KR101805873B1 - 단당류 인산 또는 그 유도체로 표면이 개질된 친수성 나노입자, 그의 콜로이드 용액 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단당류 인산 또는 그 유도체가 표면에 부착된 친수성 나노입자 조성물 및 이를 물에 분산시킨 콜로이드 용액 및 이를 포함한 자기공명영상 조영제(Magnetic Resonance Imaging contrast agent)에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 무기계 나노입자의 표면을 개질하여 생체적합적이고 우수한 수분산성을 갖는 나노입자를 제조 할 수 있다. 이렇게 제조된 나노입자는 자기공명영상조영제, 컴퓨터 단층촬영용 조영제등과 같은 생물영상분야, 양자점 발광소자 등의 나노-전자융합기술분야, 온열치료와 같은 생명-의학분야에 응용할 수 있고, 종래 기술들에 의하여 제조된 분산 안정화제에 의해 분산된 나노입자에 비해 우수한 분산 안정성 및 작은 크기의 수화직경을 갖는다.

Description

단당류 인산 또는 그 유도체로 표면이 개질된 친수성 나노입자, 그의 콜로이드 용액 및 그 용도 {A nanoparticles of surface-modified with monosaccharide phosphate or monosaccharide phosphate derivatives, its colloidal solution and use thereof}
본 발명은 단당류-인산 또는 그 유도체가 표면에 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물, 그의 콜로이드 용액 및 그 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 단당류 인산 또는 그 유도체로 표면이 개질된 무기계 나노입자가 포함된 조성물 및 이를 물에 분산시킨 콜로이드 용액 및 이를 포함한 자기공명영상 조영제(Magnetic Resonance Imaging contrast agent)에 관한 것이다.
나노입자는 생물영상기술, 의학 분야, 유전자 전달, 의약 전달, 질병의 진단 및 치료 등 다양한 분야에 응용되고 있다. 특히, 최근에는 나노입자를 이용하여 자기공명영상(MRI) 조영제, 세포수준의 치료, 온열치료, 약물전달, 핵산분리 등 수많은 생명-의학 분야에 사용되기 때문에 그 중요성이 강조되고 있다.
나노입자를 생명-의학 분야에 응용하기 위해서는 일차적으로 고품질의 나노입자가 확보되고, 이와 더불어 나노입자가 인체내에서 안정하게 유지되어야 하는 수분산안정성을 가져야 한다. 여기서 고품질 나노입자는 i) 입자 크기의 균일성, ii) 입자 크기 조절의 용이성, iii)입자의 우수한 결정성 등을 의미한다.
이러한 고품질의 나노입자를 인체 및 생명 과학 기술에 적용하여 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 모두 만족할 만한 결과를 나타내기 위해서는 응용분야의 특성에 맞는 나노입자를 선택해야 하고, 무엇보다도 나노입자를 분산성이 우수하고 생체친화적인 물질로 처리하는 기술이 갖추어져야 한다.
현재 상용화 되고 있는 나노입자의 경우 대부분 수계에서 pH를 조절하여 침전시키는 공침법 혹은 기상에서 나노입자를 합성하는 방법이다. 하지만 이와 같은 방법으로 나노입자를 합성한 경우에는 합성된 나노입자의 표면에 안정화제가 없기 때문에 뭉침이 심하고, 나노입자의 크기를 제어하기 어려우며, 균일한 크기의 나노입자의 제조가 용이하지 않은 단점이 있다.
따라서, 최근에는 유기 용매 내에서 무기계 전구체를 계면활성제와 함께 고온 열분해 하여 친유성 계면활성제가 표면에 부착되어 있는 나노입자를 합성하는 방법이 개발되고 있다. 이 방법은 나노입자의 크기 및 형상 조절에 유리하고, 합성된 나노입자는 그 크기가 매우 균일하고, 결정성이 우수하여 뭉침이 없는 장점이 있다. 하지만, 합성된 나노입자는 표면에 소수성을 갖는 계면활성제가 부착되어 있기 때문에 물에 분산되지 않고, 생체내에 이용이 어려운 단점이 있다. 따라서 이렇게 제조한 무기계 나노입자를 생체내에 이용하기 위해서는 친수성으로 표면을 개질해야한다. 소수성 나노입자를 친수성으로 표면을 개질하는 방법에는 크게 3가지 종류가 있다.
첫 번째는 리간드 교환 (ligand exchange) 방법으로서, 나노입자 표면에 결합할 수 있는 기능기를 갖는 리간드를 과량으로 넣어주어 계면활성제가 떨어져 나간 자리에 리간드를 부착 시키는 방법이다.
두 번째로는 캡슐화(encapsulation)방법으로서, 양친매성 리간드를 넣어서 양친매성 리간드의 소수성 부분은 나노입자의 계면활성제 부분으로 향하고 친수성 부분은 밖으로 나와 친수화가 되는 방법이다. 이 방법은 각각의 입자를 양친매성 물질로 둘러 싸야 하기 때문에 실험 조건이 까다롭고, 대량 생산이 어려운 단점이 있다.
세번째는 마이셀(micelle)방법으로서 소수성 나노입자가 분산된 용매 내에 마이셀을 만들어 나노입자가 마이셀에 들어가게 하는 방법이다. 이 방법은 한 개의 마이셀에 여러 개의 나노입자가 들어가게 되어 작은 수화직경을 갖는 친수성 나노입자를 제조하기가 어렵고, 생체 내에서 이온의 농도 및 혈류의 속도의 증감에 따라 마이셀이 파괴될 수 있는 단점이 있다.
따라서 최근에는 리간드 치환 방법을 이용하여 나노입자를 친수화 하는 많은 연구가 이루어지고 있다. 하지만 계면활성제가 결합되어 있는 나노입자의 표면에 리간드를 결합시킬 수 있는 작용기를 잘 선택하여야 한다. 주로 전하를 띨 수 있는 작용기가 나노입자 표면과 결합을 잘 하는데, 주로 아민 계열, 포스포릴 계열, 설파이드 계열, 카복실산계열 등이 있다.
일반적으로 친수화된 나노입자는 친수화물질의 특성에 따라 물에서의 분산안정성이 결정된다. 보통 단분자의 경우에는 분자의 전하에 의한 척력으로 나노입자가 응집되지 않고 수분산성이 유지되지만, pH가 변하게 되면 응집이 되는 단점이 있기 때문에 생체내에서의 분산 안정성이 우수하지 못하다. 이에 따라 상대적으로 분자량이 큰 리간드로 표면을 개질하여 반데르발스힘에 의한 나노입자의 친수화 방법이 연구 중이다. 하지만 분자량이 큰 리간드로 친수화 된 나노입자는 수화직경이 커지는 단점이 있고, 분자량이 커질수록 효과적인 리간드 교환 반응이 어렵다는 단점이 있다.
또한 통상적으로 생체 친화적인 ligand를 제조하기 위해서는 그 제조 공정이 매우 복잡하고 대량생산에 어려운 단점이 있다.
최근에 포스핀 옥사이드(phosphine oxide)와 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 고분자를 이용하여 이용하여 나노입자를 물에 분산시키는 방법이 Chem. Comm.( Hyon Bin Na, In Su Lee, Heonjin Seo, Yong Il Park, Jung Hee Lee, Sang-Wook Kim* and Taeghwan Hyeon " Versatile PEG-derivatized Phosphine Oxide Ligands for Water-Dispersible Metal Oxide Nanocrystals ," Chem. Comm. , 2007 , 5167)지에 발표된 바 있다. 메톡시 폴리에틸렌글리콜을 포스포릴 트라이클로라이드 (POCl3)를 반응시켜 PO-PEG리간드를 합성 한 후 유기용매내에 분산되어 있는 나노입자와 리간드 치환 반응 후 물에 분산시키는 방법이 공개되었다. 이 방법은 비교적 간단한 제조 방법을 이용하고 있으나, 리간드를 제조하는 방법에 있어서, 포스포릴 트라이클로라이드(POCl3)가 쉽게 산소와 만나 산화되기 때문에 아르곤이나 질소와 같은 비활성 분위기 상태에서 합성을 해야 하는 등의 공정상의 어려움이 있다. 또한 리간드 제조시 포스포릴기에 폴리에틸렌글리콜이 1개 ~ 3개가 붙기 때문에 재현성 있는 리간드 제조가 어렵다는 단점이 있다.
본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점을 극복하고 나노입자를 수계에 분산시키기 위하여 나노입자의 표면을 친수성으로 개질시킬 수 있는 분산 안정화제를 찾아냈으며, 이 분산안정화제가 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물을 생명-의학 분야등에 이용할 수 있음을 발견하게 되었다.
본 발명의 목적은 단당류 인산, 또는 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단당류 인산에 폴리에틸렌글리콜계 고분자 또는 아민기가 달려있는 알코올을 결합시킨 단당류 인산 유도체를 제공하고, 이 유도체가 표면에 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물을 물에 분산시킨 콜로이드 용액 및 그 콜로이드 용액을 포함하는 조영제를 제공하고, 그 조영제를 생체에 주입하여 이미징하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단당류인산 또는 단당류 인산 유도체가 물에 분산된 용액과 극성유기용매와 친유성 나노입자를 접촉시켜 나노입자 표면을 친수성 나노입자로 개질 시키는 공정을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라 본 발명은 무기계 나노입자를 생체 적합적이고 우수한 수분산성을 갖도록 하기 위하여 단당류 인산 혹은 이들의 유도체를 이용하여 표면이 분산 안정화되도록 개질된 나노입자를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 콜로이드 용액 및 상기 콜로이드 용액을 포함하는 조영제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 단당류 인산의 구조는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112011060195007-pat00001
상기 화학식 1은 인산기에 하나의 단당류가 결합되어 있는 것으로서, 본 발명에 따른 단당류는 탄소수 2 내지 9의 단당류를 포함한다, 구체적인 예로 다이하이드록시아세톤, 글리세르알데하이드, 에리두르로스, 에리트로스, 트레오스, 리불로스, 자일롤로스, 리보스, 아리비노스, 자일로스, 릭소스, 데옥시리보스, 프리코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스, 알로스, 알트로스, 글르코스, 마노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 푸코스, 푸쿨로스, 람노스, 세도헵툴로스, 뉴라민산등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서 단당류 인산은 바람직하기로는 Glucose 6-phosphate, Fructose 6-phosphate 또는 Mannose 6-phosphate의 형태인 것이다.
본 발명에 있어서 단당류 인산 유도체의 구조는 하기 화학식 2와 같다.
[화학식 2]
Figure 112011060195007-pat00002
상기 화학식 2에서,
X1은 단당류이다.
X2는 OH, 아미노 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 이다.
X3은 OH이다.
아미노알코올은 바람직하기로는 에탄올아민, 헵타미놀, 이소에타린, 노르에피네프린, 프로판올아민, 스핑고신에서 선택되는 하나 또는 둘이상이다.
폴리에틸렌글리콜은 바람직하기로는 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 아민기로 구성되어 있고, 분자량이 300 내지 5000이다.
본 발명에 있어서 나노 입자는 금속, 금속 칼코게나이드, 금속 산화물, 자성 물질, 자성 합금, 반도체 물질 또는 다성분 혼성 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이다.
본 발명에 있어서 바람직하기로는 금속은 Pd, Pt, Au, Cu 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 금속 칼코게나이드는 MXEY(M=Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zr, Mo, Ru, Rh, Ag, W, Re, Ta, Hf 및 Zn; E=O,S 또는 Se; 0<x≤ 3; 0<y≤5)에서 선택될 수 있고, 금속 산화물은 산화티타늄, 산화바나늄, 산화크롬, 산화망간, 산화철, 산화코발트, 산화니켈, 산화구리, 산화지르코늄, 산화몰리브덴, 산화루세늄, 산화로듐, 산화은, 산화텅스텐, 산화레늄, 산화탄탈륨, 산화하프늄 및 산화 아연에서 선택될 수 있다. 더 바람직하기로는 산화철은 FeO, Fe3O4(magnetite), α-Fe2O3, β-Fe2O3, γ-Fe2O3(maghemite), ε-Fe2O3, Fe(OH)2, Fe(OH)3, α-FeOOH, β-FeOOH, γ-FeOOH, δ-FeOOH, Fe5HO8·4H2O, 5Fe2O3·9H2O, FeOOH·4H2O, Fe8O8(OH)6(SO)·nH2O, Fe3 + 16O16(OH·SO4)12-13·10-12H2O 및 Fe3O4(magnetite)와 γ-Fe2O3(maghemite)의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 바람직하기로는 자성물질에는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4, MXOY(M또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr; 0<x≤3; 0<y≤5)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 자성 합금물질은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 반도체 물질은 2족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체, 3족 및 5족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체, 4족 원소로 이루어진 반도체, 4족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체 및 5족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 다성분 혼성 구조체는 금속, 금속칼코게나이드, 자성물질, 자성합금물질 및 반도체 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고 있으며, 코어-셸 또는 이종 접합 구조형태인 것을 포함할 수 있다.
상기 표면이 개질된 친수성 나노입자의 크기는 1nm 내지 200nm인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체가 부착된 친수성 나노입자를 포함하는 조성물이 물에 분산되어 있는 콜로이드 용액, 콜로이드용액을 포함하는 조영제 및 조영제를 생체내에 주입하여 이미징하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 산화철 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 단당류 인산은 바람직하기로는 Glucose 6-phosphate, Fructose 6-phosphate, Mannose 6-phosphate에서 선택된다. 단당류인산 유도체는 바람직하기로는 단당류인산의 인산기에 아미노 알콜, 또는 폴리에틸렌글리콜, 그 중에서도 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 아민기로 구성되어 있고, 분자량이 300 내지 50,000인 폴리에틸렌글리콜이 결합되어 있는 것이 더 바람직하다. 산화철은 여러 가지 산화철이 사용될 수 있으며, 그 중에서도 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 또는 이들이 혼합돼 있는 산화철이 바람직하다. 본 발명은 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 산화철 나노입자를 포함하는 조성물이 물에 분산되어 있는 콜로이드 용액을 제공한다. 이 콜로이드 수용액에 생체에 주사하기 위해 염화나트륨 용액, 덱스트로스주사액 등의 용제, pH를 조절하기 위한 완충제, 삼투압을 혈액에 맞추기 등장화제, 포도당 등의 무통화제 등 각종 주사제의 첨가제를 첨가하여 조영제를 제공하며, 이 조영제를 생체에 주입하여 이미징하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 단당류인산 혹은 단당류인산유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)산화철은 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 또는 이들이 혼합돼 있는 산화철이며, ii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter)과 산화철 코어 입자의 직경(Core diameter)의 크기 차이가 6nm 이하인 것을 특징으로 하는 콜로이드 용액 및 이 콜로이드를 포함하는 자기공명 영상 조영제를 제공한다.
본 발명은 또한 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체는 Glucose 6-phosphate 혹은 Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 것이며, ii) 산화철 코어의 크기는 2nm 내지 8nm 이며, iii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter, Dynamic Light Scattering으로 측정)은 2nm 내지 15nm인 것을 특징으로 하는 콜로이드 및 이 콜로이드를 포함하는 MRI T1 조영제를 제공한다.
본 발명은 또한 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)단당류 인산 유도체는 Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 것이며, ii) 산화철 코어의 크기는 7nm 내지 25nm 이며, iii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter, Dynamic Light Scattering으로 측정)은 7nm 내지 50nm인 것을 특징으로 하는 콜로이드 및 이 콜로이드를 포함하는 MRI T2 조영제를 제공한다.
본 발명은 또한 단당류인산 또는 단당류인산 유도체가 물에 분산된 용액과 극성유기용매와 친유성 나노입자 용액을 접촉시켜 나노입자 표면을 친수성으로 개질시키는 공정을 제공한다. 친유성 나노입자의 중심 입자는 금속, 금속 칼코게나이드, 금속 산화물, 자성 물질, 자성 합금, 반도체 물질 또는 다성분 혼성 구조체 이며, 바람직하기로는 산화철이다. 극성 유기 용매는 Tetrahydrofuran, Iso-propanol, n-propanol, Methanol, Ethanol, Dioxane, Dimethyl Sulfoxide, Dimethylformamide, Acetonitrile, Acetone, Acetic acid가 바람직 하다.
본 발명에 따르면, 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체로 무기계 나노입자의 표면을 친수성으로 개질하여 생체적합적이고 우수한 수분산성을 갖는 나노입자를 포함하는 조성물 및 그의 콜로이드를 쉽게 제조 할 수 있다. 이렇게 제조된 나노입자 조성물은 자기공명영상조영제, 컴퓨터 단층촬영용 조영제등과 같은 생물영상분야, 양자점 발광소자 등의 나노-전자융합기술분야, 온열치료와 같은 생명-의학분야에 응용할 수 있고, 종래의 분산 안정화제에 의해 분산된 나노입자 조성물에 비해 우수한 분산 안정성 및 작은 크기의 수화직경을 갖는다.
도 1은 n-Hexnae용매에 분산되어 있던 3nm 크기의 표면이 올레일산으로 부착된 산화철 나노입자의 투과전자 현미경(Transmission Electron microscopy, TEM)사진이다.
도 2는 실시예 1 방법으로 물에 분산시킨 3nm 크기의 산화철 나노입자의 TEM 사진이다.
도 3은 실시예 1, 2, 3 방법으로 물에 분산 시킨 산화철 나노입자의 수화직경을 분석한 것으로, 1은 3nm의 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 친수화 시킨 나노입자로 수화직경이 3.8nm이고, 2는 7nm의 산화철 나노입자를 Mannose 6 -phosphate로 친수화 시킨 나노입자로 수화직경이 8.7nm이고, 3은 10nm의 산화철 나노입자를 Fructose 6-phosphate로 친수화 시킨 나노입자로 수화직경이 11.3nm인 것을 나타내는 분석결과이다.
도 4는 실시 예 7-1의 rat in vivo 혈관 조영영상이다.
도 5는 실시 예 7-1의 rat in vivo 혈관 조영의 signal intensity를 signal to noise ratio로 나타낸 것이다.
도 6은 실시 예 8-1의 rat in vivo 혈관 조영 영상이다.
도 7은 실시 예 8-1의 rat in vivo 혈관 조영의 signal intensity를 signal to noise ratio로 나타낸 것으로서, 우심방, 하대정맥, 대동맥 등의 signal intensity를 보여주고 있다.
도 8은 실시 예 8-2의 rat in vivo 혈관 조영 영상이다.
도 9는 실시 예 8-2의 rat in vivo 혈관 조영의 signal intensity를 signal to noise ratio로 나타낸 것으로서, 우심방, 하대정맥, 대동맥 등의 signal intensity를 보여주고 있다.
도 10은 실시 예 8-3의 mouse in vivo MRI lymph node 조영 영상으로 주입 전(PRE)과 주입 1일 후(1Day)의 영상으로 상단 이미지는 mouse의 brachial lymph node이고, 하단 이미지는 mouse의 inguinal lymph node를 보여주고 있다.
도 11은 실시 예 8-3의 mouse in vivo lymph의 signal intensity를 signal to noise ratio로 나타낸 것으로서, Brachial과 Inguinal lymph node의 signal intensity의 변화를 보여주고 있다.
도 12는 실시 예 9의 mouse in vivo MRI lymph node 조영 영상으로 주입 전(PRE)과 주입 1일 후(1Day)의 영상으로 상단 이미지는 mouse의 brachial lymph node이고, 하단 이미지는 mouse의 inguinal lymph node를 보여주고 있다.
도 13은 실시 예 9의 mouse in vivo lymph의 signal intensity를 signal to noise ratio로 나타낸 것으로서, Brachial과 Inguinal lymph node의 signal intensity의 변화를 보여주고 있다.
도 14는 실시예 11의 MTT assay의 결과이다.
상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 설명함에 있어서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단된 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
본 발명은 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체 유도체가 나노입자의 표면에 부착되어 있는 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 단당류 인산은 바람직하기로는 Glucose 6-phosphate, Fructose 6-phosphate 또는 Mannose 6-phosphate의 형태인 것이고, 물에 분산되어 있을 수도 있다. 단당류 인산 유도체는 바람직하기로는 Glucose 6-phosphate, Fructose 6-phosphate 또는 Mannose 6-phosphate의 단당류 인산의 인산기에 수계 매질에 친화성을 가지는 폴리에틸렌글리콜계 생체적합성 고분자가 결합된 단당류 - Phosphate-폴리에틸렌글리콜 및 아민기가 달려있는 알코올을 결합시키는 단당류 - Phosphate - 아미노 알코올이 적합하다.
단당류 인산의 구조는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112011060195007-pat00003
상기 화학식 1은 인산기에 하나의 단당류가 결합되어 있는 것으로서, 본 발명에 따른 단당류는 탄소수 2 내지 9의 단당류를 포함한다, 구체적인 예로 다이하이드록시아세톤, 글리세르알데하이드, 에리두르로스, 에리트로스, 트레오스, 리불로스, 자일롤로스, 리보스, 아리비노스, 자일로스, 릭소스, 데옥시리보스, 프리코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스, 알로스, 알트로스, 글르코스, 마노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스, 푸코스, 푸쿨로스, 람노스, 세도헵툴로스, 뉴라민산등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또한 단당류위치에 다당류가 결합될 수 있는데, 다당류의 종류에는 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당 및 다당류로서, 구체적인 예로 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 투라노스, 셀로비오스, 라피노스, 멜레치토스, 말토트리오스, 아카보즈, 스태치즈, 프록토올리고당, 갈락토올리고당, 만난올리고당, 클루칸, 글리코겐, 아밀로스, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 말토덱스트린, 트럭탄, 마난, 갈락탄등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
단당류 인산유도체의 구조는 하기 화학식 2와 같다.
[화학식 2]
Figure 112011060195007-pat00004
상기 화학식 2에서,
X1은 단당류이고, 바람직하기로는 단당류는 Glucose, Fructose, mannose가 적합하다.
X2는 OH, 아미노 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 이다.
아미노알코올의 경우는 예를 들어 에탄올아민, 헵타미놀, 이소에타린, 노르에피네프린, 프로판올아민, 스핑고신을 포함한다.
폴리에틸렌글리콜은 (OCH2CH2)nOH, (OCH(CH3)CO)nOH 또는 (OCH2CO)nOH 이고, n은 1 내지 1200의 정수이다. 바람직하기로는 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 아민기로 구성되어 있고, 분자량이 300 내지 50,000인 것이 적합하다. 상기 단당류 인산에 유도체를 결합시키는 방법으로는 두 분자가 공유결합 될 수 있는 반응이라면 모두 사용 가능하다.
아미노알콜의 결합은 Phosphate group을 아미노 알코올의 아민기와 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)와 NHS (N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 포스포르아미데이트(phosphoramidate)결합시킴으로써 얻어 질 수 있다. 폴리 에틸렌 글리콜의 결합은 ethylene diamine(C2H8N2)을 phosphate group과 EDC와 NHS를 이용하여 공유 결합 시켜 단당류 phosphate ethylene diamine을 제조 한 후, 한쪽 말단이 카르복실기를 갖고 있는 폴리에틸렌글리콜과 EDC와 NHS를 이용하여 공유결합 시켜 형성하거나, 말단기에 amine기가 결합되어 있는 PEG와 단당류-phosphate을 EDC와 NHS를 이용하여 공유결합 시킴으로써 얻어 질 수 있다.
X3은 OH이다.
단당류- 인산 중 Glucose 6 phosphate는 해당과정에서 생성되는 물질로서 생체 내에 풍부하게 존재하기 때문에 생체에 적합하며, 다른 단당류 인산 및 단당류인산 유도체역시 생체적합성이 우수할 것이 기대된다.
나노 입자는 금속, 금속 칼코게나이드, 금속 산화물, 자성 물질, 자성 합금, 반도체 물질 또는 다성분 혼성 구조체 중에서 선택할 수 있다. 나노입자는 표면에 친유성 리간드가 부착되어 있을 수 있다. 예를 들면, 산화철의 경우 열분해법으로 합성되는 나노입자는 표면에 올레산으로 기인하는 유기물 및 합성용매로부터 기인되는 유기물, 침전제로부터 기인하는 유기물 등이 부착돼 있을 수 있다. 나노입자 표면에 부착돼 있는 유기물은 본 발명이 제공하는 방법에 의해 대부분 제거되며, 따라서, 친수성을 가지는 나노입자 조성물이 된다. 나노입자의 직경은 1nm 내지 200nm 이고, 바람직하게는 1nm 내지 50nm 이다.
금속 나노입자는 Pd, Pt, Au, Cu 및 Ag로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 금속 칼코게나이드는 MXEY(M=Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zr, Mo, Ru, Rh, Ag, W, Re, Ta, Hf 및 Zn; E=O, S 또는 Se 이며; 0<x≤ 3; 0<y≤5)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 금속 산화물은 산화티타늄, 산화바나늄, 산화크롬, 산화망간, 산화철, 산화코발트, 산화니켈, 산화구리, 산화지르코늄, 산화몰리브덴, 산화루세늄, 산화로듐, 산화은, 산화텅스텐, 산화레늄, 산화탄탈륨, 산화하프늄 및 산화 아연으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 금속 산화물의 산화철은 구체적인 예로서 FeO, Fe3O4(magnetite), α-Fe2O3, β-Fe2O3, γ-Fe2O3(maghemite), ε-Fe2O3, Fe(OH)2, Fe(OH)3, α-FeOOH, β-FeOOH, γ-FeOOH, δ-FeOOH, Fe5HO8·4H2O, 5Fe2O3·9H2O, FeOOH·4H2O, Fe8O8(OH)6(SO)·nH2O, Fe3+ 16O16(OH·SO4)12-13·10-12H2O 또는 Fe3O4(magnetite)와 γ-Fe2O3(maghemite)의 혼합물이 있다. 자성물질에는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, MM'2O4, MXOY(M 또는 M'=Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Cr; 0<x≤3; 0<y≤5)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 자성 합금물질은 CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 반도체 물질은 2족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체, 3족 및 5족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체, 4족 원소로 이루어진 반도체, 4족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 반도체 및 5족 및 6족에서 각각 선택된 원소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 다성분 혼성 구조체는 금속, 금속칼코게나이드, 자성물질, 자성합금물질 및 반도체 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고 있으며, 코어-셸 또는 이종 접합 구조형태인 것을 포함할 수 있다.
단당류인산 또는 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 나노입자를 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체가 용해돼 있는 용액, 나노입자 및 용매를 접촉시키는 것이다. 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체는 물에 녹아 있는 수용액을 사용할 수 있다. 나노입자는 친수성 혹은 친유성일 수 있으며, 그에 따라 물에 분산돼 있거나 혹은 유기용매에 분산돼 있을 수 있다. 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체, 나노입자가 용매 중에서 잘 접촉하도록 하기 위해서, 물에 친화적인 용매, 예를 들면, tetrahydrofuran, Iso-propanol, n-propanol, Methanol, Ethanol, Dioxane, Dimethyl Sulfoxide, Dimethylformamide, Acetonitrile, Acetone, Acetic acid 등의 극성 용매를 사용하는 것이 좋다. 나노입자의 표면은 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체에 의해 표면에 부착된 물질이 교환(리간드 교환)되는 것으로 보인다. 일부 단당류 혹은 단당류 유도체는 마이셀 형태로 나노입자를 둘러싸고 있을 수 있다.
본 발명은 단당류 인산 또는 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 산화철 나노입자를 포함하는 조성물이 물에 분산되어 있는 콜로이드 용액을 제공한다. 이 콜로이드 용액에 생체에 주사하기 위해 염화나트륨 용액, 덱스트로스주사액 등의 용제, pH를 조절하기 위한 완충제, 삼투압을 혈액에 맞추기 등장화제, 포도당 등의 무통화제 등 각종 주사제의 첨가제를 첨가하여 조영제를 제공하며, 이 조영제를 생체에 주입하여 이미징하는 방법을 제공한다. 생체에 주입하는 방법은 정맥주사, 경구 투여, 흡입 등이 있으며, 정맥주사 방법이 가장 바람직하다. 이미징하는 방법으로는 MRI(자기공명영상), 엑스레이, CT, PET, SPECT 등을 들 수 있으며, 이 중 MRI가 가장 바람직하다. MRI에 의한 조영에는 음조영(T2, darkening, 양조영(T1, Brightening) 등이 모두 가능하며, 사용하는 산화철의 크기 및 친수화된 조성물의 수평균 수화직경이 각각, 5nm, 15nm보다 작으면 양조영이 바람직하며, 사용하는 산화철의 크기 및 친수화된 조성물의 수평균 수화직경이 각각, 5nm, 15nm보다 크면 음조영이 더 바람직하다. 산화철 표면의 친수화 두께를 얇게 할 수 있으면, 산화철 코어 크기보다 약간 더 큰 크기의 친수화된 나노입자 조성물을 얻을 수 있기 때문에 수화직경을 정밀하게 제어할 수 있는 장점이 있다. 나노입자의 물에서의 장기안정성을 높이기 위해 입체방해(steric hindrance)와 전기적 반발(electrostatic repulsion)을 이용한다. 친수성 고분자를 사용하여 나노입자의 표면을 코팅 혹은 리간드 교환하는 방법이 널리 사용되고 있으나, 대부분 여러개의 입자를 함께 캡슐화 하기 때문에 수화직경이 커지며 개별 입자를 낱낱이 둘러 쌀 수 있는 방법이 극히 제한적이다. 단분자를 나노입자 표면에 부착시키면 수화직경은 작아 질 수 있으나, 물에서의 장기 안정성이 나빠진다. 더구나, 생체적합성이 우수한 친수화 물질은 더욱 더 제한된다. 따라서, 수화직경이 작으면서 장기안정성을 높일 수 있는 방법이 절실히 요구된다.
본 발명은 또한 단당류인산 혹은 단당류인산유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)산화철은 마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3) 또는 이들이 혼합돼 있는 산화철이며, ii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter)과 산화철 코어 입자의 직경(Core diameter)의 크기 차이가 6nm 이하인 것을 특징으로 하는 콜로이드 용액 및 이 콜로이드를 포함하는 자기공명 영상 조영제를 제공한다. 산화철 코어에 친수화물질을 부착시켜, 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter)과 산화철 코어 입자의 직경(Core diameter)의 크기 차이를 작게 하면, 결국 친수화된 나노입자 조성물의 수화직경이 작으며, 혈액 중 머무름 시간(blood retention time, 또는 BHL: blood half life)을 길게 할 수 있어서, 생체 조직에서의 산화철 조성물의 흡수, 분포, 대사, 배출 등을 길게 할 수 있다. 기존의 MRI 조영제인 Gd-complex(Magnevist-Bayer Schring사, Omniscan-GE Healthcare사)는 혈중 머무름 시간(BHL)이 수분 이하로 너무 짧고, 수화직경이 60nm 이상인 산화철계 조영제(Feridex-AMAG사, Resovist-Gayer Schering사)는 마크로파지(macrophage)에 의해 수십분 내에 간으로 운반되어 분포하는 특성이 있다. 그래서 친수화된 산화철 나노입자 조성물의 수화직경을 작게 하여 혈액 중 머무름 시간을 길게 하고, 생체 조직에서의 산화철 조성물의 흡수, 분포, 대사, 배출 등을 길게 할 수 있는 친수화 방법이 절실히 필요하다.
본 발명은 또한 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체는 Glucose 6-phosphate 혹은 Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 것이며, ii) 산화철 코어의 크기는 2nm 내지 8nm 이며, iii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter, Dynamic Light Scattering으로 측정)은 2nm 내지 15nm인 것을 특징으로 하는 콜로이드 및 이 콜로이드를 포함하는 MRI T1 조영제를 제공한다. 산화철 코어가 작으면, T2 이완률(r2)는 작아지며, T1 이완률(r1)은 커지기 때문에 결과적으로 r2/r1값이 감소하며, 음조영(T2) 효과가 작아져서 양조영(T1)이 가능하게 된다. 실시 예 10(in vitro MRI 시험)에서 보여 주고 있는 바와 같이, Glucose 6-phosphate 혹은 Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 코어 크기가 작은 친수화된 산화철 조성물은 콜로이드에서의 수화직경이 작았고, r1이 비교적 컸으며, r2가 비교적 작아, r2/r1은 작은 특징을 보여 준다. 이 콜로이드를 포함한 조영제를 랫드(rat)에 꼬리 정맥을 통해 주사하여 혈관을 자기공명 양조영해 본 결과 실시 예 7-1, 8-1, 8-2에 보여 주는 바와 같이 선명한 밝은 영상(양조영)을 얻을 수 있었다. 1시간 혹은 2시간까지는 혈관이 밝게 조영되다가 24시간 후에는 전혀 밝게 조영되지 않는 것으로 보아, 혈관내에 수시간 이상 체류하지만 하루 정도 지나면 혈관내에서는 완전히 배출되는 것으로 보인다. 따라서, 이 조영제를 사용하여 혈관을 이미징할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 또한 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물이 물에 분산된 콜로이드에 있어서, i)단당류 인산 유도체는 Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 것이며, ii) 산화철 코어의 크기는 7nm 내지 25nm 이며, iii) 친수성 조성물의 수평균 수화 직경(Hydrodynamic Diameter, Dynamic Light Scattering으로 측정)은 7nm 내지 50nm인 것을 특징으로 하는 콜로이드 및 이 콜로이드를 포함하는 MRI T2 조영제를 제공한다. 산화철 코어가 크며, T2 이완률(r2)는 급격히 커지며, T1 이완률(r1)은 약간 감소하기 때문에 결과적으로 r2/r1값이 매우 커지며, 음조영(T2) 효과가 커져서 음조영(T2)에 유리하게 되고, 사실상 양조영은 불가능해진다. 실시 예 10(in vitro MRI 시험)에서 보여 주고 있는 바와 같이, Glucose 6-phosphate에 에탄올아민 또는 폴리에틸렌글리콜이 부착된 코어 크기가 큰 친수화된 산화철 조성물은 r1이 비교적 작고, r2가 컸으며, r2/r1은 큰 특징을 보여 준다. 이 콜로이드를 포함한 조영제를 랫드(rat)에 꼬리 정맥을 통해 주사하여 자기공명 음조영해 본 결과 실시 예 8-3, 실시예 9에 보여 주는 바와 같이 하루가 지난 후에 림프절에서 강한 음조영(darkening)을 얻을 수 있었다. 따라서, 이 조영제를 사용하여 하루 정도 지난 후에 림프절과 같은 조직을 음조영(T2)으로 이미징할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 제공하는 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체가 표면에 부착된 친수성 산화철을 포함하는 조성물을 포함하는 콜로이드는 생체에 독성이 거의 없다. 세포독성 시험 결과 실시예 11에 나타낸 바와 같이, Glucose 6-phosphate로 안정화 시킨 10nm 산화철 나노입자(A), Glucose 6- phosphate - PEG 유도체로 안정화 시킨 10nm 산화철 나노입자(B), Glucose 6 phosphate-amino alcohol로 안정화 시킨 3nm 크기의 산화철 나노입자(C) 모두 200ppm까지 세포 생존에 영향을 주지 않는 것으로 나타나, 생체적합성이 매우 우수함을 알 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명하기로 한다.
[실시예 1] Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 산화철 나노입자를 포함하는 조성물
Oleic acid가 표면에 부착된 3nm크기의 산화철(Fe3O4)100mg을 8ml의 THF(Tetrahydrofuran)에 분산시킨 분산액과, 이 혼합액을 200mg의 Glucose 6-phosphate sodium salt를 2ml의 DIW(Distilled water)에 용해시킨 용액을 혼합하였다. 60℃에서 4시간 동안 교반, 반응 시킨 후 정치, 냉각시켰다. 상이 분리된 분산액의 상층인 THF층을 제거하여, 친수성 산화철을 포함하는 조성물을 얻었다. 이 조성물에 증류수를 첨가하여 콜로이드 용액을 제조하였다. 이 콜로이드는 상온에서 6달 동안 정치시켜 놓았으나, 탁도 변화가 없어서 장기안정성이 매우 우수하였다.
Malvern Zetasizer Nano ZS를 이용하여 콜로이드액 중의 나노입자 조성물의 수화직경을 측정한 결과 수화 직경이 3.8nm로 나타나서 core size의 크기와 비슷한 결과를 나타냈다. 6개월 후 수화직경을 측정한 결과 3.9nm로 나타났다.

[실시예 2] Mannose 6- Phosphate로 친수화시킨 산화철 나노입자를 포함하는 조성물의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 7nm 크기의 산화철 나노입자를 Mannose 6 -phosphate sodium salt를 이용하여 나노입자를 물에 분산시킨 후 Malvern Zetasizer Nano ZS를 이용하여 수화직경을 분석한 결과 8.7nm로 나타나서 core size의 크기와 비슷한 결과를 나타냈다.
[실시예 3] Fructose 6-phosphate로 친수화시킨 산화철 나노입자를 포함하는 조성물의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 10nm 크기의 산화철 나노입자를 Fructose 6- Phosphate sodium salt를 이용하여 나노입자를 물에 분산시킨 후 Malvern Zetasizer Nano ZS를 이용하여 수화직경을 분석한 결과 11.3nm로 나타나서 core size의 크기와 비슷한 결과를 나타냈다.
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[실시예 4] 폴리에틸렌글리콜이 결합된 Glucose 6-phosphate 유도체의 합성
[실시예 4-1] Phosphate-diethyl amine의 합성
Glucose 6-phosphate sodium salt 1g을 10ml의 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) buffer용액에 녹인 후 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 0.68g과 NHS (N-hydroxysuccinimide) 0.4g을 혼합 하여 30분간 유지 시킨 후 diethyl amine 0.23ml을 첨가하여 Glucose 6-phosphate-diethyl amine을 결합 시킨다.
[실시예 4-2] Glucose 6-phosphate-diethyl amine-PEG의 합성
메톡시 폴리에틸렌 글리콜 카르복실(mPEG-COOH, 5000) 17.75g을 40ml의 MES buffer용액에 분산 시킨 후 EDC 1.361g과 NHS 0.817g을 첨가한 후 30분간 교반 시킨다. 이 후 실시예 4-1에서 합성한 Glucose 6-phosphate-diethyl amine을 첨가한 후 1일간 교반 시킨 후 dialysis를 통해 미반응물질 및 부산물을 제거한 후 물을 제거한다.
[실시예 5] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate 유도체의 합성
Glucose 6-phosphate sodium salt 1g을 10ml의 MES buffer용액에 녹인 후 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) 0.68g과 NHS (N-hydroxysuccinimide) 0.4g을 혼합 하여 30분간 유지 시킨 후 에탄올아민(2-Aminoethanol) 0.22ml을 첨가하여 Glucose 6-phosphate amino alcohol을 제조한다.
[실시예 6] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate 유도체가 표면에 부착된 산화철 나노입자를 포함하는 조성물의 제조
실시예 4 및 실시예 5에서 제조한 Glucose 6-phosphate 유도체를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 나노입자 조성물을 제조하였다.
[실시예 7] 단당류 Phosphate로 친수화시킨 철 산화물 나노입자 콜로이드 용액의 체내 자기공명영상 측정
실시예 1, 2, 3 에 제시된 방법을 통해 물에 친수화 된 산화철 나노입자를 포함하는 조성물 및 그의 콜로이드 용액을 제조하여 수화직경을 Malvern Zeta sizer Nano ZS 장비를 이용하여 분석하였다.
단당류 인산으로 표면이 개질된 산화철 나노입자 콜로이드 용액과 비교예 1, 2 방법으로 친수화시킨 산화철 나노입자 콜로이드 용액의 수화직경을 하기 [표 1]에 나타내었다. 단당류 인산으로 표면이 개질된 친수화된 산화철 나노입자의 경우 core size와 수평균 수화직경과의 차이가 비교예 1,2 에 비하여 크지 않음을 보이고 있다.
산화철
Core
size		 친수화에 사용된 물질 수화직경;
(부피평균)
(nm)		 수화직경;
(수평균)
(nm)		 수평균 수화직경(Number-mean)과 core size의 차이(nm)
2nm PO-Glu 4.0 3.2 1.2
3nm PO-Glu 6.7 3.8 0.8
4nm PO-Glu 6.0 4.7 0.7
7nm PO-Glu 9.7 8.0 1.0
10nm PO-Glu 23.4 15.3 5.3
20nm PO-Glu 38.6 23.0 3.0
2nm PO-Man 8.9 7.9 5.9
7nm PO-Man 14.4 8.7 1.7
10nm PO-Man 20.6 14.1 4.1
2nm PO-Fru 6.0 5.2 3.2
7nm PO-Fru 18.5 12.5 5.5
10nm PO-Fru 23.6 11.3 1.3
10nm
(비교예 1)		 PLGA 46 42 32
3nm
(비교예 2)		 PO-PEGs 21 15 12
*PO-Glu: Glucose 6-Phosphate, PO-Man: Mannose 6-Phosphate, PO-Fru: Fructose-6-Phosphate
[실시예 7-1] Glucose 6-Phosphate가 부착된 3nm 코어 산화철 나노입자를 포함하는 조성물의 자기공명 T1 영상 분석
자기공명영상진단기(Trio 3.0T, Simens)에서 손목용 코일(wrist coil)을 이용하여 표1의 분산 친수화 된 철 산화물 나노입자 콜로이드 용액의 체내 T1 영상 성능을 평가하였다.
체내 T1 영상 성능 성능 평가는 렛드(rat) F-344를 이용하여 진행하였으며, Rat의 체중은 200~300g이었다. Rat를 마취한 뒤 자기공명영상진단기에 수평으로 넣고 단면을 관찰하였다. Rat의 자기공명영상은 조영제 주입 전, 조영제 주입 후, 조영제 주입 2시간 후, 조영제 주입 24시간 후를 측정하여 조영제 주입전과 주입후의 쥐 혈관을 관찰 비교 하였다. 표 1에 나타낸 3nm core 철 산화물 나노입자 콜로이드 용액에 5% 포도당용액(중외제약)을 첨가하여 조영제를 제조하였다. 철 농도를 ICP-AES를 통해 분석하였고, 렛드의 무게를 고려한 투여량을 계산하여 주입되는 조영제의 총 부피가 1ml이 되도록 하였다. 조영제는 렛드의 꼬리 정맥을 통해 주입하였고, 주입된 양은 5.2mg Fe/kg(rat)로 주입하였다.
체내 T1 이완 성능 측정은 Simens社에서 제공하는, 3D SPGR sequence(TR/TE: 25/5.1, Flip angle: 25°)를 이용하였고 scan time은 12min이다. 영상두께는 1mm 이고, 격자수는 256×146, FOV는 65×110mm 이었다.
제조한 조영제의 T1 조영효과를 정량적으로 평가하기 위해 가장 잘 보이는 대동맥, 쇄골하정맥, 우심방, 액와정맥의 한 단면을 선정하여 밝게 된 부분을 ROI(Region of Interest)로 선택하고 신호세기를 분석하였다. 획득한 자기공명영상의 전체적인 신호 세기가 측정시에 매번 변화하므로 Saline을 noise로 하여 상대적인 신호세기(SNR: Signal to Noise Ratio)를 구하였다. 조영제 사용 전후의 SNR을 비교하여 T1 신호 증강비(ΔR1)를 계산하였으며 이를 도에 그래프로 나타내었다. 다음의 수학식 1은 T1 신호 증강비(ΔR1)를 계산하는 방법이다.
[수학식 1]
Figure 112011060195007-pat00005
Figure 112011060195007-pat00006
Figure 112011060195007-pat00007
도 4는 3nm 크기의 코어(core)철 산화물 나노입자를 친수화 시킨 조성물을 물에 분산시킨 콜로이드를 포함하는 조영제를 렛드에 주입 한 후 혈관을 MRI T1 혈관조영술을 촬영한 사진이다. 렛드의 혈관이 하얗게 강조되어 보이는 것(양조영)을 확인 할 수 있고, 체내에서 2시간 이상 머무르는 것을 확인 할 수 있다. 기존 가돌리늄 조영제의 경우 체내 유지시간이 5분 미만으로 매우 짧기 때문에 MRI scan time을 늘려 촬영하기가 불가능 해 고해상도의 영상을 얻을 수 없다. 하지만 본 발명에 의해 제조된 산화철 조영제의 경우 체내 유지시간이 길기 때문에 scan시간을 늘려 촬영할 수 있으므로 고해상도의 영상을 얻을 수 있어 체내의 미세혈관까지 관찰이 가능하다는 것을 알 수 있다.
또한 도 5에서는 MR signal intensity를 나타내었는데, 조영제 주입 전 대비 최대 4배까지 밝아지는 것을 확인 할 수 있고, 0.2mm크기인 쇄골하정맥까지 확연한 관찰이 가능한 것을 알 수 있다.
[실시예 8] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 조영제의 체내 자기공명 영상측정
실시예 7에 제시된 방법을 통해 아래 표와 같은 물성을 갖는 Glucose 6- phosphate 에탄올 아민으로 친수화 된 철 산화물 나노입자를 제조하였다.
에탄올 아민이 결합된 Glucose 6phosphate 유도체로 표면이 개질된 산화철 나노입자 콜로이드 용액의 수화직경을 하기 [표 2]에 나타내었다.
Core size Vol.mean
(nm)		 No.mean
(nm)
3nm 18 8
10nm 14 9
[실시예 8-1] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 3nm 산화철을 포함하는 조성물의 Rat혈관 T1 조영제
Glucose 6-phosphate 에탄올 아민으로 친수화시킨 core size 3nm의 산화철 나노입자는 실시예 7-1과 동일한 방법으로 T1 혈관 조영을 실시하여 도 6에 나타내었다.
이를 실시예 7-1의 수학식 1을 이용하여 도 7에 나타내었다. 하대정맥, 우심방 및 대동맥의 signal의 확연한 증가를 확인 할 수 있다.
[실시예 8-2] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 7nm 산화철의 Rat혈관 T1 조영
Glucose 6-phosphate 에탄올 아민으로 친수화시킨 core size 7nm의 산화철 나노입자는 실시예 8과 동일한 방법으로 T1 혈관 조영을 실시하여 도 8에 나타내었다.
이를 실시예 7-1의 수학식 1을 이용하여 도 9에 나타내었다. 하대정맥, 우심방 및 대동맥의 signal의 확연한 증가를 확인 할 수 있다.
[실시예 8-3] 에탄올 아민이 결합된 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 7nm 산화철을 포함하는 조성물의 mouse lymph node T2 조영
Glucose 6-phosphate amino alcohol로 친수화 된 core size 7nm 직경의 산화철 나노입자의 자기공명 영상용 조영제로서의 사용 가능성을 평가하기 위해 자기공명영상진단기(Trio 3.0T, Simens)에서 Loop coil을 이용하여 체내 T2 이완 성능을 평가하였다.
체내 이완 성능 평가는 누드마우스(BALB/c nude mouse)를 이용하여 진행하였으며, 누드마우스의 체중은 약 20~30g이었다. 쥐를 마취한 뒤 자기공명영상진단기에 수평으로 넣고 단면을 관찰하였다. 누드마우스의 자기공명영상은 조영제 주입 전, 조영제 주입 24시간 후, 측정하여 조영제 주입 전과 후의 림프절을 관찰 비교 하였다. 조영제는 5%DW 0.5ml에 분산시켰고, 철 농도를 ICP-AES를 통해 분석하고 쥐의 무게를 고려하여 투여량은 10.4mg Fe/kg의 양으로 쥐의 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
체내 T2 이완성능 측정은 Simens社에서 제공하는 T2Me3d 펄스 대열을 사용 하였으며 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
TR(repetition time)=40.0msec, TE(echo time)=22.0msec, FOV=49mm×70mm, Matrix size,=256×180, slice thickness=0.6mm, number of acquisition=6
제조한 조영제의 T2 감쇄효과를 정량적으로 평가하기 위해 가장 잘 보이는 림프절인 inguinal(사타구니)림프절과 brachial(겨드랑이)림프절의 한 단면을 선정하여 림프절의 변색된 부분을 ROI(Region of Interest)로 선택하고 신호세기를 분석하였다. 획득한 자기공명영상의 전체적인 신호 세기가 측정시에 매번 변화하므로 신호세기의 절대값(S: signal intensity)으로 조영성능을 평가하기에는 무리가 있어 inguinal 림프절은 우측 뒷다리 근육, brachial 림프절은 우측 앞다리 근육을 대조군(N: noise)으로 하여 상대적 신호세기(SNR: Signal to Noise Ratio)를 구하였다. 조영제 사용 전후의 SNR을 비교하여 T2신호 감쇄비(ΔR2)를 계산 하였으며 이를 도11 의 그래프로 나타내었다. 다음의 수학식 2는 T2신호 감쇄비(ΔR2)를 계산하는 방법이다.
[수학식 2]
Figure 112011060195007-pat00008
Figure 112011060195007-pat00009
Figure 112011060195007-pat00010
도 10에 7nm 산화철을 Glucose 6-phosphate 에탄올 아민 유도체로 개질시킨 나노입자를 이용하여 in vivo MRI 림프절 영상을 나타내었다. 주입 1일 후 mouse의 정상 림프절에 산화철이 uptake되면서 검게 변하는 것을 확인 할 수 있다. 도 11에는 수학식 2를 이용하여 signal intensity의 감소를 나타내었는데 signal의 확연한 감소가 나타남을 알 수 있다.
[실시예 9] Glucose 6-phosphate 폴리에틸렌 글리콜로 친수화시킨 10nm core 산화철을 포함하는 조성물의 체내 자기공명영상측정
실시예 4, 5의 방법으로 얻은 단당류 phosphate- 폴리에틸렌 글리콜로 10nm core 산화철 나노입자를 친수화 처리하여 수평균 수화직경 30nm인 콜로이드를 제조하였다. 실시 예 8-3 과 동일한 방법으로 mouse lymph node T2조영 성능 test를 진행 하여 조영제 주입 전, 후 의 lymph node image를 얻었다.
폴리에틸렌 클리콜이 결합된 Glucose 6-phosphate 유도체로 표면이 개질된 산화철 나노입자 콜로이드 용액의 수화직경을 하기 [표 3]에 나타내었다.
Core size Vol.mean
(nm)		 No.mean
(nm)
3nm 19 14
10nm 96 26
도 12에 10nm 산화철을 Glucose 6-phosphate 폴리에틸렌 글리콜 유도체로 개질시킨 나노입자를 이용하여 in vivo MRI 림프절 영상을 나타내었다. 주입 1일 후 mouse의 정상 림프절에 산화철이 uptake되면서 검게 변하는 것을 확인 할 수 있다. 도 13에는 수학식 2를 이용하여 signal intensity의 감소를 나타내었는데 signal의 확연한 감소가 나타남을 알 수 있다.
[실시예 10] 단당류 phosphate 및 그 유도체로 표면이 개질된 산화철 나노입자 조성물의 MR in vitro 이완 특성
실시예 1, 2, 3의 방법으로 친수화 시킨 산화철 나노입자 조성물의 MR 조영능력을 측정하기 위하여 2nm, 3nm, 7nm, 10nm, 20nm 크기의 산화철 나노입자의 팬텀촬영을 4.7 T MR(Biospec 47/40, Bruker Biospin MRI GmbH)에서 BGA12 gradient coil을 이용하여 이완성능을 평가하였다. 산화철 나노입자의 농도는 ICP-AES를 통해 측정하였고, T2 이완시간 측정은 MSME(Multi Slice-Multi Echo sequence)펄스대열을 이용하였으며, 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
T1 촬영 파라미터는 다음과 같다. RARE sequence, TR =100, 200, 500, 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000 ms, TE = 7.756 ms, FOV=5cm, Matrix size=128×128, slice thickness=2mm 이었다.
T2 촬영 파라미터는 다음과 같다.
CarrPurcellMeiboomGill (CPMG) sequence, TR=10ms, TE = 7.5 960.0 ms, FOV=5cm, Matrix size=128×128, slice thickness=2mm이었다.
단당류 인산을 이용한 산화철 나노입자의 MRI in vitro 결과는 하기 [표 4]에 나타내었다.
Core size 사용 된
친수화 물질		 r1
(mM-1s-1)		 r2
(mM-1s-1)		 r2/r1
2nm PO-Glu 1.3 1.7 1.3
3nm PO-Glu 3.5 14.8 4.2
4nm PO-Glu 2.8 20.0 7.0
7nm PO-Glu 4.3 38.0 8.81
10nm PO-Glu 3.3 82.4 24.4
20nm PO-Glu 1.8 526 288
7nm PO-Man 4.0 68.3 16.8
10nm PO-Man 3.6 146 39.9
10nm PO-Fru 4.1 127 30.8
3nm PO-Glu-EA 3.3 26 7.8
7nm PO-Glu-EA 2.5 41 16.4
3nm PO-Glu-PEG 3.9 30 7.7
10nm PO-Glu-PEG 2.6 130 50.6
*PO-Glu: Glucose 6-phosphate, PO-Man: Mannose 6-phosphate, PO-Fru: Fructose 6-phosphate, PO-Glu-EA: Glucose 6-phosphate ethanol amine 유도체, PO-Glu-PEG: Glucose 6-phosphate PEG 유도체
표 4에는 단당류 인산 및 그 유도체로 표면이 개질된 산화철 나노입자 콜로이드 용액의 MRI 이완 성능을 나타내었다. Core size가 작은 산화철 나노입자의 경우 큰 r1값은 갖는 반면 r2값은 작기 때문에 획기적인 T1 조영제로 이용이 가능하다. Core size가 큰 나노입자의 경우 큰 r2값을 갖고 있기 때문에 T2 조영제로 이용이 가능하다. 따라서 단당류 인산 및 그 유도체로 치환된 산화철 나노입자는 T1 및 T2 조영제로의 효과적인 응용이 가능한 것으로 나타났다.
[실시 예 11] Glucose 6-phosphate 및 그 유도체로 표면이 개질된 산화철 나노입자콜로이드 용액의 독성 시험
산화철 나노입자 콜로이드 용액의 독성을 시험하기 위해 Hep G2세포로 MTT assay를 하였다. Glucose 6-phosphate로 친수화 시킨 10nm 코어 산화철 나노입자(A), Glucose 6- phosphate - PEG 유도체로 친수화 시킨 10nm 코어 산화철 나노입자(B), Glucose 6 phosphate-aminoalcohol로 친수화 시킨 3nm 크기의 산화철 나노입자(C) 3 종을 5%DW용액에 분산시킨 뒤 0.2㎛ 멸균 주사기 필터로 용액을 통과시켰다. 통과된 용액은 유도 결합 플라즈마-원자 방출 분광법(ICP-AES:Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy)을 이용하여 농도를 측정하였다. 농도를 측정한 산화철 나노입자 콜로이드 용액을 각각 200㎕씩 분취하여 배지(DMEM: Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium 89%, Pluronic
Figure 112011060195007-pat00011
F-127 10%, AA : antibiotic-antimycotic 1%) 200μL와 혼합한 뒤 1/2씩 희석하여 9개의 시료를 준비하였고 대조군으로는 산화철이 없이 5%DW용액을 앞의 과정과 동일하게 준비하였다. 계대배양하여 증식시킨 HepG2세포에 시료 100㎕를 각각 HepG2세포에 혼합하여 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 이후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)시약을 20㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 생성된 포르마잔 결정을 녹여내기 위하여 가용화 용액을 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 24시간동안 추가 배양하였다. 배양 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, Molecular Devices社, Spectra Max 190)를 이용하여 550nm와 690nm 에서의 광학밀도 값을 측정하고 이를 이용하여 세포의 생존력을 계산 하였다. 세포의 생존력은 아래의 [수학식3]으로 계산 하였다.
[수학식 3]
Figure 112011060195007-pat00012
ODi,550:시료가 주입 된 i 번 홈판의 550nm에서의 광학밀도 값
ODi,690:시료가 주입 된 i 번 홈판의 690nm에서의 광학밀도 값
ODSi,550:대조군 i 번 홈판의 550nm에서의 광학밀도 값
ODSi,690:대조군 i 번 홈판의 690nm에서의 광학밀도 값
도 14는 세포 생존력 실험의 결과 그래프이다. 일반적으로 세포 생존력 실험 시 ±20%는 오차 범위로 보는데 실험 농도 구간에서 80%이상의 세포 생존력을 보이는 것을 확인 할 수 있다. 특히 200 μg/mL의 고농도에서도 세포가 이상이 없는 것으로 보아 산화철 나노입자는 생체 적합성을 가졌다고 볼 수 있다.
[실시 예 12] Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 나노입자 콜로이드 용액의 제조
유기 용매에서 합성된 유기 계면활성제로 안정화 된 나노입자를 Glucose 6-phosphate를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 친수화 시켜 분산성이 안정한 콜로이드 용액을 제조하여 결과를 [표 5]에 나타내었다.
core 나노입자 core 나노입자 크기(nm) 수화 직경 No.mean (nm)
MnO 14nm 20nm
ZnO 20nm 25nm
CdS 6nm 10nm
Au 10nm 15nm
CoFe2O4 12nm 15nm
FePt 10nm 13nm
GdO 25nm 30nm
CdSe/CdS (Core Shell) 8nm 12nm
[실시 예 13] 다양한 용매에서 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 산화철 나노입자 콜로이드 용액의 제조
실시예 1에서 사용한 용매인 THF(Tetrahydrofuran) 대신 단당류 인산 혹은 단당류 인산 유도체, 나노입자가 용매 중에서 잘 접촉하도록 하기 위해서 물에 친화적인 극성 용매인 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)와 Ethanol을 각각 이용하여 10nm크기의 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 친수화하여 분산성이 안정한 콜로이드 용액을 제조하였다. 표 [6]에 친수화 실험에 사용된 용매와 DIW와의 비율, 반응온도, 반응 시간, 친수화 후의 수화직경을 나타내었다.
[실시예 13-1] DMSO를 이용하여 10nm 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 나노입자 콜로이드 용액의 제조
Oleic acid로 안정화 된 산화철 나노입자 100mg을 8ml의 DMSO에 분산 시킨 것과 200mg의 Glucose 6-phosphate sodium salt를 2ml의 DIW에 분산 시킨 것을 혼합하고, 이 혼합액을 120℃에서 12시간 동안 교반, 반응 시킨 후 냉각, 정치하였다. DMSO를 제거 하여, 친수화 조성물을 얻었다. 이 조성물에 증류수를 첨가하여 물에서의 분산 안정성이 우수한 Glucose 6-phosphate로 표면이 치환된 나노입자 콜로이드 용액을 제조 하였다.
[실시예 13-2] Ethanol을 이용하여 10nm 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 친수화시킨 나노입자 콜로이드 용액의 제조
Oleic acid로 안정화 된 산화철 나노입자 100mg이 8ml의 Ethanol에 첨가 한 후 200mg의 Glucose 6-phosphate sodium salt가 2ml의 DIW에 분산된 수용액을 섞어서 70℃에서 12시간 동안 교반 반응 시킨 후 냉각, 정치시켰다. Ethanol을 제거 하여, 친수화된 나노입자 조성물을 얻었다. 이 조성물에 증류수를 첨가하여 물에서의 분산 안정성이 우수한 Glucose 6-phosphate로 표면이 치환된 나노입자 콜로이드 용액을 제조 하였다.
Solvent 용매 : 물
(ml)		 반응온도/시간 친수화직경
(Volume mean, nm)		 친수화 직경
(Number mean, nm)
DMSO 8:2 120℃/8h 26.9 11.9
Ethanol 8:2 70℃/8h 48.6 13.05
[실시예 14] 물에 분산된 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 안정화 시킨 나노입자 콜로이드 용액의 제조
[실시예 14-1] 소수성 산화철 나노입자의 친수화
한국 특허출원(출원번호 10-2011-0011294)의 실시 예1에 따라 소수성 산화철을 개질하여 친수성 산화철을 제조하였다. Oleic acid가 표면에 부착된 3nm크기의 산화철(Fe3O4)50mg과 황산 나트륨(Sodium sulfate Na2SO4, 평균 입자 크기 150㎛)를 1:500의 중량비로 헥산(n-Hexane)에서 교반 한 후 헥산을 증발시킨다. 나노입자와 황산 나트륨 분말을 500에서 5시간동안 공기 조건에서 가열 하여 표면에 부착된 Oleic acid를 제거한다. 염을 충분히 제거하기 위해 나노입자와 염 분말을 증류수로 3차례 세척하여 물에 분산된 산화철 나노입자를 확인하여 친수성 산화철 나노입자가 제조되었음을 확인 하였다. 열처리 과정에서 입자들끼리 뭉쳐서 입자의 크기가 커지는 것은 관찰되지 않았다. 제조된 산화철 나노입자는 물에 분산은 되지만 표면에 안정화제가 없기 때문에 시간이 지남에 따라 가라앉는 특성을 나타낸다.
Malvern Zetasizer Nano ZS를 이용하여 콜로이드액 중의 나노입자 조성물의 수화직경을 측정한 결과 수화 직경이 30nm로 나타났는데 이는 표면 안정화물질이 없기 때문에 수용액에서 입자가 뭉친 것으로 판단된다.
[실시예 14-2] 물에 분산된 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 안정화시킨 산화철 나노입자 콜로이드 용액 제조
Oleic acid가 제거된 물에 분산된 산화철 나노입자를 Glucose 6-phosphate로 안정화 시키기 위해 실시예 14-1에서 제조된 산화철 나노입자 수용액(10ml)에 Glucose 6-phosphate sodium salt 1g을 첨가한 후 4시간 동안 60에서 sonication을 유지하였다. 반응 종료 후 Glucose 6-phosphate로 안정화된 산화철 나노입자 콜로이드 용액이 제조됨을 확인 하였다. 이 콜로이드는 상온에서 6달 동안 정치시켜 놓았으나, 탁도 변화가 없는 것으로 보아 장기안정성이 매우 우수한 것을 알 수 있다. Malvern Zetasizer Nano ZS를 이용하여 콜로이드액 중의 나노입자 조성물의 수화직경을 측정한 결과 수화 직경이 8.5nm로 나타나기 때문에 실시예 14-1에서 분산안정제가 존재하지 않은 산화철 나노입자에 비하여 수화직경이 줄어들고 분산 안정성이 향상되는 것을 확인하였다.
[비교 예 1] 산화철 나노입자의 친수화 캡슐 제조
Oleic acid로 안정화 된 10nm의 산화철 나노입자(40mg)와 PLGA((poly(lactic-co-glycolic acid)) 40mg을 에틸아세테이트 용액에 분산시킨 후, Pluronic
Figure 112011060195007-pat00013
F127(BASF Corporation, difunctional block copolymer) 4ml용액과 섞은 후 교반하여 캡슐화하여 수화직경을 분석하여 표 1에 나타내었다.
[비교 예 2] PO-PEGs를 이용한 산화철 나노입자의 친수화
Oleic acid로 안정화 된 3nm의 산화철 나노입자 50mg 과 PO-PEGs(PEG, MW: 2000)5g을 10ml의 Ethanol에 넣은 후 70℃에서 12시간동안 교반하여 친수화 산화철 나노입자를 제조하여 수화직경을 분석하여 표 1에 나타내었다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (30)

  1. 무기계 입자의 표면에 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 부착되어 표면이 개질된 친수성 나노입자가 물에 분산된 콜로이드 용액을 포함하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제로서,
    상기 무기계 입자는 산화철이며,
    상기 단당류 인산유도체는 단당류 인산의 인산기에 아미노알코올 또는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 것이고,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자의 크기는 1nm 내지 200nm이며, 수평균수화직경과 코어 무기입자의 크기 차이가 6nm 이하인 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서.
    상기 단당류 인산은 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate), 프룩토스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate) 및 만노스-6-포스페이트(mannose- 6-phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 아미노알코올은 에탄올아민(ethanolamine), 헵타미놀(heptaminol), 이소에타린(isoetharine), 노르에피네프린(norepinephrine), 프로판올아민(propanolamine) 및 스핑고신(sphingosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 아민기로 구성되어 있고, 수평균 분자량이 300 내지 50,000인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철은 FeO, Fe3O4(magnetite), α-Fe2O3, β-Fe2O3, γ-Fe2O3(maghemite), ε-Fe2O3, Fe(OH)2, Fe(OH)3, α-FeOOH, β-FeOOH, γ-FeOOH, δ-FeOOH, Fe5HO8·4H2O, 5Fe2O3·9H2O, FeOOH·4H2O, Fe8O8(OH)6(SO)·nH2O, Fe3+ 16O16(OH·SO4)12-13·10-12H2O 및 Fe3O4(magnetite)와 γ-Fe2O3(maghemite)의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 산화철은 Fe3O4(magnetite), γ-Fe2O3(maghemite) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자는 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 물에 분산된 용액과 극성 유기 용매 및 나노입자와 접촉되어 친수성으로 표면이 개질되는 것을 특징으로 하는 혈관조영용 자기공명영상 T1조영제.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 물에 분산된 용액; 극성 유기 용매; 및 산화철의 표면에 친유성 리간드가 부착된 친유성 나노입자;를 접촉시켜 상기 친유성 나노입자 표면을 친수성으로 개질시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 단당류 인산유도체는 단당류 인산의 인산기에 아미노알코올 또는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 것이고,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자의 크기는 1nm 내지 200nm이며, 수평균수화직경과 코어 무기입자의 크기 차이가 6nm 이하이며,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자를 물에 분산시켜 제조된 콜로이드 용액을 포함하는 림프절조영용 T2조영제의 제조방법.
  22. 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 물에 분산된 용액; 극성 유기 용매; 및 산화철의 표면에 친유성 리간드가 부착된 친유성 나노입자;를 접촉시켜 상기 친유성 나노입자 표면을 친수성으로 개질시키는 것을 특징으로 하며,
    상기 단당류 인산유도체는 단당류 인산의 인산기에 아미노알코올 또는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 것이고,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자의 크기는 1nm 내지 200nm이며, 수평균수화직경과 코어 무기입자의 크기 차이가 6nm 이하이며,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자를 물에 분산시켜 제조된 콜로이드 용액을 포함하는 혈관조영용 T1조영제의 제조방법.
  23. 제 21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 산화철은 Fe3O4(magnetite), γ-Fe2O3(maghemite) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 무기계 입자의 표면에 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 부착되어 표면이 개질된 친수성 나노입자가 물에 분산된 콜로이드 용액을 포함하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제로서,
    상기 무기계 입자는 산화철이며,
    상기 단당류 인산유도체는 단당류 인산의 인산기에 아미노알코올 또는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 것이고,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자의 크기는 1nm 내지 200nm이며, 수평균수화직경과 코어 무기입자의 크기 차이가 6nm 이하인 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 단당류 인산은 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate), 프룩토스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate) 및 만노스-6-포스페이트(mannose- 6-phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 아미노알코올은 에탄올아민(ethanolamine), 헵타미놀(heptaminol), 이소에타린(isoetharine), 노르에피네프린(norepinephrine), 프로판올아민(propanolamine) 및 스핑고신(sphingosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 아민기로 구성되어 있고, 수평균 분자량이 300 내지 50,000인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
  28. 제 24항에 있어서,
    상기 산화철은 FeO, Fe3O4(magnetite), α-Fe2O3, β-Fe2O3, γ-Fe2O3(maghemite), ε-Fe2O3, Fe(OH)2, Fe(OH)3, α-FeOOH, β-FeOOH, γ-FeOOH, δ-FeOOH, Fe5HO84H2O, 5Fe2O39H2O, FeOOH4H2O, Fe8O8(OH)6(SO)nH2O, Fe3+ 16O16(OHSO4)12-1310-12H2O 및 Fe3O4(magnetite)와 γ-Fe2O3(maghemite)의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
  29. 제 24항에 있어서,
    상기 산화철은 Fe3O4(magnetite), γ-Fe2O3(maghemite) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상T2조영제.
  30. 제 24항에 있어서,
    상기 표면이 개질된 친수성 나노입자는 단당류 인산 또는 단당류 인산유도체가 물에 분산된 용액과 극성 유기 용매 및 나노입자와 접촉되어 친수성으로 표면이 개질되는 것을 특징으로 하는 림프절 조영용 자기공명영상 T2조영제.
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