CN105213348B

CN105213348B - 一种还原响应性的载药纳米颗粒及其制备方法和用途

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Publication number: CN105213348B
Application number: CN201510733522.7A
Authority: CN
Inventors: 杨显珠; 曹紫洋; 马寅初; 钱海生; 陶伟
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: CN105213348A

Abstract

本发明公开了一种还原响应性的载药纳米颗粒及其制备方法和用途，其中还原响应性的载药纳米颗粒的结构式为：

Description

一种还原响应性的载药纳米颗粒及其制备方法和用途

一、技术领域

本发明涉及一种载药纳米颗粒，具体地说是一种还原响应性的载药纳米颗粒及其制备方法和用途。

二、背景技术

目前，治疗肿瘤的主要方法是化学药物治疗(化疗)。但是，化疗效果并不令人满意。特别是随着化疗的进行，肿瘤细胞对化疗药物逐渐产生的耐药性(包括多药耐药，multidrug resistance，MDR)，导致临床化疗失败。目前的研究表明多数MDR肿瘤细胞其细胞膜存在过度表达的P-糖蛋白(P-gp)，可以将抗癌药物排出胞外。因此，如何规避P-gp的作用是克服此类肿瘤细胞耐药性所亟待解决的重要问题。

基于高分子材料的纳米颗粒被广泛用作化疗药物的输送载体，并且这些纳米载体通常通过胞吞的途径进入肿瘤细胞，可以避免P-糖蛋白的泵出，从而有效提高胞内总的药物浓度，一定程度上可实现克服耐药的难题。然而，药物传统的纳米载体中的释放一般是通过被动扩散来实现，释放出的药物可能会进一步被泵出细胞外。为了避免摄取后药物的泵出、克服肿瘤耐药，需要药物到达耐药细胞后迅速释放，从而提高胞内活性药物浓度。因而，刺激响应释放体系在克服肿瘤耐药方面受到广泛的关注，其中包括还原响应、pH响应、酶响应和温度响应等。

三、发明内容

本发明旨在提供一种还原响应性的载药纳米颗粒及其制备方法和用途，该载药纳米颗粒是由侧基含二硫键的疏水性聚磷酸酯以及亲水性聚乙二醇构成的两亲性嵌段聚合物。

本发明载药纳米载体材料的结构式为：

其中x＝45，y＝15，z＝20，或者x＝45，y＝12，z＝6。

本发明载药纳米颗粒为两亲性嵌段聚合物，其中亲水嵌段是PEG，疏水嵌段是由侧链含二硫键的磷酸酯单体2-(2-二硫十二烷基)乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂戊烷(DssEEP)以及侧基是乙基的磷酸酯单体2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)无规共聚而成，我们在此合成了疏水段单体聚合度不同的两种聚合物mPEG-b-P(DssEEP-EEP)，其中所述PEG的聚合度为x＝45，其对应的数均分子量为2000；DssEEP链段的聚合度y＝15或12，EEP链段的聚合度z＝20或6，对应的数均分子量为8800～5520。

本发明载药纳米颗粒的制备包括如下步骤：

1、磷酸酯单体的制备

首先通过三氯化磷与乙二醇反应合成2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphospholane,COP)，然后COP与乙醇反应合成EEP，COP与2-羟乙基十二烷基过硫醚反应合成DssEEP。具体的合成方法如下：

COP的合成：将三氯化磷(3.0mol)溶解于无水二氯甲烷(500mL)中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5小时，减压蒸除溶剂，连续减压蒸馏两次将2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(50℃，200Pa)蒸出；随后将2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷溶解在苯中，通入O₂反应48小时，减压下蒸除溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(88-89℃，20Pa)蒸出，在N₂气氛下于4℃冰箱中保存备用。

环状磷酸酯单体EEP的制备：用注射器向反应器中依次加入0.3mol乙醇、0.3mol的三乙胺和500mL的四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃，搅拌下滴加COP的四氢呋喃溶液(0.154mol COP溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，于减压条件下蒸馏(120℃，20Pa)两次纯化，得到环状磷酸酯单体EEP。

环状磷酸酯单体DssEEP的制备：用注射器向反应器中依次加入0.3mol2-羟乙基十二烷基过硫醚、0.3mol三乙胺和500mL四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃，搅拌下滴加COP的四氢呋喃溶液(0.154mol COP溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，得到环状磷酸酯单体DssEEP。

2、嵌段聚合物的合成

反应在手套箱中进行。将mPEG(100g,0.05mol,Mn＝2000g/mol)、环状磷酸酯单体DssEEP和EEP溶于THF(10L)中(mPEG：DssEEP：EEP投料摩尔比为1:15:20或1:12:6)，搅拌混合均匀后加入催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]葵-5-烯(TBD，0.1mol)，在25℃下反应3min，加入苯甲酸(0.2mol)终止反应；将所得产物在乙醚和甲醇(10/1,v/v)的混合溶剂中沉淀两次，抽干，得到聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物。

两亲性嵌段共聚物用于药物传递载体已被广泛研究。当两亲性嵌段共聚物溶于其中一个嵌段的良溶剂而另外一个嵌段的不良溶剂时，共聚物自发组装成聚集体，嵌段之间的共价键阻止了嵌段间的相分离。通过纳米沉淀法(Nano precipitation method)制备聚乙二醇-聚磷酸酯共聚物的纳米颗粒，具体方法如下：

称取10mg聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物溶于DMSO，搅拌溶解，之后加入10mL的超纯水，搅拌3h；将上述混合液转移到透析袋(MW 14000)中，放在水中透析过夜除去DMSO。

本发明载药纳米颗粒的直径为100±9nm。其中PEG亲水段构成聚合物纳米颗粒的亲水壳层，侧基含二硫键的聚磷酸酯构成疏水内核。这种嵌段聚合物在水中能自组装形成胶束，通过物理包埋作用将药物分子(如阿霉素)载入载体纳米粒子的疏水内核，大幅提高药物溶解度，延长循环时间，血管渗透性增强效应(即EPR效应增强)被动靶向至肿瘤组织。并且，该载药纳米颗粒通过内吞被肿瘤细胞摄取后，在胞内还原环境下，二硫键断裂，药物快速释放，避免P-糖蛋白的泵出，克服肿瘤耐药，是一种具有应用前景的纳米药物载体。这种纳米药物载体可包载多种疏水性抗肿瘤药物，例如阿霉素、紫杉醇、吉非替尼、喜树碱等疏水性药物。

四、附图说明

图1为共聚物PEG-b-P(DssEEP-EEP)的合成路线。

图2为共聚物mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)、mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)的¹H NMR。

图3为大分子PEG引发剂及共聚物mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)、mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)的GPC谱。

图4为芘探针检测纳米颗粒在还原剂DTT处理不同时间时的激发光谱。

图5为两种载药纳米颗粒在水溶液中的粒径及粒径分布图。

图6为两种材料的细胞毒性实验。

图7为两种载药颗粒体外释放曲线。

图8为纳米药物被耐药肿瘤细胞的摄取。

图9为载药颗粒的细胞毒性实验。

图10为肿瘤抑制曲线。

五、具体实施方式

本发明提供了嵌段共聚物聚乙二醇-聚磷酸酯的合成及其自组装形成的载药纳米颗粒。该共聚物包括聚乙二醇(A嵌段)和聚磷酸酯(B嵌段)，所述A嵌段为聚乙二醇(PEG)，B嵌段是由侧基为乙基的磷酸酯单体EEP和侧基含二硫键的磷酸酯单体DssEEP两种单体无规共聚而合成的P(DssEEP-EEP)。所以上述嵌段共聚物聚乙二醇-聚磷酸酯表示为PEG-b-P(DssEEP-EEP)

上述嵌段共聚物可按照下述方法合成：以大分子引发剂聚乙二醇(PEG)的端羟基在TBD的催化下引发单体EEP、DssEEP开环聚合。通过控制磷酸酯环状单体与聚乙二醇的投料比可以制备不同嵌段长度的两嵌段共聚物。聚乙二醇-聚磷酸酯共聚物可降解，具有良好的生物相容性，并且可还原响应性释放药物。

本发明中的A嵌段是聚乙二醇，为亲水性聚酯，其相对分子量为2000。

本发明中的B嵌段聚磷酸酯，为疏水性聚磷酸酯，两种磷酸酯DssEEP和EEP的比例分别为15:20、12:6，它的优点在于①疏水性，通过疏水-疏水相互作用自组装成纳米颗粒，并且可包载疏水药物；②可生物降解，并且它的最终降解产物不会对生物体有不良影响；③合成简单且可控；④在还原环境中能发生二硫键断裂，颗粒崩解，使药物快速释放。

下述实施例提供了上述共聚物PEG-b-P(DssEEP-EEP)的合成方法。本发明的嵌段共聚物可在水相中自组装形成纳米颗粒并应用于疏水性抗癌药物的运输载体。

实施例1：两亲性共聚物mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)的合成

聚乙二醇-聚磷酸酯是由磷酸酯单体EEP、DssEEP在引发剂PEG_2K的引发下，TBD作为催化剂开环聚合得到，合成路线如图1所示。

1、磷酸酯单体的制备

COP的合成：在1000mL的三口圆底烧瓶中，将三氯化磷(3.0mol)溶解于无水二氯甲烷(500mL)中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5小时，减压蒸去溶剂，连续减压蒸馏两次将2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(50℃，200Pa)蒸出；将2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷溶解在苯中，通入O₂反应48小时，减压下蒸出溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(88-89℃，20Pa)蒸出，在N₂气氛下于4℃冰箱中保存备用。

环状磷酸酯单体EEP的制备：在一个干燥的1000mL三口烧瓶中，用注射器依次加入0.3mol乙醇，0.3mol的三乙胺和500mL的四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃，边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢加入COP的四氢呋喃溶液(0.154mol COP溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，于减压条件下蒸馏(120℃，20Pa)两次纯化，得到环状磷酸酯单体EEP。

环状磷酸酯单体DssEEP的制备：在一个干燥的1000mL三口烧瓶中，用注射器依次加入0.3mol 2-羟乙基十二烷基过硫醚，0.3mol三乙胺和500mL四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃，边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢加入COP的四氢呋喃溶液(0.154molCOP溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，得到环状磷酸酯单体DssEEP。

2、嵌段聚合物的合成

反应在手套箱中进行。将mPEG(100g,0.05mol,Mn＝2000g/mol)、环状磷酸酯单体DssEEP(0.75mol)和EEP(1.0mol)溶于THF(10L)中(mPEG：DssEEP：EEP投料摩尔比为1:15:20)，搅拌混合均匀后加入催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]葵-5-烯(TBD，0.1mol)，在25℃下反应3min，加入苯甲酸(0.2mol)终止反应；将所得产物在乙醚和甲醇(10/1,v/v)的混合溶剂中沉淀两次，抽干，得到聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物。

实施例2：两亲性共聚物mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)的合成

1、磷酸酯单体的制备过程同实施例1。

2、嵌段聚合物的合成

反应在手套箱中进行。反应在手套箱中进行。将mPEG(100g,0.05mol,Mn＝2000g/mol)、环状磷酸酯单体DssEEP(0.6mol)和EEP(0.3mol)溶于THF(10L)中(mPEG：DssEEP：EEP投料摩尔比为1:12:6)，搅拌混合均匀后加入催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]葵-5-烯(TBD，0.1mol)，在25℃下反应3min，加入苯甲酸(0.2mol)终止反应；将所得产物在乙醚和甲醇(10/1,v/v)的混合溶剂中沉淀两次，抽干，得到聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物。

实施例3：两亲性共聚物PEG-b-P(EEP-DssEEP)的表征

对实施例1、2制备的聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物进行核磁共振氢谱(¹H NMR)分析，测定其分子结构和链接个数，¹H NMR谱见图2。

图2中，聚乙二醇-聚磷酸酯的¹H NMR图谱字母标记了归属于嵌段聚合物的质子氢。通过3.75ppm的峰(归属于聚乙二醇的亚甲基)、4.31ppm的峰(归属于PEEP侧链的亚甲基)以及2.96ppm的峰(归属于PDssEEP侧链的亚甲基)的积分面积比计算得到磷酸酯的链接个数。

用凝胶渗透色谱(GPC〕法以聚乙二醇为标准分析实施例1、2制备的聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物的GPC图谱见图3。由图3可见，共聚物的GPC谱为单峰，得到的聚合物的峰都较引发剂PEG保留时间降低，证明聚合反应发生，得到了嵌段聚合物。

实施例3：两亲性共聚物mPEG-b-P(DssEEP-EEP)的纳米颗粒的制备及药物负载

1、纳米颗粒的制备

称取10mg聚合物溶于DMSO，搅拌溶解，之后加入10mL的超纯水，搅拌3h。将上述混合液转移到透析袋(采用MW 14000，使用之前沸水煮5min)中，放在水中透析过夜除去DMSO。

用上述方法分别制备了实施例1、2得到的嵌段共聚物的纳米颗粒，以芘作为荧光探针通过荧光光谱的方法证明了载药胶束在DTT作用下，二硫键破坏后，纳米颗粒降解，具有还原性响应。将嵌段共聚物的纳米颗粒样品(1.0mg/mL)置于37℃摇床上，加入10mM的DTT，培养不同时间。通过荧光分光光度计检测溶液中的芘荧光光谱。共聚物的荧光光谱见图4。由图4可见，随着培养时间的延长，mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)和mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)纳米颗粒溶液中芘的最大吸收谱波长从339.0nm移动到335.0nm，表明了芘从疏水性内核转移到水。即还原试剂DTT处理后，颗粒中的二硫键被切断，导致颗粒崩解，芘从颗粒的疏水性内核环境中释放出来，证明该纳米颗粒具有还原响应性。

2、纳米颗粒的还原响应性

将339.0nm与335.0nm处的荧光强度的比值与聚合物浓度的对数(log C)的关系作图。如图5所示，随着加DTT培养时间的增长，I₃₃₉/I₃₃₅的比值显著减小。表明了芘从胶束的疏水内核环境向外部环境移动，原因是由于胶束中的二硫键发生了还原性响应，导致磷酸酯段由疏水性向亲水性转变，最后颗粒崩解。

选取MCF-7/ADR细胞系，使用MTT法检测聚合物胶束在体外的细胞毒性。图6为将不同浓度的mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)和mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)胶束溶液和MCF-7/ADR细胞共培养24h后的相对细胞活力，空白培养组作为对照组。如图6所示，mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)和mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆₎聚合物胶束溶液浓度达到100mg mL^-1时，细胞活力仍保持90％以上。这一结果说明mPEG-b-P(DssEEP-EEP)聚合物胶束对于MCF-7/ADR细胞具有良好的生物相容性。

3、载药纳米颗粒的制备及表征

(1)载药纳米颗粒的制备

通过纳米沉淀法制备载药纳米颗粒，具体方法如下：

称取10mg嵌段共聚物溶于DMSO，搅拌溶解；加入溶有1mg DOX的DMSO溶液，搅拌30min，加入10mL的超纯水，搅拌3h。将上述混合液转移到透析袋(采用MW 14000)中，放在水中透析过夜除去DMSO。透析结束后，过滤膜以离心的方式除去未包载的DOX(离心时的条件为3000rpm，5min)，收集上清液，利用mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₅-EEP₂₀)、mPEG₄₅-b-P(DssEEP₁₂-EEP₆)制备的包载阿霉素纳米颗粒分别记作NP_ssPPE-1/DOX和NP_ssPPE-2/DOX。通过动态光散射检测载药颗粒粒径及其分布，实验结果如图5所示，载药纳米颗粒NP_ssPPE-1/DOX和NP_ssPPE-2/DOX的粒径均在100±9nm。

(2)载药纳米颗粒的体外药物释放

DOX从载药纳米颗粒中的释放在含有0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS，pH＝7.4)中进行。分别取1.0mL透析过后的载药纳米颗粒(载药量为50μg mL^-1)于透析袋(MWCO＝14kDa)中，再将透析袋置于10mL的PB缓冲液中，PB缓冲液中分别加入0mM，0.1mM，10mM的DTT(其中0mM DTT的PB缓冲液为对照组)，在37℃水浴中进行。在指定的时间，将释放外液全取出，并补充等量的新鲜缓冲液。通过HPLC分析释放外液中DOX的浓度。如图7所示，在0.0mM和0.1mM DTT的PB缓冲液中，约有40％包载的阿霉素从NP_ssPPE-1/DOX纳米颗粒中释放出来。而含有10mM DTT的PB缓冲液中，药物的释放率达到80％。NP_ssPPE-2/DOX实验组也可以观察到类似的释放曲线。这些实验结果都表明了两种载药颗粒均有还原响应性释放，这是由于聚磷酸酯段侧链二硫键在还原条件下发生断裂，导致磷酸酯段由疏水性转变成亲水性，最终导致颗粒崩解释放出药物。

实施例4：载药纳米颗粒的细胞水平的效应评价

1、肿瘤细胞对载药颗粒的摄取

本发明选取多药耐药性人乳腺癌细胞系(MCF-7/ADR)研究该还原响应性载药颗粒在细胞水平的效应。

将MCF-7/ADR细胞与NP_ssPPE-1/DOX、NP_ssPPE-2/DOX以及游离的DOX(DOX浓度为5.0μgmL^-1)共同培养不同的时间后，PBS清洗两次，1％的Triton X-100裂解细胞，取上层清液通过高效液相色谱(HPLC)分析胞内阿霉素含量，并通过蛋白归一化。实验结果如图8所示，NP_ssPPE-1/DOX以及NP_ssPPE-2/DOX实验组的细胞内阿霉素含量远远高于游离阿霉素组。以4小时为例，NP_ssPPE-1/DOX以及NP_ssPPE-2/DOX实验组胞内阿霉素达到1.78±0.03μg mg^-1以及2.01±0.04μg mg^-1；与之相比，游离阿霉素组细胞内的阿霉素含量只有它们的四分之一。这些结果表明，两种还原响应性载药颗粒能提高药物在多药耐药性肿瘤细胞中的富集，避免P-糖蛋白泵出效应。

2、载药颗粒杀伤MCF-7/ADR细胞的实验

MTT比色法检测上述制备的载药纳米颗粒对MCF-7/ADR的杀伤效果。具体方法如下：首先在96孔板上每孔种10000个细胞/100μL DMEM培养基(10％初生牛血清)，在CO₂培养箱中(37℃，CO₂浓度为5％)培养24小时后，将含有不同浓度DOX的NP_ssPPE-1/DOX、NP_ssPPE-2/DOX共培养，游离的DOX为对照。48小时后测细胞活力。结果见图9，由图9可见，游离阿霉素实验组的IC₅₀(半致死浓度)为19.3μg mL^-1，远远高于NP_ssPPE-1/DOX(6.1μg mL^-1)和NP_ssPPE-2/DOX(4.5μg mL^-1)。

实施例5、载药纳米颗粒的肿瘤抑制效应

取20只植有MCF-7/ADR肿瘤模型的BALB/C裸鼠，分为5组，每组5只。每四天静脉注射PBS(200μL)、DOX(5.0mg kg^-1)、载药纳米颗粒NP_ssPPE-1/DOX、NP_ssPPE-2/DOX(保持载药颗粒中DOX浓度与free DOX浓度一样)。每隔一天是用卡尺对肿瘤的体积进行测量。肿瘤体积的计算公式如下：体积(mm³)＝0.5×长×宽²。

由图10可知，注射游离DOX组与PBS组相比，肿瘤得到一定程度的抑制，但抑制效果并不明显。而NP_ssPPE-1/DOX以及NP_ssPPE-2/DOX能更有效抑制耐药性肿瘤的生长，其中NP_ssPPE-1/DOX最佳。

Claims

1.一种还原响应性的载药纳米颗粒，其特征在于：所述载药纳米颗粒是由聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物在水中自组装获得；所述聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物的结构式如下：

其中x＝45、y＝15、z＝20，或者x＝45、y＝12、z＝6。

2.一种权利要求1所述的载药纳米颗粒的制备方法，其特征在于：

所述聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物的制备包括如下步骤：

(1)磷酸酯单体的制备

COP的合成：将三氯化磷3.0mol溶解于无水二氯甲烷中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇3.0mol，滴完后继续反应0.5小时，减压蒸除溶剂，收集50℃、200Pa下馏分即为2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷；随后将2-氯-1，3，2-二氧磷杂环戊烷溶解在苯中，通入O₂反应48小时，减压下蒸除溶剂苯，收集88-89℃、20Pa下馏分得到2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷，简记为COP，在N₂气氛下于4℃冰箱中保存备用；

环状磷酸酯单体EEP的制备：用注射器向反应器中依次加入0.3mol乙醇、0.3mol三乙胺和四氢呋喃，将体系冷却到-5℃，搅拌下滴加0.154mol COP的四氢呋喃溶液，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，收集120℃、20Pa下馏分，得到环状磷酸酯单体EEP；

环状磷酸酯单体DssEEP的制备：用注射器向反应器中依次加入0.3mol 2-羟乙基十二烷基过硫醚、0.3mol三乙胺和四氢呋喃，将体系冷却到-5℃，搅拌下滴加0.154mol COP的四氢呋喃溶液，滴完后于-5℃反应24小时；反应结束后将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下除去溶剂，得到环状磷酸酯单体DssEEP；

(2)嵌段聚合物的合成

反应在手套箱中进行，将0.05mol mPEG、DssEEP和EEP溶于四氢呋喃中，搅拌混合均匀后加入催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]葵-5-烯0.1mol，在25℃下反应3min，加入苯甲酸0.2mol终止反应；将所得产物在乙醚和甲醇的混合溶剂中沉淀两次，抽干，得到聚乙二醇-聚磷酸酯嵌段共聚物；

mPEG、DssEEP与EEP的投料摩尔比为1:15:20或1:12:6；

乙醚和甲醇的混合溶剂是由乙醚和甲醇按体积比10:1混合构成。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

mPEG的数均分子量为2000g/mol。