CN116459215A - 一种刺激响应型双药共递送胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种刺激响应型双药共递送胶束及其制备方法和应用，属于高分子化学领域及药物制剂领域。本发明将阿霉素(DOX)直接作为疏水嵌段，与亲水嵌段mPEG通过能响应肿瘤微环境中高浓度的谷胱甘肽的二硫键键合起来，形成mPEG‑SS‑DOX胶束材料，利用分子动力学模拟筛选得到姜黄素(Cur)与mPEG‑SS‑DOX疏水端之间Flory‑Huggins相互作用参数最小。通过耗散粒子动力学模拟研究载药胶束的自组装过程，以及载药量对胶束的形态和结构的影响。成功制备具有氧化还原响应性的mPEG‑SS‑DOX/Cur胶束，胶束粒径较小，表面带有负电荷且载药量和包封率良好。

Description

一种刺激响应型双药共递送胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域与高分子化学领域，具体涉及一种刺激响应型双药共递送胶束及其制备方法。
背景技术
为了解决单一化疗药物达不到临床预期问题，临床上广泛使用不同药物的联合疗法来提高治疗效果。与单一药物治疗相比，多药联合治疗恶性肿瘤具有显著的优势：多药可通过相同或不同的抗肿瘤机制治疗恶性肿瘤，可以通过较低剂量的药物治疗取得相同或更佳的效果；多药联合治疗中的药物组合可以缓解或中和单药治疗引起的不良反应，并可通过多种机制克服治疗相关的多药耐药性等。
聚合物胶束作为一种被广泛研究的纳米药物递送系统，可同时装载多种药物，增强化疗效果，在多药联合治疗恶性肿瘤方面至关重要。疏水性药物可以溶解并稳定在胶束的疏水核中，提高药物稳定性。此外，亲水性的壳层可以通过减少血液循环中的调理作用来延长循环时间和提高空间稳定性。同时，由于增强的渗透性和保留效应(EPR)，纳米尺寸的胶束可以选择性地聚集在肿瘤部位并提高抗肿瘤效果。
刺激响应性共递送胶束可对内源性刺激响应性释放药物，促进药物在肿瘤组织富集和释放。大量研究结果表明，肿瘤诱导畸形血管的形成，导致肿瘤微环境(TME)处于严重缺氧状态，肿瘤细胞以无氧糖酵解为主要供能方式。然而，通过厌氧糖酵解积累的乳酸在TME中产生酸性pH值。TME中谷胱甘肽(GSH)的浓度是正常组织微环境的4倍，肿瘤细胞内GSH浓度是正常组织微环境中的10～1000倍。因此，氧化还原反应策略被应用于共递送胶束领域，以实现共载药物的响应性释放。GSH的敏感见二硫键可在一定浓度的GSH条件下发生断裂，利用二硫键将亲水和疏水部分连接成两亲聚合物，最终导致共递送胶束分解，在指定位置释放药物，且含氧化还原敏感片段的胶束结构在血液循环中是稳定的。一些研究表明，用GSH响应性共递送胶束包载DOX与基因药物(pTRAIL)，其中二硫键作为反应单元。当共递送胶束被递送到TME时，由于二硫键的还原最终导致DOX和pTRAIL的释放。抗肿瘤实验表明，其抑瘤率(94.0％)明显高于其他对照组。
分子动力学(MD)模拟方法是根据化学结构确定组分性质的有力手段，并且它们可用于例如评估药物与制剂中赋形剂的相容性。基于“同类相溶”的原理，各种方法被用于研究化合物的相容性。Flory-Huggins相互作用参数已被证明是药物与胶束材料相容性的良好指标，可通过MD模拟计算得到。一些研究者利用MD模拟方法计算Flory-Huggins相互作用参数来表征两亲性共聚物辅料PEG-hexPLA与4种不同亲脂性候选药物之间的相互作用，将MD模拟得到的Flory-Huggins相互作用参数与实验数据进行了比较，理论和实验结果趋势相同，验证MD模拟的可行性。
耗散粒子动力学(DPD)模拟可从介观角度研究两亲聚合物自组装成宏观系统的纳米胶束。DPD模拟可研究不同聚合物的共胶束化过程、混合聚合物胶束在微观和介观尺度上的结构分析、自组装结构的影响因素以及药物控制释放的机理，为实验结果提供了有力的补充工具。一些研究者采用粗粒度DPD模拟研究聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇(PEG-PLA-PEG)两亲性嵌段共聚物系统的形态、药物包封和释放，观察到药物包封和释放的程度主要受混合物中共聚物浓度的影响，平均聚集数和平均胶束体积随着药物包封在胶束中而增加，胶束的形状主要为球形。
阿霉素(DOX)通过嵌入DNA抑制核酸合成诱导细胞凋亡，是目前最具活性的单药治疗药物，因其广谱的抗肿瘤活性而被广泛用于治疗乳腺、卵巢、前列腺、脑、肺、白血病等多种恶性肿瘤。然而，DOX具有严重的心脏毒性、治疗窗狭窄以及多药耐药性的发生严重限制了其临床应用。
发明内容
本发明采用MD模拟、DPD模拟策略，筛选、设计合成刺激响应型双药共递送胶束，并预测和验证设计的刺激响应型双药共递送胶束的自组装过程和载药性能。本发明构建的氧化还原响应型DOX和Cur双药共递送胶束，具有良好的物理化学性质和抗肿瘤作用。
本发明采用的技术方案为：一种刺激响应型双药共递送胶束，是以mPEG为亲水性嵌段、二硫键为氧化还原敏感片段、阿霉素DOX为疏水性嵌段构建的聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX作为胶束材料，对药物X进行包载，形成的刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X。
进一步的，上述的一种刺激响应型双药共递送胶束，所述药物X包括紫杉醇(PTX)、姜黄素(Cur)和莪术醇衍生物(CD-2e)。
进一步的，上述的一种刺激响应型双药共递送胶束，按质量比，mPEG-SS-DOX:药物X＝(6:1)～(3:1)。
进一步的，上述的一种刺激响应型双药共递送胶束，所述mPEG为聚乙二醇单甲醚mPEG2000。
进一步的，上述的一种刺激响应型双药共递送胶束，所述聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX具有如(Ⅰ)所示的结构式：
一种刺激响应型双药共递送胶束的制备方法，包括如下步骤：
1)取3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)和乙酰氯，在65℃下用N2保护回流反应2h，制取3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)；
2)将3,3’-二硫代二丙酸酐(DTDPA)和mPEG溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，在搅拌下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙醇胺(TEA)，所得混合溶液在35℃下用N2保护进行反应，反应24h，制取mPEG-SS-COOH；
3)在搅拌下通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和|N|,|N|-二环己基碳二亚胺(DCC)活化溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的mPEG-SS-COOH，搅拌12h后，将mPEG-SS-COOH溶液缓慢加到去质子化的阿霉素(DOX)溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)进行催化反应，抽真空，于N2保护下在黑暗中搅拌24h后，将溶液置于透析袋中，先在DMSO中透析除去游离DOX，然后在去离子水中透析除去有机溶剂DMSO，冷冻干燥，得到mPEG-SS-DOX；
4)将mPEG-SS-DOX和药物X溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，所得混合溶液缓慢滴加到去离子水中，避光搅拌12h后，转移至透析袋中，通过透析除去DMSO，定时更换透析液，透析完成后经0.45μm微孔滤膜过滤，得到刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X。
进一步的，上述的制备方法，所述去质子化的阿霉素DOX是：将DOX·HCl溶于DMSO中，滴加三乙醇胺，在连续搅拌下获得去质子化的DOX。
进一步的，上述的制备方法，所述透析袋，分子量为2000Da。
本发明提供的一种刺激响应型双药共递送胶束在制备化疗药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明的刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur，实现了双药共同递送，载药量良好，可以极大的提高载药效率，利用两种药物不同的抗肿瘤机制可实现更有效的杀伤肿瘤效果。
2、本发明的刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur，可实现在肿瘤环境氧化还原条件下的响应性释放，有助于药物在肿瘤部分的累积。在正常条件下DOX不会轻易水解断裂释放，本发明增加了DOX的体内稳定性，实现缓释效果，降低抗肿瘤药物DOX的心脏毒性，且具有良好的安全性。
3、现有技术中，DOX通常与其他药物联合使用。Cur通过抑制人表皮生长因子受体-2(HER 2)活性和核因子κB(NF-kB)活化来抑制细胞增殖，与DOX抗肿瘤机制不同。本发明利用聚合物胶束共递送DOX与Cur，降低了毒副作用，提高肿瘤部位的累积，最终提高抗肿瘤作用。
4、本发明提供的mPEG-SS-DOX/Cur，可在氧化还原条件下响应性释药。
附图说明
图1为DOX、PTX、Cur和CD-2e的3D分子模型图。
图2为DOX、PTX、Cur和CD-2e的周期性体系图。
图3为几何优化后的DOX、PTX、Cur和CD-2e的3D分子模型图。
图4为DPD模拟后的DOX、PTX、Cur和CD-2e的周期性体系图。
图5为DPD模拟中各种分子的珠子划分图。
图6为mPEG-SS-DOX/Cur胶束自组装示意图。
图7为不同药物与胶束材料投料比下mPEG-SS-DOX/Cur胶束的模拟平衡态示意图。
图8为mPEG-SS-DOX的合成路线图。
图9为DTDPA(A)、DTDP(B)、mPEG(C)、mPEG-SS-COOH(D)和mPEG--SS-DOX(E)核磁共振氢谱图。
图10为mPEG(A)和mPEG-SS-DOX(B)的质谱图。
图11为mPEG-SS-DOX/Cur的粒径图。
图12为mPEG-SS-DOX/Cur的电位图。
图13为mPEG-SS-DOX/Cur的透射电镜图。
图14为mPEG-SS-DOX/Cur的稳定性研究图。
图15为mPEG-SS-DOX/Cur的溶血实验结果图。
图16为mPEG-SS-DOX/Cur在不同条件下的体外释放曲线图。
图17为mPEG-SS-DOX、mPEG-SS-DOX/Cur、DOX和Cur对HepG2和S180细胞的增殖抑制作用对比图(统计学差异表示为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施实例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1一种刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X
以mPEG为亲水性嵌段、二硫键为氧化还原敏感片段、阿霉素DOX为疏水性嵌段构建的聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX。
将聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX作为胶束材料，采用MD模拟方法选择与疏水端相容性好的药物，通过DPD模拟研究载药胶束的自组装过程，以及载药量对胶束的形态和结构的影响，利用纳米沉淀法法和透析法制备刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X。
(一)运用分子动力学模拟筛选出与疏水端相容性最好的药物
步骤如下：
1、首先通过Materials Studio软件中的Materials Visualizer模块，绘制出胶束材料(mPEG-SS-DOX)疏水端DOX、PTX、Cur和CD-2e的3D分子模型，结果如图1。
2、使用Materials Studio软件中的Forcitce模块对胶束材料(mPEG-SS-DOX)疏水端DOX、PTX、Cur和CD-2e的3D分子模型进行几何优化。选择Calculation，任务选择GeometryOptimization，精密选择Fine。运算法则选择Smart，能量收敛公差和力收敛公差分别设置为1.0×10-4kcal/mol和0.005最大迭代次数设置为10000，力场选择COMPASSII，然后范德华力和静电能的求和法选择Atom based，参数设置完成后，点击Run，运行一段时间后完成四种3D分子模型的几何优化，几何优化前后的能量变化如表1，优化结果如图3。
表1DOX、PTX、Cur、CD-2e几何优化前后的总能量
3、用Materials Studio软件中的Amorphous Cell模块建立DOX、PTX、Cur、CD-2e的周期性体系。在Amorphous Cell模块中选择Calculation，每个周期性体系中加入55个3D分子模型，任务选择Construction，精度选择Fine，结果如图2。
4、对完成几何优化的四种周期性体系进行退火，起始温度为298K，最高温度设置为598K，循环次数设置为5次，每个周期温度梯度为6个，每个温度梯度的动力学步骤为10000步。选择NPT系综，压力为1.0×e-4GPa，模拟时间设置为1fs，使用Andersen法温度控制，使用Berendsen法压力控制。COMPASS II力场用于计算系统的势能，而范德华能计算方法选择基于原子的方法，静电能计算方法为Ewald方式。退火完成后进行动力学，整个体系选择NPT系综，温度设置为298K，压力为1.0e-4GPa，模拟前后的总能量和动力学模拟后的体系密度如表2，模拟结果如图4。
表2 DOX、PTX、Cur、CD-2e模拟前后的总能量和模拟后的体系密度
5、DOX、PTX、Cur、CD-2e的周期性体系经过几何优化、退火和动力学三个过程后得到结构合理的构型，使用Materials Studio软件中Forcite模块计算内聚能量密度，任务栏选择Cohesive Energy Density任务，计算完成后会得到溶解度参数(δ)，Flory-Huggins相互作用参数根据以下公式计算：
其中，χ药物-疏水端为药物和疏水端的Flory-Huggin相互作用参数；δ药物和δ疏水端是包载药物和胶束材料疏水端的溶解度参数；V药物是药物的平均摩尔体积，R是理想气体常数，T为温度。
DOX与PTX、Cur、CD-2e之间的Flory-Huggins相互作用参数结果如表3，DOX与Cur的Flory-Huggins相互作用参数最小，表明Cur与胶束材料mPEG-SS-DOX的相容性最好，所以用mPEG-SS-DOX包载Cur。
表3 DOX与PTX、Cur、CD-2e之间的Flory-Huggins相互作用参数
(二)DPD模拟研究胶束材料mPEG-SS-DOX和包载药物自组装形成胶束过程和包载药物含量对自组装胶束的形态和结构的影响
步骤如下：
1、采用DPD模拟进行粗粒化模拟，对分子结构进行了划分，几个原子或一个官能团表示为DPD珠，用颜色突出显示。将聚乙二醇单体划分为P珠子，珠子颜色为蓝色；DOX划分为三个D1、一个D2和一个D3珠子，珠子颜色都用红色表示；Cur划分为两个C珠子，珠子颜色为黄色；四个水分子划分为W珠子，珠子颜色为灰色，结果如图5。
2、利用DPD模拟研究胶束材料mPEG-SS-DOX、包载药物Cur的自组装过程之前需要计算不同类型的珠子之间的相互作用参数(aij)
不同类型的珠子之间的相互作用参数值aij遵循以下关系式：
aij≈aii+3.27χij
在该关系式中，χij是弗洛里-哈金斯参数，aii是相同类型的珠子的相互作用，其遵循关系式：
其中KBT＝1，在室温下，无量纲压缩系数k-1＝15.9835。Nm是组成粗粒水珠的水分子数，α＝0.101-0.001；ρDPD是系统的数密度，因此排斥参数aii＝25。
在此，Flory-Huggins参数χij可以根据以下等式计算：
其中δi和δj是珠粒i和j的溶解度参数，Vbead是所有珠子的平均摩尔体积，气体常数R≈8.314。
通过分子动力学模拟计算体系中各珠子间的Flory-Huggins相互作用参数，结果见表4。
表4各珠子之间的DPD相互作用参数αij
3、使用Mesocite模块进行耗散粒子动力学模拟，首先建立一个周期性条件为 的盒子，将15％的mPEG-SS-DOX、5％的Cur和80％的水加入周期性盒子中。温度设为298K，使热能KBT＝1，珠子密度ρ设为3，耗散力参数γ设为4.5，弹性常数C设为4，截断半径rc设为1。这些条件确保了模拟能够合理有效地进行。模拟步数设置为300000步，积分步长Δt＝0.05，以达到热力学平衡。结果见图6。
4、使用DPD模拟的方法研究包载药物Cur组分含量对胶束自组装结构和平衡态形貌的影响。结果见图7，周期性盒子中胶束材料mPEG-SS-DOX的量设为15％；胶束材料mPEG--SS-DOX与包载药物Cur的投料比分别设定为6:1、3:1、2:1、1:1四种投料比；水珠子的量随着包载药物Cur的量的变化而变化，模拟实验参数与条件设置与上述一致。当投料比为6:1和3:1时，体系中胶束材料mPEG-SS-DOX和包载药物Cur自组装形成稳定的球形结构，剖面图显示包载药物Cur被稳定包覆在球型胶束的核心中，DOX为中间层，mPEG是外层壳。当投料比为2:1，胶束内核包载药物Cur的量增大，胶束外层mPEG层变薄，使部分DOX暴露于胶束的表面，向模拟体系中进一步增加包载药物Cur，当投料比为1:1时，胶束的核心更大，胶束材料不能完全覆盖球体表面，使部分药物出现在球状胶束的表面。由此可见，该胶束体系载药时最佳胶束材料mPEG-SS-DOX与包载药物Cur的投料比为6:1～3:1，所形成的胶束才能稳定。
(三)聚合物-药物连接物(mPEG-SS-DOX)的合成
合成路线如图8，步骤如下：
1、DTDPA的合成
将1.0g DTDP和5mL乙酰氯加到50mL圆底烧瓶中，将混合溶液保持在65℃并用N2保护回流反应，反应2h后，通过旋蒸除去乙酰氯，向混合溶液中加入冰乙醚沉淀产物，析出白色沉淀。过滤后，真空干燥24h，即得DTDPA。
2、mPEG-SS-COOH的合成
以mPEG和DTDPA为原料合成了mPEG-SS-COOH。在圆底烧瓶中将DTDPA(192mg，1.0mmol)和mPEG(1000mg，0.5mmol)溶解于3.0mL无水DMF中。然后，在搅拌下加入将DMAP(122mg，1.0mmol)和TEA(140μL，1.0mmol)加入到溶液中。将混合溶液保持在35℃并用N2保护反应。反应24h后，向混合溶液中加入冰乙醚以沉淀mPEG-SS-COOH。通过离心除去乙醚获得白色沉淀，将其冷冻干燥，并在-20℃下保存。
3、mPEG-SS-DOX的合成
将DOX·HCl(116mg，0.2mmol)溶于2mL DMSO中，滴加84μL TEA。在连续搅拌下获得脱质子化的DOX。
在搅拌下通过NHS(184mg，1.6mmol)和DCC(82mg，0.4mmol)活化溶解在3mL DMSO中的mPEG-SS-COOH(438mg，0.2mmol)，搅拌12h后，过滤mPEG-SS-COOH溶液并将滤液缓慢加到去质子化的DOX溶液中，并将DMAP(49mg，0.4mmol)加入到溶液中催化反应，抽真空，在N2保护下在黑暗中搅拌。搅拌24h后，将溶液置于透析袋(MWCO：2000Da)中，首先在DMSO中透析除去游离DOX。然后将该溶液在去离子水中透析除去有机溶剂DMSO。通过冷冻干燥得到mPEG-SS-DOX。
mPEG-SS-DOX的核磁共振氢谱(1H-NMR)结果如图9所示：从1H-NMR谱可以看出，在图9中B所示，DTDP的羧基中氢的峰(c)在δ＝12ppm左右处。在图9中A所示，δ＝12ppm左右处的羧基中氢的峰消失，证明了DTDP脱水成功，形成了酸酐DTDPA。mPEG的亚甲基峰(d)和甲基峰(e)分别出现在δ＝3.60ppm左右和δ＝3.25ppm左右处，在图9中C和图9中D中均能看出。在图9中D，DTDP的亚甲基峰(a，b)出现在δ＝2.95ppm和δ＝2.55ppm处。在δ＝4.25ppm处的峰(f)是DTDPA和mPEG的反应产物的酯键峰，由此证明mPEG和DTDPA成功反应生成mPEG-SS-COOH。图9中E为mPEG-SS-DOX的1H-NMR图，图9中E中出现了δ＝4.0-8.0ppm的阿霉素的特征峰(j、k)和mPEG-SS-COOH特征峰(d、f)，表明DOX成功通过二硫键与mPEG键合。
mPEG-PLGA-SS-DOX的质谱结果如图10所示：mPEG的分子量在2000左右，mPEG-SS-DOX的分子量在2700左右，表明DOX成功键合在mPEG上。
(四)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的制备
步骤如下：
称取15mg mPEG-SS-DOX和3mg Cur充分溶解溶于2.0mL DMSO内，将所得混合溶液缓慢滴加到5.0mL去离子水中，避光搅拌12h后，转移至透析袋(MWCO：2000Da)中，在去离子水中透析除去DMSO。每隔2、4、6、8、10、12h更换透析液，透析完成后经0.45μm微孔滤膜过滤并定容至10mL，得到mPEG-SS-DOX/Cur胶束。
(五)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的粒径、电位的测定
将适量mPEG-SS-DOX/Cur胶束吸入粒径皿和电位皿中，采用动态光散射(DLS)法测定mPEG-SS-DOX/Cur胶束的粒径、电位和PDI，测试温度设置为25℃。mPEG-SS-DOX/Cur的粒径和电位如图11、图12所示，该聚合物前药胶束粒径为142.7±2.8nm，粒径均小于200nm，因此适合于维持较低的网状内皮系统的摄取水平和最小的肾排泄，表明其作为智能载体可以通过EPR效应促进药物在肿瘤组织富集，增强肿瘤治疗效果；电位为-10.9±0.85mV，表面都带有负电荷，可以防止血液循环中的蛋白质吸收，最大程度地减少与网状内皮系统的非特异性相互作用，并延长胶束的体内循环时间。
(六)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的形态研究
将mPEG-SS-DOX/Cur胶束滴加到清洁的铜网上，放入通风处中干燥，干燥完成后通过透射电子显微镜(TEM)察胶束的大小和形态。结果如图13所示，mPEG-SS-DOX/Cur胶束为规整球形，没有聚集情况，粒径在130nm左右，与粒径测量结果基本一致。
(七)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的稳定性研究
以粒径大小和PDI为评价指标，评价胶束溶液的稳定性。将胶束溶液储存在4℃条件下，并在第0、2、4、6、8和10天取样采用动态光散射(DLS)法测量胶束的粒径和PDI。结果如图14所示，平均粒径和PDI随着时间的推移有变化范围不大，其平均粒径稳定在200nm之内，始终保持在有效的粒径范围，表明胶束在4℃存放时稳定性较好。
(八)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的溶血性研究
通过大鼠眼眶取血适量，置于EDTA抗凝管中，离心分离(1000r/min，10min)，弃去上层血清，然后加入适量的PBS缓冲液，再次离心分离(1000r/min，10min)，弃去上层溶液，重复操作多次直至上层溶液澄清透明，清洗完成后取200μL下层沉淀红细胞，加入到10mLPBS缓冲液中，获得2％红细胞悬液。实验组在离心管中分别加入500μL 2％红细胞悬液、1.5mL不同浓度的游离药物(DOX+Cur)溶液和mPEG-SS-DOX/Cur胶束溶液。阴性对照组在离心管中加入500μL 2％红细胞悬液和1.5mL PBS缓冲液。阳性对照组在离心管中加入500μL2％红细胞悬液和1.5mL去离子水。将所有离心管放入37℃水浴中孵育2h，然后离心分离(1000r/min，10min)，观察溶血现象，拍照记录实验现象。通过紫外可见分光光谱仪测定离心后的上层溶液在545nm处的吸光度值(A)，按照如下公式计算溶血率：
溶血性研究结果如图15所示，mPEG-SS-DOX/Cur胶束可明显改善游离药物的溶血性，不同药物浓度的mPEG-SS-DOX/Cur胶束的溶血率均小于4％，不会发生溶血，证明mPEG-SS-DOX/Cur胶束的生物相容性良好。
(九)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的体外释放实验
用透析法研究胶束的氧化还原响应性释放，首先配置不同的释放介质：无GSH的PBS缓冲溶液和GSH浓度为10mM的PBS缓冲溶液，并分别加入1.0％ Tween-80，然后将等量的mPEG-SS-DOX/Cur胶束溶液添加到相同长度的透析袋中(MWCO:2000Da)中，然后将其放入已经加入20mL释放介质的离心管中，放入恒温振荡箱中振摇，温度设置为37℃，转速设置为100rpm。分别在孵育0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72h后吸取1mL释放介质，立即补充等量的相同条件的释放介质。
结果如图16所示，从有无GSH条件下胶束中DOX的释放曲线中可以看出GSH浓度对药物累积释放量和释放快慢均有明显的影响。在无GSH时，DOX的释放较慢，72h内的累积释放量不到20％。因为DOX分子化学连接在mPEG链上，并且mPEG-SS-DOX在无GSH条件下稳定。在10mM GSH条件下，释放速率迅速加快。DOX分子与聚合物之间的氧化还原敏感键断裂导致2h和72h的累积释放量分别约为23％和72％以上。关键原因可能是DOX与mPEG之间的氧化还原敏感键断裂，胶束被分解，游离DOX分子容易扩散到溶液中。从有无GSH条件下胶束中Cur的释放曲线中可以看出，尽管Cur的释放曲线依赖于GSH，但在无GSH条件下Cur的释放速率比DOX的快，Cur在2h和72h的累积释放量分别大于10％和30％。其原因可能是Cur在自组装过程中通过疏水作用物理性地负载到胶束核中，由于胶束的溶胀，在无GSH条件下孵育期间，一些Cur分子可能被释放并扩散到溶液中。在10mM GSH条件下，释放较快，Cur在10mMGSH条件下2h内和72h内的累积释放量分别为28％和87％。上述情况由于是DOX与mPEG之间的氧化还原敏感键断裂，导致胶束溶胀和解体，包载药物释放。总的来说，DOX和Cur的释放速率随着GSH的增多而加快。因此，药物(DOX和Cur)从胶束中的释放是由GSH触发的。
(十)刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/Cur的细胞毒性研究实验
采用MTT法测定mPEG-SS-DOX/Cur的细胞毒性。将生长至对数期的HepG2和S180细胞制成密度为1×104cells/mL细胞悬液，然后接种到96孔板中(100μL/孔)，培养24h，使细胞贴壁生长。然后每孔加入100μL DOX、Cur、mPEG-SS-DOX胶束和mPEG-SS-DOX/Cur胶束溶液，DOX的浓度分别为：0.1、1、5、10、20μg·mL-1，Cur的浓度分别为0.07、0.7、3.5、7、14μg·mL-1，设置3个平行。加药后培养48h。然后每孔加入20μL MTT溶液，培养4h。之后取出96孔板并弃去上层培养液和MTT溶液，每孔加150μL DMSO，在570nm下测定每孔吸光度，计算抑制率。
结果如图17所示，DOX、Cur、mPEG-SS-DOX胶束和mPEG-SS-DOX/Cur胶束对肿瘤细胞的增值抑制作用均具有剂量依赖性。DOX对肿瘤细胞的毒性高于mPEG-SS-DOX胶束，这种结果可能是因为DOX和mPEG-SS-DOX胶束通过不同方式进入肿瘤细胞，DOX通过自由扩散的方式，而mPEG-SS-DOX胶束则通过内吞的方式进入肿瘤细胞，这使mPEG-SS-DOX胶束发挥药效较慢。此外，mPEG-SS-DOX和mPEG-SS-DOX/Cur胶束都能够明显抑制肿瘤细胞的增值，并且与mPEG-SS-DOX胶束相比，mPEG-SS-DOX/Cur胶束的细胞毒性显著增大，表明DOX和Cur在胶束中的共同给药可提高对肿瘤细胞的增殖抑制作用。

Claims (9)

1.一种刺激响应型双药共递送胶束，其特征在于：是以mPEG为亲水性嵌段、二硫键为氧化还原敏感片段、阿霉素DOX为疏水性嵌段构建的聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX作为胶束材料，对药物X进行包载，形成的刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X。
2.根据权利要求1所述的一种刺激响应型双药共递送胶束，其特征在于：所述药物X包括紫杉醇PTX、姜黄素Cur和莪术醇衍生物CD-2e。
3.根据权利要求1所述的一种刺激响应型双药共递送胶束，其特征在于：按质量比，
mPEG-SS-DOX:药物X＝(6:1)～(3:1)。
4.根据权利要求1所述的一种刺激响应型双药共递送胶束，其特征在于：所述mPEG为聚乙二醇单甲醚mPEG2000。
5.根据权利要求1所述的一种刺激响应型双药共递送胶束，其特征在于：所述聚合物-药物链接物mPEG-SS-DOX具有如(Ⅰ)所示的结构式：
6.权利要求1-5任一项所述的一种刺激响应型双药共递送胶束的制备方法，其特征在于：制备方法包括如下步骤：
1)取3,3’-二硫代二丙酸和乙酰氯，在65℃下用N2保护回流反应2h，制取3,3’-二硫代二丙酸酐；
2)将3,3’-二硫代二丙酸酐和mPEG溶解于DMF中，在搅拌下加入4-二甲氨基吡啶和三乙醇胺，所得混合溶液在35℃下用N2保护进行反应，反应24h，制取mPEG-SS-COOH；
3)在搅拌下通过N-羟基琥珀酰亚胺和|N|,|N|-二环己基碳二亚胺活化溶解在DMSO中的mPEG-SS-COOH，搅拌12h后，将mPEG-SS-COOH溶液缓慢加到去质子化的阿霉素DOX溶液中，并加入4-二甲氨基吡啶进行催化反应，抽真空，于N2保护下在黑暗中搅拌24h后，将溶液置于透析袋中，先在DMSO中透析除去游离DOX，然后在去离子水中透析除去有机溶剂DMSO，冷冻干燥，得到mPEG-SS-DOX；
4)将mPEG-SS-DOX和药物X溶解于DMSO中，所得混合溶液缓慢滴加到去离子水中，
避光搅拌12h后，转移至透析袋中，通过透析除去DMSO，定时更换透析液，透析完成后经0.45μm微孔滤膜过滤，得到刺激响应型双药共递送胶束mPEG-SS-DOX/X。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述去质子化的阿霉素DOX是：将DOX·HCl溶于DMSO中，滴加三乙醇胺，在连续搅拌下获得去质子化的DOX。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述透析袋，分子量为2000Da。
9.权利要求1-5任一项所述的一种刺激响应型双药共递送胶束在制备化疗药物中的应用。
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