및 금-철 나노 응집체의 경우)를 유도할 수 있기 때문에, 본 출원에서 유용하게 사용되었다.
도 3과 같이 분무기의 오리피스 근처에서 금속 나노 응집체들이 생체적합성 고분자에 합쳐졌을 때, 나노 응집체들은 고분자 입자 내에 축적되는 경향이 있고, 이것은 금속 나노 입자 응집체들 간의 계면 장력(Interfacial Tension)에 비해 금속 나노 응집체와 고분자 사이의 계면 장력이 더 높기 때문이며, 이에 따라 고분자는 금속 나노 응집체를 캡슐화할 수 있다.
도 3을 참조하면, 가열된 관형 흐름 반응기(Tubular Flow Reactor)에서, 질소 기체의 온도는 폴리(락트산-co-글리콜산)의 유리전이 온도(약 50~60℃)보다 다소 높으며, 결과적으로, 입자들은 연화되고, 금속 나노 복합체에 대하여, 예를 들어, 더 이상 구형이 아닌, 비구형의 형상을 갖게된다.
또한, 금속 나노 입자 표면의 고분자 코팅은 금속 응집체의 1차 입자들(Primary particles) 사이의 빈 공간(Voids)의 모세관 힘(F cap = 2πDpγcosθ, 상기 Dp 및 γ는 각각 입자 직경 및 표면 장력이다.)에 기인한다. 또한 가열된 관형 반응기 내의 용매 추출 동안의 중성 정전기적 전하 및/또는 금속 입자 상의 전파 라디칼의 입자 간 종결(Interparticle Termination of Propagating Radicals)에 의하여 고분자와 금속 사이의 접합점이 형성될 수 있다.
또한, 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자(PM)의 평균 측면 치수(Average Lateral Dimension)는 109±5.2 nm 이었다. 실시예의 나노 복합체(Au@PM, Fe@PM 및 Au-Fe@PM) 샘플들의 유사 데이터는 각각 113±6.2, 134±8.2 및 124±7.6 nm이었으며, 이들은 도 4에 나타나는 에어로졸 상태의 샘플들의 측정된 값들과 비교되었다.
제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 나노 복합체의 수(n)는 샘플화된 질량이 동일할 때 그들의 크기에 의존하였다. 그러므로 실시예 2에서 제조된 나노 복합체(Au@PM)가 가장 많은 나노 복합체 수를 가졌으며, 하기의 일반식 5에 의해 계산될 수 있다.
[일반식 5]
Figure 112016128767046-pat00005
상기 일반식 5에서, mNA와 DNA는 각각 단위 질량(1 mg)과 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 평균 입경 크기를 나타내고, ρNA는 밀도(약 1.3 g/cm3)를 나타내며, 이는 이동성 입자 주사 정립기(Scanning Mobility Particle Sizer(SMPS), 3936, TSI, USA)에서 측정된 데이터과 미량천칭(Microbalance)(DV215CD, Ohaus, Greifensee, Switzerland)를 이용하여 실험적으로 측정된 데이터를 비교하여 계산된다. SMPS를 이용한 질량은 하기 일반식 6로 계산될 수 있다.
[일반식 6]
Figure 112016128767046-pat00006
상기 일반식 6에서, Q는 질소 가스의 유량, ts는 샘플링 시간, η(Dp)는 부분 집진율(Fractional Collection Efficienc), C(Dp)는 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 수 농도(The Number Concentration)이다. 실시예의 나노 복합체(Au@PM, Fe@PM 및 Au-Fe@PM)의 계산된 수는 각각 약 1.25×1012, 1.77×1012, 및 0.85×1012이였다. 분석적인 접근을 사용하여 상기 실시예에서 제조된 나노 복합체들의 표면적을 추가로 결정할 수 있고, 그 결과 각각 450.9 m2/g, 383.4 m2/g, 396.3 m2/g이었다.
도 7 내지 도 10은 각각 실시예에서 제조된 나노 복합체(Au@PM, Fe@PM 및 Au-Fe@PM) 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자(PM)의 푸리에 변환 적외선 분광 분석(FTIR, Nicolet 6700, Thermo Electron, Madison, WI, USA) 스펙트럼을 나타낸다.
도 7을 참조하면, 생체적합성 고분자 나노 입자(PM)의 흡수 모드 적외선(IR) 스펙트럼은 1087 cm-1 및 1187 cm-1의 주변에서 밴드를 나타내었고, 이는 C-O 신축(Stretch)에 해당한다. 또한, 1380 cm-1, 1389 cm-1, 1759 cm-1, 2946 cm-1, 및 2960 cm-1에서의 다른 밴드들은 각각 C-N 신축, CH-변각(Bend), C=O 에스테르, CH2-변각(Bend), 및 CH3-변각(Bend)에 해당되고, 이들의 피크는 PLGA의 백본(Backbone)으로부터 기인되었다. 생체적합성 고분자 매트릭스 내 프로타민 설페이트(Protamine)은, 각각 S=O의 대칭 및 비대칭 신축 진동(Stretching Vibrations)의 지표로 색인될 수 있는 약 1033 cm-1 및 1190 cm-1에서 밴드를 유도할 수 있다. 생체적합성 고분자 매트릭스 내 프로타민 설페이트과 폴리 1-리신(Lysine)은 1730 및 3400 cm-1에서 2 이상의 밴드를 더 유도하는데, 이는 각각 카보닐 에스테르-결합 신축(Carbonyl Ester-Combined Stretching)과 아민-히드록실기(Amine-Hydroxyl Groups)에 기인한 것이다.
도 8을 참조하면, 실시예 2에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노 복합체(Au@PM)는 생체적합성 고분자 나노 입자 단독의 IR 스펙트럼과 유사한 IR스펙트럼을 가졌다. 상당한 수의 S=O기 때문에, 실시예 2의 나노 복합체(Au@PM)가 1033 cm-1 및 1190 cm-1에서 상대적으로 강한 피크를 갖는 것이 명확하다. 상기 거동은, 도 10에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)에서도 나타나고 있으며, 이는 금과 생체적합성 고분자의 친화력, 특히, 생체적합성 고분자(PM) 내 프로타민 설페이트의 황(S) 사이의 친화력에서 비롯된 것일 수 있다.
또한, 도 9를 참조하면, 생체적합성 고분자로 캡슐화된 철 나노 복합체(Fe@PM)는 약화된 특성 고분자(PM) 피크를 나타냈으며, 또한 이로부터 금(Au)과 생체적합성 고분자 사이의 친화력이 더 좋다는 것을 입증하였다.
요컨대, 도 7 내지 10에서와 같이, 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 나노 복합체들의 변화된 스펙트럼은 금속 나노 응집체와 생체적합성 고분자 결합(PM Conjugation with the Metal Nanoagglomerates)의 증거를 제공하였다. 또한, 생체적합성 고분자(PM)의 존재는 나노 복합체가 DNA 결합능을 가져, 정전기적 인력을 통한 나노 복합체-유전자 복합물(Nanoagglomerate-Gene Complexes)을 형성할 수 있음을 시사한다.
또한, 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속과 유전자의 복합물의 제타 포텐셜(Zeta Potential)값을 제타 포텐셜 분석기(Nano ZS90, Malvern Instruments, UK)을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 1
(Au-Fe@PM)		 실시예 2
(Au@PM)		 실시예 3
(Fe@PM)		 비교예 1
(PM)
제타 포텐셜
(mV)		 26.1±3.6 28.3±3.6 14.6±3.4 25.4±3.6
상기 표 2를 참조하면, 상기 복합체들의 양전하는 나노 복합체가 세포 내로 유전자를 전달할 가능성이 가짐을 시사한다. 또한, 제타 포텐셜 값은 캡슐화된 금속의 종류에 따라 변화된다. 예를 들어, 실시예 2 및 3에서 제조된 나노 복합체(Au@PM 및 Fe@PM)는 각각 높고 및 낮은 값을 가졌으며, 이는 IR 스펙트럼의 피크 강도와 일치한다.
생기능성(Biofunctionality)을 측정하기 전에, 유리 기판에 샘플링된 복합체는 장기 보관을 위한 안정성을 확보하기 위해 초음파 수조(Bath) 내에서 분리되었다. 그 다음, 유전자 이송 시험을 위한 나노 복합체-유전자 복합물의 사용을 위하여, 상기 복합물의 형성을 확인하기 위하여 겔 전기 영동 분석(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) 실험이 수행되었다.
도 11은 실시예 1에서 제조된 나노 복합체와 pDNA의 복합물(PM Capped Au-Fe/pDNA Complexes)의 겔 전기 영동 분석 결과를 나타낸다.
도 11을 참조하면, 유전자에 대한 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 질량 비율의 적절한 범위를 조사하기 위하여, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0의 비율로 나노 복합체 및 유전자 결합 효율을 실험하였다. 구체적으로 도 11의 왼쪽으로부터 1번 라인은 pDNA를 나타내고, 2번 내지 6번 라인은 와 각각 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 비율(pDNA에 대한 나노복합체의 비율)로 혼합된 복합물을 나타낸다. 거의 모든 유전자들이 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체와 효율적으로 결합되기 때문에, 1.0 비율의 복합물(도 11의 4번 라인)을 유전자 전달 시험을 위하여 선택하였으며, 복합물로부터 유전자 분리(Gene Liberation)가 거의 나타나지 않음을 확인하였다.
생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체들의 생의학 분야(Biomedical Application)의 적용의 필수적인 특징은 그들이 반드시 생체적합성을 가져야 하는 것이기 때문에, 상기 나노 복합체의 세포 독성이 평가되었다. 도 12는 실시예에서 제조된 나노 복합체(Au@PM, Fe@PM 및 Au-Fe@PM) 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 이루어진 나노 입자(PM)의 힐라 세포 내의 질량 농도에 따른 세포 독성을 측정한 결과이다.
생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체의 세포 생존률의 측정은 5 내지 100 ㎍/mL의 상이한 질량 농도에서 293 인간배아신장세포(293 Human Embryonic Kidney Cells) 내의 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS) 분석을 이용하여 수행되었고, 비교예 1의 나노입자의 세포 생존률과 비교하였다.
도 12에 나타나듯이, 실시예 및 비교예에서 제조된 나노 복합체 및 나노 입자들의 세포 생존률은 98% 내지 103%로 측정되었고, 이는 실시예의 나노 복합체와 비교예의 나노 입자(99% 초과) 사이의 큰 차이가 없음을 확인하였다. 이것은 금속 나노 복합체의 결합이 생체적합성 고분자 입자의 세포 독성을 증가시키지 않음을 시사하며, 이에 따라 실시예에서 제조된 나노 복합체 샘플들과 함께 배양한 후에, 세포의 번식 능력에 큰 간섭이 없다는 증거를 제공하였다. 한편, 높은 질량 농도에서 나노 복합체의 다소 높은 세포 독성은 금속 표면(Metal Surfaces)과 세포 구획(Cellular Compartments) 사이의 상호 작용을 통한 손상에 의해 기인하였다. 구체적으로, 나노 복합체로부터의 촉매 산화 스트레스(Catalytic Oxidative Stress)를 통한 세포 내 유전자의 단일-가닥 절단(Single-Strand Breaks) 및/또는 효소 분해(Enzymatic Degradations)는 높은 질량 농도에서 약간 증가된 세포 독성을 가졌다.
또한, 생체적합성 고분자로 캡슐화된 나노 복합체의 유전자 전달 성능은 녹색 형광 단백질(GFP)의 루미네선스 측정에 의해 평가되었다. 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체 및 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자의 복합물의 결과와 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자 나노입자와 GFP 유전자의 복합물로부터의 결과를 비교하였다.
도 13은 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 응집체 및 비교예 1에서 제조된 생체적합성 고분자 나노 입자의 유전자 전달 성능을 측정 결과이고, 단백질 1 mg 당 상대 발광 단위(RLU)로 나타내었다.
비교 목적으로, 대조군으로서의 순수 DNA(Naked-DNA) 의 유전자 전달 성능이 먼저 시도되었고, 그 결과 293 인간배아신장세포 내에서 GFP 형광의 강도는 약 1.1×104 RLU/mg에 도달하였다. 생체적합성 고분자 나노 입자(PM)의 경우 0.21×107 RLU/mg로 측정되었고, 실시예에서 제조된 나노 복합체는 0.23×107 RLU/mg 이상으로 측정되었으며, 구체적으로, 실시예 2에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노 복합체(Au@PM)의 경우 1.5×107 RLU/mg로 측정되었고, 실시예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 경우 0.32×107 RLU/mg로 측정되었다. 즉, 생체적합성 고분자 나노 입자(PM) 및 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체를 사용함에 의하여 유전자 전달 성능이 향상되었으며, 즉, 세포 내 형질 주입이 달성되었으며, 모든 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체는 더 우수한 전달 성능을 나타내었다. 이와 같은 결과는, 구형상 구조(Spherical Structure)의 금속 입자들이 응집된 비구형의 금속 백본(Backbone)을 따라 고분자가 캡슐화되어 형성된 비구형의 헤어리 구조(Hairy Structure)로의 생체적합성 고분자의 구조적 변화에 기인하고, 상기 헤어리 구조가 GFP 유전자와의 효과적인 결합을 위한 더 큰 기능적 표면을 제공할 수 있기 때문이다.
도 14는, 실시예에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체(Au@PM, Fe@PM 및 Au-Fe@PM) 및 비교예 1의 생체적합성 고분자 나노입자(PM)의 형광 현미경 이미지이다.
도 13 및 도 14에 나타나듯이, 대응하는 형광 현미경 이미지로부터 나노 복합체 및 생체적합성 입자 간의 유전자 전달 성능의 차이를 확인하였다. 실시예 2에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노 복합체(Au@PM)는 높은 효율을 입증하였으며, 이는 금이 다른 물질보다 기능화된 또는 표적화된 리간드, 즉, 루시페라아제와 복합체 사이의 높은 친화력을 포함하는 리간드와 쉽게 결합시킬 수 있기 때문이다. 또한, 실시예 2에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금 나노 복합체(Au@PM)는 약 110 nm의 가장 작은 측면 치수(Lateral Dimension)을 가지기 때문에, 가장 넓은 표면적(450.9 m2/g)을 가진다. 상기 내용은 하기 표 3의 동적 광 산란(DLS) 측정 결과가 뒷받침한다. 표 3은 실시예의 나노 복합체와 유전자의 복합물 및 비교예의 나노입자와 유전자의 복합물의 DLS측정 결과를 나타낸다.
실시예 1
(Au-Fe@PM)		 실시예 2
(Au@PM)		 실시예 3
(Fe@PM)		 비교예 1
(PM)
입자 크기
(Size)		 128.9±4.9 120.6±5.5 144.6±6.2 115.2±7.3
또한, 이전의 한 연구에서 실제로 금 응집체와 고분자가 결합된 나노 복합체가 결합되지 않은 고분자 입자에 비해 COS-7 원숭이 신장세포에 약 6배 많은 유전자를 전달할 수 있음이 보고된 바 있다. 이러한 현상이 보여지는 이유는 개별적인 금 나노 결정으로 만들어진 응집체가 단일 나노 결정이 세포막과 상호작용하는 응집체의 끝(Tip of the Agglomerate) 또는 더 많은 금 나노 결정들이 막과 상호 작용하는 가장자리(Edge)들 중 하나의 세포 표면 수용체(Cell Surface Receptor)와 상호 작용할 수 있기 때문이고, 이는 나노 복합체의 인터널리제이션(Internalization)의 속도와 양에 영향을 줄 수 있다.
추가로, 상기 동적 광 산란(DSL) 측정이 인산 완충 용액(pH.7.4)에서 순수한 금-철을 함유하는 실시예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 나노복합체(Au-Fe@PM)의 콜로이드 안정성을 평가하기 위하여 사용되었다. 구체적으로, 비교예 2에서 제조된 캡슐화되지 않은 금-철(Au-Fe) 복합 나노 입자는 4시간 이내에서 약 600 nm에 도달한 반면, 실시예 1에서 제조된 생체적합성 고분자로 캡슐화된 나노 복합체들은 입자 크기가 2.5일 까지 200 nm 미만으로 현저하게 안정하였다. 이는 표 2와 같이, 상기 나노 복합체의 양의 제타 포텐셜, 즉, 단극(Unipolar) 포텐셜 때문이다.
도 15는 실시예 1 및 3에서 제조된 나노 복합체 샘플의 자화(Magnetization)를 상온에서 진동형 샘플 자력계(Vibrating Sample Magnetometer, VSM)로 측정한 결과이다.
도 15를 참조하면, 측정한 실시예 1 및 3에서 제조된 나노 복합체(Au-Fe@PM, Fe@PM)는 자성을 보이며, 이는 그들이 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체로 형성된 후에 소프트한 강자성 거동을 보이는 것을 나타낸다. 실시예 1에서 제조된 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 금 및 철의 비율은 각각 0.415 및 0.585이였으며, 상기 비율은 유도 결합 플라즈마 발광 광도법(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy)(Optima 8300, PerkinElmer, USA)과 에너지 분산 X-선 분광법(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy)(EX- 350, Horiba, Japan)을 이용하여 측정하였다.
실시예 3의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 철 나노 복합체(Fe@PM) 및 실시예 1의 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)는 각각 약 26.1emu/g 및 14.9emu/g(Electromagnetic Units Per Gram of Iron)의 포화 자화(Saturation Magnetization, Ms)값을 가졌으며, 또한, 각각 49Oe 및 40Oe의 항자기력(Coercivities)을 가졌다. 이 값은 캡슐화되지 않은 금-철 나노 입자(86.4 emu/g)보다 작은 값이고, 이러한 차이는 조성에 기인하였다.
실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 측정된 포화 자화값이 실시예 3의 철 나노 복합체(Fe@PM)보다 낮게 측정되었고, 이러한 이유는 금이 반자성 물질이기 때문이다. 따라서, 철과 금 사이의 입자간 결합은 나노 복합체의 자기적 성질을 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 낮은 자화는 부분적으로 합금된 금-철(Partially Alloyed Au-Fe)의 미보상된 표면 스핀(Uncompensated Surface Spins)의 존재에 따라 반강자성 정렬된 코어(Antiferromagnetic Ordered Core)에 의해 설명될 수 있다.
상기 자기적 특성을 측정한 후, 표준 MRI 및 CT 영상 장치를 이용하여 실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 듀얼 모드 이미징 성능(Dual-mode Imaging Performance)을 평가하였고, 그 결과를 도 16 및 17에 도시하였다.
도 16은 실시예 3의 철 나노 복합체(Fe@PM)와 실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 팬텀의 MRI 영상(삽화)과 질량 농도에 따른 이완성 기울기(Relaxivity Plot) 그래프이다.
도 17은 실시예 2의 금 나노 복합체(Au@PM)와 실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 팬텀의 CT 영상(삽화)과 질량 농도에 따른 이완성 기울기(Relaxivity Plot) 그래프이다.
도 16 및 17을 참조하면, 팬텀(Phantom)의 MR 및 CT 영상은 실시예 2의 금 나노 복합체(Au@PM) 또는 실시예 3의 철 나노 복합체(Fe@PM)와 비교하여 실시예 1의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 다양한 농도(MRI 의 경우, 0.08 내지 1.00 Fe mM, CT의 경우 0.5 내지 6.0 mg/mL)에서 측정되었다.
도 16의, 팬텀의 MRI 영상(삽화)는 철 농도가 증가할수록 팬텀 내의 음의 콘트라스트가 증가하는 것을 보여주었고, 또한, 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM) 의 횡 이완도(Transverse Relaxivity)는 55.2 mM/Fe·s로, 이는 실시예 3의 철 나노 복합체(Fe@PM)의 횡 이완도(89.6 mM/Fe·s)보다 더 작으며, 이는 도 15의 자기적 특성과 일치한다. 또한, 도 17의 팬텀의 CT 영상(삽화)은, 나노 복합체가 존재할 때, 양의 콘트라스트가 증가되는 것을 보여준다.
또한, X-선 흡수 분석을 통해 실시예 1 및 실시예 2의 나노 복합체(Au-Fe@PM, Au@PM)의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 실시예 1의 6mg/mL 농도의 금-철 나노 복합체(Au-Fe@PM)의 경우, 194 HU로 측정되었고, 상기 값은 실시예 2의 금 나노 복합체(Au@PM)의 측정값(218 HU)과 크게 다르지 않았다.
상기와 같이, 생체적합성 고분자로 캡슐화된 금속 나노 복합체는 MRI 및 CT 영상 모두에 민감하게 작용하기 때문에, 상기 나노 복합체는 MRI-CT 듀얼 모드 영상 장치에 적용 가능하다.
10: 방전부
11: 도전성 로드
12: 전원부
20: 분무부
21: 분무 노즐
30: 용매 제거 수단
40: 수집부
100: 나노 복합체
110: 코어
120: 쉘

Claims (18)

  1. 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 금속 응집체를 포함하는 코어; 및
    상기 코어를 둘러싸고 있고, 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민 설페이트(Protamine Sulfate) 및 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine)을 포함하는 생체적합성 고분자 혼합물을 포함하는 쉘을 포함하고,
    프랙탈 차원 값이 1.6 내지 2.8인 나노 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 반자성체는 X-선 흡수성을 가지는 나노 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서, X-선 흡수성을 가지는 반자성체는 금(Au), 은(Ag), 비스무트(Bi), 및 탄탈륨(Ta) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 금속; 이들의 합금; 이들의 금속황화물; 또는 이들의 금속산화물을 포함하는 나노 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상자성 금속은 백금(Pt), 주석(Sn), 텅스텐(W), 몰리브덴(Mo), 알루미늄(Al), 망간(Mn), 팔라듐(Pd), 로듐(Rh), 루테늄(Ru), 지르코늄(Zr), 유로퓸(Eu) 및 디스프로슘(Dy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속을 포함하는 나노 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 강자성 금속은 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co) 및 가돌리늄(Gd)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 전이 금속을 포함하는 나노 복합체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 평균 직경이 10 내지 500 nm인 나노 복합체.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 나노 복합체를 포함하는 조영제 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 반자성체, 상자성 금속 및 강자성 금속으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 한 쌍의 도전성 로드에 각각 전압을 인가하여, 상기 도전성 로드로부터 금속 응집체를 발생시키는 방전 단계; 및
    상기 금속 응집체에 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 프로타민 설페이트(Protamine Sulfate) 및 폴리-l-라이신(Poly-l-lysine)을 포함하는 생체적합성 고분자 혼합물을 포함하는 용액을 분무하여 나노 복합체의 액적을 형성하는 캡슐화 단계를 포함하는 제1항의 나노 복합체의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 방전 단계 및 캡슐화 단계는 비활성 기체의 흐름 하에서 수행되는 나노 복합체의 제조 방법.


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KR101981740B1 (ko) * 2017-12-20 2019-08-28 한스바이오메드 주식회사 체내 삽입형 미립자 및 이의 제조방법
KR102460624B1 (ko) * 2020-09-22 2022-10-28 가톨릭대학교 산학협력단 제어 약물 방출 및 x-선 이미징이 가능한 약물 전달체 및 이의 용도
EP4257554A1 (en) * 2020-12-29 2023-10-11 ZTI Biosciences Co., Ltd. Iron oxide magnetic particles
WO2022145970A1 (ko) * 2020-12-29 2022-07-07 주식회사 지티아이바이오사이언스 산화철 자성 입자
CN115054689B (zh) * 2022-06-13 2023-06-30 哈尔滨工程大学 一种近红外光增强催化性能的铂锡双金属纳米粒子的制备方法
CN116445761A (zh) * 2023-03-01 2023-07-18 湖南大学 一种具有磁粒子成像性质的Pd基合金、MPI造影剂、制备方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100819378B1 (ko) * 2006-02-24 2008-04-04 (주)에이티젠 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체 및 이를포함하는 약제학적 조성물

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