CN115531308B - 一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用，属于医药技术领域，该递药系统是将药物纳米结晶包载于胶束中，其中，药物纳米结晶为齐墩果酸纳米结晶；胶束为两亲性载体材料，所述两亲性载体材料的亲水端为硫酸软骨素，疏水端为柳氮磺胺吡啶，亲水端与疏水端以pH敏感键为连接键。本发明示例的一种纳米结晶胶束递药系统，将难溶性药物齐墩果酸制备成药物纳米结晶，将药物纳米结晶包载于胶束中，一方面可以实现对药物纳米结晶的表面进行修饰，使之具有靶向性等性能；另一方面可以通过胶束及纳米结晶的缓释效果，进一步提高药物在体内的滞留时间。

Description

一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用。
背景技术
肝纤维化是一种慢性肝损伤引起的，以缔结组织广泛增生为特征的动态病理过程，是肝组织异常修复的结果，随着肝纤维化程度的加重,患者可能发生肝衰竭、门静脉高压、消化道大出血等严重并发症,肝癌的发生率也逐渐升高，严重威胁了患者的身体健康甚至生命安全。肝纤维化的主要病理特征表现为肝脏内弥漫性细胞外基质成分(extracellular matrix,ECM)过度沉积，汇管区大量纤维结缔组织异常增生，进而破坏肝脏正常结构以及生理功能。目前，大量的文献已证实活化的肝星状细胞(hepatic sellatecell,HSC)是ECM分泌的主要起源，HSCs激活及转化为肌成纤维样细胞是肝纤维化发生和发展的核心环节。
纳米结晶技术是一种可将药物直接纳米化的制剂技术，其所制备的纳米结晶是一种由纯中药或药物与适当稳定剂共同构成的递药系统。纳米结晶具有药载量高、稳定性好等优点。将药物纳米结晶包载于胶束中，一方面可以实现对药物纳米结晶的表面进行修饰，使之具有靶向性等性能；另一方面可以通过胶束与纳米结晶的缓释效果，进一步提高药物在体内的滞留时间。
硫酸软骨素(CS)是一种多糖，作为亲水基团，同时也表现出卓越的生物相容性和降解性。CD44是一种细胞表面固有的透明质酸受体，根据研究表明，CD44在活化的肝星状细胞和各种肿瘤细胞上特异性过表达，与CD44特异性互相作用的天然底物包括透明质酸(HA)和硫酸软骨素。因此，硫酸软骨素作为纳米载体能够在给药时特异性的靶向于活化的肝星状细胞，而不必修饰任何靶头。
基于以上研究，本发明拟合成一种基于铁死亡机制的且具有pH微环境响应功能的两亲性聚合物，制备胶束以硫酸软骨素为亲水端，特异性靶向活化态肝星状细胞，pH敏感键亚胺键连接疏水端柳氮磺胺吡啶，并利用纳米结晶具有长循环的特点，构建齐墩果酸纳米结晶的胶束递药系统。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种纳米结晶胶束递药系统及其制备方法与应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
提供了一种纳米结晶胶束递药系统，该递药系统是将药物纳米结晶包载于胶束中，其中，药物纳米结晶为齐墩果酸纳米结晶；胶束为两亲性载体材料，所述两亲性载体材料的亲水端为硫酸软骨素，疏水端为柳氮磺胺吡啶，亲水端与疏水端以pH敏感键为连接键。
进一步的，所述纳米结晶与两亲性载体材料的质量比为1:5。
进一步的，所述pH敏感键为亚胺键，所述胶束为硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶，其结构式为：
一种纳米结晶胶束递药系统的制备方法，所述齐墩果酸纳米结晶的制备采用研磨法；
所述胶束的制备方法为：
S1：将4-甲酰苯甲酸溶于溶剂中，并加入催化剂活化；
S2：向步骤S1得到的溶液中加入亲水端硫酸软骨素溶液，与4-甲酰苯甲酸发生酯化反应；
S3：向步骤S2得到的溶液中加入3-氨基-1，2-丙二醇，并在常温下搅拌，发生席夫碱反应形成亚胺键；
S4：向步骤S3得到的溶液中加入疏水端柳氮磺胺吡啶，酯化反应得到硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶溶液；
S5：将硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶溶液透析，得到空白胶束溶液，后冻干得冻干粉末；
将制备好胶束溶解，获得空白载体溶液，并配置齐墩果酸纳米结晶溶液，将空白载体溶液与齐墩果酸纳米结晶溶液混合、超声并进行透析反应，透析完成后，离心取上清液，过滤，冻干保存，获得纳米结晶胶束。
进一步的，所述齐墩果酸纳米结晶的制备包括以下步骤：
S1：称取稳定剂与齐墩果酸并溶于去离子水中，并超声溶解；
S2：向步骤S1得到的溶液中加入氧化锆珠，通过磁力搅拌进行研磨，吸取纳米混悬浮液，得到齐墩果酸纳米结晶，将齐墩果酸纳米结晶冷冻干燥得冻干粉。
进一步的，所述稳定剂与齐墩果酸的质量比为2：1、1：1、1：2或1：5，所述稳定剂为泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、羟甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温80中的一种或多种。
进一步的，所述稳定剂为十二烷基硫酸钠，所述稳定剂与齐墩果酸的质量比为2:1；所述齐墩果酸的添加量为20mg，所述氧化锆珠的规格为0.5mm，所述氧化锆珠的用量为1-7ml；所述磁力搅拌的转速为500-2000r/min，研磨时间8-24h。
进一步的，所述胶束的制备方法中，步骤S1中，4-甲酰苯甲酸、溶剂甲酰胺、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)的添加量分别为30mg、3mL、60mg、40mg，活化时间为2-3h；
步骤S2中，将30mg硫酸软骨素溶于甲酰胺中并加热分散后，与4-甲酰苯甲酸发生酯化反应20-30h；
步骤S3中，3-氨基-1，2-丙二醇的添加量为50uL，搅拌反应时间为72h；
步骤S4中，疏水端柳氮磺胺吡啶的添加量为20mg；
所述透析为使用2000Da的透析袋透析24h。
进一步的，所述齐墩果酸纳米结晶与胶束的质量比为1:5。
进一步的，使用甲酰胺对胶束及齐墩果酸纳米结晶进行溶解。
一种纳米结晶胶束递药系统在制备肝病药物中的应用。
具体的，硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶的合成原理为：
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明示例的纳米结晶胶束递药系统，将难溶性药物齐墩果酸制备成药物纳米结晶，可提高药物溶解度和溶出速率，且采用的微型介质研磨法技术，操作简单，不涉及有机溶剂，不需要专门的设备，成本低；
2、本发明示例的纳米结晶胶束递药系统，硫酸软骨素作为CD44受体的天然底物，作为纳米载体时能够在给药时特异性的靶向于活化的肝星状细胞上，而不必修饰任何靶头；
3、本发明示例的纳米结晶胶束递药系统，纳米结晶具有载药量高、稳定性好等优点，将药物纳米结晶包载于胶束中，一方面可以实现对药物纳米结晶的表面进行修饰，使之具有靶向性等性能；另一方面可以通过胶束及纳米结晶的缓释效果，进一步提高药物在体内的滞留时间。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是齐墩果酸纳米结晶制备的单因素考察图；
图2是齐墩果酸原料药扫描电镜图；
图3是齐墩果酸纳米结晶扫描电镜图；
图4是两亲性载体材料的1H-NMR；
图5是本发明的纳米结晶胶束粒径图；
图6本发明的纳米结晶胶束电位图；
图7是本发明的纳米结晶胶束透射电镜图；
图8是纳米结晶胶束的体外释放图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
一种纳米结晶胶束递药系统的制备，包括：
1、齐墩果酸纳米结晶的制备与处方优化
(1)准备一只洁净的西林瓶，将磁转子加入西林瓶，称取适量稳定剂于西林瓶，加入2ml去离子水超声溶解，再称取齐墩果酸加入西林瓶超声分散，然后适量加入氧化锆珠，封口后通过磁力搅拌器带动氧化锆珠研磨数小时。研磨结束后用注射器将纳米混悬浮液吸取于EP管，后分五次取3ml去离子水于西林瓶洗涤，并将洗涤液一并加入EP管，即得齐墩果酸纳米结晶(OA-NC)。将齐墩果酸纳米结晶冷冻干燥得冻干粉。
(2)采用微型介质研磨法制备纳米结晶，通过对稳定剂的种类、稳定剂于药物的比例、研磨时间、氧化锆珠的用量、转速等因素进行单因素考虑。
具体的，稳定剂的种类筛选包括泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温80；所述齐墩果酸的添加量为15-24mg时，稳定剂与药物的比例筛选为(2：1)、(1：1)、(1：2)、(1：5)；氧化锆珠的规格为0.5mm，转速的筛选为500r/min、1000r/min、1500r/min、2000r/min；氧化锆珠的规格为0.5mm，氧化锆珠用量筛选1ml、2ml、3ml、5ml、7ml；研磨时间的筛选为2h、4h、6h、8h、12h、24h。
筛选结果如图1所示，结果得出纳米结晶的最佳处方工艺为：稳定剂为十二烷基硫酸钠(SDS)、稳定剂与药物比例：2：1、转速：2000r/min、氧化锆珠用量为3ml、研磨时间为24h。
2、胶束的制备
(1)将30mg 4-甲酰苯甲酸溶于3ml的甲酰胺得到4-甲酰苯甲酸溶液，后加入60mgEDC、40mg DMAP催化反应3h；
(2)将30mg亲水端硫酸软骨素溶于甲酰胺中，并加热分散，加入至(1)的溶液中，硫酸软骨素上的羟基与4-甲酰苯甲酸中的羧基发生酯化反应，反应24h后得到硫酸软骨素-醛基(CS-Ph-CHO)；
(3)加入50uL 3-氨基-1，2-丙二醇，CS-Ph-CHO结构中的醛基与3-氨基-1，2-丙二醇中的氨基发生席夫碱反应形成具有PH敏感的亚胺键(imine)，常温搅拌反应72h后得到硫酸软骨素-亚胺键(CS-Ph-C＝N-CH2CHOHCH2OH)；
(4)随后加入20mg疏水端柳氮磺胺吡啶(SAZ)，发生酯化反应得到硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶(CS-Ph-C＝N-CH2CHOHCH2-SAZ)(CIS)；
(5)将CIS放入2000Da的透析袋中透析24h，透析完成后离心取上清液进行冻干，得两亲性材料CIS冻干粉。
3、纳米结晶胶束的制备
(3)将两亲性材料CIS冻干粉溶于甲酰胺溶液，浓度为5mg/mL，获得空白载体溶液；配置齐墩果酸纳米结晶溶液(OA-NC)，溶剂为甲酰胺，浓度为1mg/mL；将等体积所述空白载体溶液与OA-NC溶液混合、超声，使用2000Da透析袋进行透析反应20-24h，透析完成后，离心取上清液，过滤、冻干保存，获得所述基于PH敏感的纳米结晶胶束(OA-NC@CIS)。
实施例一：
一、纳米结晶胶束的合成。
1、齐墩果酸纳米结晶的制备与表征。
以西林瓶作为研磨室，以磁力搅拌器为动力装置，采用0.5mm氧化锆珠作为研磨介质。将磁转子加入洁净的西林瓶，称取40mg SDS于西林瓶，加入2ml去离子水超声溶解，再称取20mg齐墩果酸加入西林瓶超声分散，然后加入3ml氧化锆珠，封口后通过磁力搅拌器以2000r/min搅拌研磨24h。研磨结束后用注射器将纳米混悬液吸取于EP管，后分五次取3ml去离子水于西林瓶洗涤，并将洗涤液一并加入EP管，即得OA-NC。将OA-NC冷冻干燥得冻干粉。
如图2所示，为齐墩果酸原料药扫描电镜图；如图3所示，为齐墩果酸纳米结晶扫描电镜图。
2、两亲性载体材料-硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶(CIS)的合成与表征。
(1)首先，精密称取30mg 4-甲酰苯甲酸、60mgEDC、40mgDMAP于西林瓶中，加入3mL的甲酰胺溶解活化三个小时；
(2)第二步，将30mg亲水端硫酸软骨素溶于甲酰胺中，并加热分散，加入至(1)的溶液中，硫酸软骨素上的羟基与4-甲酰苯甲酸中的羧基发生酯化反应，反应24h后得到CS-Ph-CHO；
(3)第三步，加入3-氨基-1，2-丙二醇50uL，CS-Ph-CHO结构中的醛基与3-氨基-1，2-丙二醇中的氨基发生席夫碱反应形成亚胺键，常温搅拌反应72h后得到CS-Ph-C＝N-CH2CHOHCH2OH；
(4)最后加入20mg SAZ(可先用甲酰胺将其溶解)，发生酯化反应得到CIS。
(5)得到CIS溶液后用2000Da的透析袋透析24h，得到空白胶束溶液，后冻干得冻干粉末备用。用1H-NMR对结构进行表征，如图4所示。
3、纳米结晶胶束的制备。
将CIS冻干粉溶于甲酰胺溶液，浓度为5mg/mL，获得空白载体溶液；配置齐墩果酸纳米结晶溶液，溶剂为甲酰胺，浓度为1mg/mL，将所述空白载体溶液与齐墩果酸纳米结晶溶液混合；使用截留分子量为2000Da的透析袋进行透析反应20-24h，透析完成后，离心取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，如图5，冻干保存，获得OA-NC@CIS。
二、纳米结晶胶束的表征
1、OA-NC@CIS的粒径和电位
将制备好的OA-NC@CIS过0.80μm的微孔滤膜，然后用粒度仪进行检测OA-NC@CIS的粒径以及电位，实验结果如图5、6所示。过0.8μm微孔滤膜后，粒径为206.7nm，且粒径均匀。
2、OA-NC@CIS电镜检测
将制备好的OA-NC@CIS采用铜网固定并且染色，用透射电镜拍摄OA-NC@CIS的外观形态如图7所示，由图可知，OA-NC@CIS为粒径大小与粒度仪测得的大小相符。
3、纳米制剂的载药量、包封率测定
通过高效液相色谱法测定OA-NC@CIS的包封率和载药量。将1mL制备好的纳米制剂用甲醇破乳，稀释成所需浓度，并过0.22μm的微孔滤膜，通过紫外分光光度法测定在波长为206nm处的吸光度，并按照公式计算纳米制剂的载药量和包封率。
载药量(％)＝(制剂中所包载药物的含量/制剂总质量)×100％；
包封率(％)＝(制剂中所包载药物含量/药物的初始加入量)×100％。
上述制备的载有齐墩果酸纳米结晶胶束的载药量为5.72±0.27％，包封率为63.97±2.95％。
4、纳米制剂体外释放实验
配置OA@CIS：将两亲性材料CIS直接与齐墩果酸进行混合，其制备方法与上述纳米结晶胶束的制备方法相同，即将两亲性材料CIS冻干粉溶于甲酰胺溶液，浓度为5mg/mL，获得空白载体溶液；配置齐墩果酸纳米溶液(OA)，溶剂为甲酰胺，浓度为1mg/mL；将等体积所述空白载体溶液与OA溶液混合、超声，使用2000Da透析袋进行透析反应20-24h，透析完成后，离心取上清液，过滤、冻干保存，获得OA@CIS。
将配置好的OA@CIS、OA-NC@CIS通过超滤管进行浓缩，然后将浓缩后的OA-NC@CIS精密量取1mL分别移至相同的透析袋(2000Da)中，平均分成3组(n＝3)。在离心管中加入PBS溶液，将这些透析袋分别放入到ph为5.5、6.5、7.5的PBS溶液中，随后将所有的离心管放在37℃的恒温振荡水浴(100r/min)中，不停震荡，以模拟人体微环境。在设定好的时间点，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，36，48h，每管取出1mL的释放介质样品，同时每个离心管补充1mL的相同状态的PBS。取出的PBS放于4℃冷藏备用。待所有的时间点的样品取完以后，将所有的样品过0.22um的水系滤膜，然后通过HPLC来测定每组样品中OA的量，计算累积释放率。实验结果如图8所示，实验结果表明，在pH＝7.5的释放介质，即模拟正常机体微环境的条件下，胶束释放较弱，累积释放量小于40％，说明该胶束在体内运输过程中泄露较少；而随着pH的降低，胶束的释放量随之增多，当pH达到5.5的微环境下，OA-NC@CIS药物累计释放率达到83.70％±1.38％且高于OA@CIS，由此证明纳米胶束具有较好的PH响应性，且OA-NC@CIS相对于OA@CIS提高了OA的释放量。
本发明合成了一种基于铁死亡机制的且具有pH微环境响应功能的两亲性聚合物，柳氮磺胺吡啶作为铁死亡的诱导剂，可以诱导活化的肝星状细胞死亡。齐墩果酸作为中药成分，抑制肝星状细胞的活化，制备成纳米结晶，提高了自身的生物利用度。胶束以硫酸软骨素为亲水端，特异性靶向活化态肝星状细胞，并利用纳米结晶具有长循环的特点，构建了更有效的齐墩果酸纳米结晶胶束递药系统。
本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (10)

1.一种纳米结晶胶束递药系统，其特征在于，该递药系统是将药物纳米结晶包载于胶束中，其中，药物纳米结晶为齐墩果酸纳米结晶；胶束为两亲性载体材料，所述两亲性载体材料的亲水端为硫酸软骨素，疏水端为柳氮磺胺吡啶，亲水端与疏水端以pH敏感键为连接键。
2.根据权利要求1所述的一种纳米结晶胶束递药系统，其特征在于，制备时，所述齐墩果酸纳米结晶与两亲性载体材料的质量添加量比为1:5。
3.根据权利要求1所述的一种纳米结晶胶束递药系统，其特征在于，所述pH敏感键为亚胺键，所述胶束为硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶，其结构式为：
4.一种权利要求1-3任一项所述的纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，
所述齐墩果酸纳米结晶的制备采用研磨法；
所述胶束的制备方法为：
S1：将4-甲酰苯甲酸溶于溶剂中，并加入催化剂活化；
S2：向步骤S1得到的溶液中加入亲水端硫酸软骨素溶液，与4-甲酰苯甲酸发生酯化反应；
S3：向步骤S2得到的溶液中加入3-氨基-1，2-丙二醇，并在常温下搅拌，发生席夫碱反应形成亚胺键；
S4：向步骤S3得到的溶液中加入疏水端柳氮磺胺吡啶，酯化反应得到硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶溶液；
S5：将硫酸软骨素-亚胺键-柳氮磺胺吡啶溶液透析，得到空白胶束溶液，后冻干得冻干粉末；
将制备好胶束溶解，获得空白载体溶液，并配置齐墩果酸纳米结晶溶液，将空白载体溶液与齐墩果酸纳米结晶溶液混合、超声，使用透析袋进行透析反应，透析完成后，离心取上清液，过滤，冻干保存，获得纳米结晶胶束。
5.根据权利要求4所述的纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，所述齐墩果酸纳米结晶的制备包括以下步骤：
S1：称取稳定剂与齐墩果酸并溶于去离子水中，并超声溶解；
S2：向步骤S1得到的溶液中加入氧化锆珠，通过磁力搅拌进行研磨，吸取纳米混悬浮液，得到齐墩果酸纳米结晶，将齐墩果酸纳米结晶冷冻干燥得冻干粉。
6.根据权利要求5所述的纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，所述稳定剂与齐墩果酸的质量比为2：1、1：1、1：2或1：5，所述稳定剂为泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、羟甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、吐温80中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，所述稳定剂为十二烷基硫酸钠，所述稳定剂与齐墩果酸的质量比为2:1；
所述齐墩果酸的添加量为20mg，所述氧化锆珠的规格为0.5mm，所述氧化锆珠的用量为1-7ml；所述磁力搅拌的转速为500-2000r/min，研磨时间8-24h。
8.根据权利要求4所述的纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，所述胶束的制备方法中，步骤S1中，4-甲酰苯甲酸、溶剂甲酰胺、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及4-二甲氨基吡啶的添加量分别为30mg、3mL、60mg、40mg，活化时间为3h；
步骤S2中，将30mg硫酸软骨素溶于甲酰胺中并加热分散后，与4-甲酰苯甲酸发生酯化反应24h；
步骤S3中，3-氨基-1，2-丙二醇的添加量为50uL，搅拌反应时间为72h；
步骤S4中，疏水端柳氮磺胺吡啶的添加量为20mg；
步骤S5中，使用2000Da的透析袋透析24h。
9.根据权利要求4所述的一种纳米结晶胶束递药系统的制备方法，其特征在于，所述齐墩果酸纳米结晶与胶束的质量比为1:5，使用甲酰胺对胶束及齐墩果酸纳米结晶进行溶解。
10.一种权利要求1-3任一项所述的纳米结晶胶束递药系统在制备治疗肝病药物中的应用。
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