CN111333786A - 基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法 - Google Patents

基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，这类聚两性离子的聚合物前药FA‑P(MPC‑co‑PEGMA‑BZ)‑g‑DOX具有较好的水溶性、较好的稳定性和生物相容性。聚(2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)的结构与细胞膜的结构相类似，利于聚合物前药胶束的跨膜运输，促进聚合物前药胶束的内吞作用，提高前药胶束的利用率。在肿瘤部位的微酸性环境中，希夫碱断裂，致使聚合物前药胶束快速释放出阿霉素原药，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本发明所使用的实验条件较为温和，操作简单，原料易得，易于纯化，适合工业化的生产。因而可以用作刺激敏感性抗肿瘤前药，并且将来具有较大的市场应用前景。

Description

基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法
本发明属于发明名称为基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法与应用、申请日为2018年3月27日、申请号为2018102602831发明申请的分案申请，属于产品制备方法部分。
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药、其制备方法及其作为前药的应用。
背景技术
根据中国2015年癌症调查报告显示，2015年我国癌症新发病例数及死亡人数分别为429.2万例和281.4万例，相当于平均每天12000人新患癌症、7500人死于癌症。近年来，众多科研工作者致力于研究用于治疗癌症的药物。
目前，临床上治疗癌症的方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗以
及免疫治疗等，手术治疗只能针对肿瘤部位明确的实体瘤早中期的治疗，而对于发生转移的肿瘤和晚期肿瘤起到的效果甚微。放疗只能针对实体瘤，而对转移性肿瘤无能为力，通过放疗抑制肿瘤增殖的过程中还会损伤正常组织。免疫治疗是利用人体内的免疫机制来对抗肿瘤细胞。目前，已报道的利用免疫疗法抑制肿瘤生长的方法尚在研究之中，其抑制肿瘤的能力还亟待提高。因此，发展行之有效的抗肿瘤药物是科研工作者的当务之急。
临床使用的抗肿瘤药物，如阿霉素、紫杉醇、喜树碱等，均为低分子量化合物，由于其水溶性差，血液清除快，药物靶向性差，对健康组织有较大毒副作用等问题，从而限制了这些化疗小分子药物的应用。
随着人类对肿瘤学、分子生物学、药学及化学等相关学科的不断探索，使得对抗肿瘤药物的研究有了长足的进步。通过对疏水性小分子抗癌药物前药化，可有效地解决上述问题。前药(prodrug)，也称药物前体、前驱药物等，是指药物经过化学结构修饰后得到，在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物、从而发挥药效的化合物。前药本身并没有生物活性或者活性很低，经过体内代谢后转变为具有活性的物质。这种方式可以延长药物在血液循环中的时间，降低毒副作用，有效提高药物的利用率。
理想的纳米药物体系在正常生理条件下应具有足够的稳定性，到达肿瘤部位后可以有效释放药物，其对特定的刺激具有响应性。这些刺激作用包括：pH值、光照、离子浓度、氧化还原介质等。一般而言，人体内不同组织及细胞器的pH值会有所差异，如：血液及正常组织部位的pH值一般为7.4，肿瘤及病变部位的pH值为6.5左右，而内涵体及溶酶体内的pH值为5.0～5.5。利用肿瘤细胞偏酸性微环境的内源性刺激响应性的特点，设计纳米药物体系的结构，能够得到更广泛的应用。
在现有技术中，已有一些关于酸敏感性的前药的报道。但是，作为聚合物前药，应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且具有较高的载药量和抗肿瘤效率。作为抗肿瘤前药，还应当具有下列特征：(1) 聚合物前药能够在水溶液中形成稳定的胶束，粒径分布均一。(2) 亲水性外壳能起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用。(3) 前药胶束在体内循环时，具有抗凝血和抗蛋白吸附的性能。(4) 聚合物前药胶束通过主动靶向到达肿瘤细胞时，聚合物前药的壳层结构既能提高聚合物前药的跨膜效率，又有利于聚合物前药胶束通过内吞作用快速进入细胞内，提高药物的利用率；由于肿瘤细胞内的pH值较低，导致聚合物前药胶束破坏，快速释放出抗癌药物，并作用于细胞核，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。
发明内容
本发明的目的是，提供一种基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药，该阿霉素前药具有良好的生物相容性和抑制肿瘤细胞增殖的能力，可用作制备抗癌药物。
本发明采用如下技术方案：
基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药，由下列化学结构式表达：
Figure 57583DEST_PATH_IMAGE001
式中，x为40～80，y为50～70。
本发明中，所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的数均分子量为1.0×104～3.0×104 g mol-1；聚合物-阿霉素前药具有两亲性。阿霉素药物分子与聚合物键合的酸敏感性的基团为亚胺；疏水性的阿霉素部分可以形成胶束的内核；含亲水性基团的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物形成胶束的壳层，起到稳定胶束的作用；前药结构中的希夫碱在酸性条件下可发生断裂，导致胶束被破坏，从而快速地释放出聚集在胶束内部的疏水性抗癌药物。
本发明还公开了上述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂、催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂和引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物；
（3）在缚酸剂的存在下，侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐在反应溶剂中通过希夫碱反应，得到基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药；
（4）基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药胺解得到含有巯基的聚两性离子前药；在惰性气体中，在引发剂存在的条件下，炔丙基叶酸与含有巯基的聚两性离子前药通过点击反应得到基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药。
上述技术方案中：
步骤(1) 中，惰性气体为氮气；吸水剂为N, N’-二异丙基碳二亚胺；催化剂为4-二甲氨基吡啶；聚乙二醇甲基丙烯酸酯、对醛基苯甲酸、N, N’-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(1～2)∶(1～5)∶0.5；
步骤(2)中，惰性气体为氮气；链转移剂为(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；反应溶剂为二甲基亚砜和水的混合物；(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯、偶氮二异丁腈引发剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯的摩尔比为1∶0.5∶(40～80)∶80；
步骤(3)中，缚酸剂为三乙胺、乙二胺、四甲基乙二胺、N, N-二异丙基乙胺中的一种；反应溶剂为二甲基亚砜和水的混合物；侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物、缚酸剂和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1∶(2～4)∶(50～80)；
步骤(4)中，惰性气体为氮气；引发剂为偶氮二异丁腈；将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、炔丙胺进行反应得到炔丙基叶酸；叶酸、炔丙胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶(1～3)∶2∶2；含有巯基的聚两性离子前药、偶氮二异丁腈和炔丙基叶酸的摩尔比为1∶(0.5～10)∶(0.5～2)。
上述技术方案中：步骤(1)中，酯化反应时，反应温度为20℃～40℃，反应时间为30h～60 h；步骤(2)中，可逆加成-断裂链转移反应的温度为50℃～80℃，时间为5 h～15 h；步骤(3)中，希夫碱反应时，反应温度为20℃～40℃，反应时间为30 h～60 h；步骤(4)中，点击反应时，反应温度为60℃～80℃，反应时间为15 h～40 h。
本发明还公开了一种基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药胶束及其制备方法，由上述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药制备得到，具体制备包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂、催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂和引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应，制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物；
（3）在缚酸剂的存在下，侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐在反应溶剂中通过希夫碱反应，得到基于两性离子的酸敏感阿霉素前药；
（4）基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药胺解得到含有巯基的聚两性离子前药；在惰性气体中，在引发剂存在的条件下，炔丙基叶酸与含有巯基的聚两性离子前药通过点击反应得到基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药；
（5）基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药在溶液（水或者缓冲液）中自组装，制备基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药胶束。
本发明还公开了一种基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药及其制备方法，包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂、催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂、引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物；
（3）在缚酸剂的存在下，侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐在反应溶剂中通过希夫碱反应，得到基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药。
本发明还公开了侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物及其制备方法，包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂、催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂和引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应，制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物。
本发明还公开了上述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药在制备刺激响应性以及靶向递送抗癌药物中的应用；上述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药胶束在制备刺激响应性以及靶向递送抗癌药物中的应用；上述基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药在制备刺激响应性和/或靶向递送抗癌药物中的应用；上述侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物在制备刺激响应性和/或靶向递送抗癌药物中的应用。
本发明中，上述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，具体可举例如下：
(1) 惰性气体条件下，利用酯化反应，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，以N, N’-二异丙基碳二亚胺为吸水剂和4-二甲氨基吡啶为催化剂，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
其中，聚乙二醇甲基丙烯酸酯、对醛基苯甲酸、N, N’-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比分别为1∶(1～2)∶(1～5)∶0.5；
所述甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯的化学结构式为：
Figure 913413DEST_PATH_IMAGE002
(2) 惰性气氛条件下，利用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合，以 (4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯(CEP)为链转移剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，以二甲基亚砜和去离子水为混合反应溶剂，通过可逆加成-断裂链转移聚合，制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物。
其中，(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯、偶氮二异丁腈引发剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯单体的摩尔比为1∶0.5∶80∶(40～80)；
所述侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物的化学结构式为：
Figure 375618DEST_PATH_IMAGE003
(3) 以二甲基亚砜和去离子水作为溶剂，在缚酸剂的存在下，用步骤(1)获得的侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐发生希夫碱反应，得到所述基于两性离子的酸敏感性的阿霉素前药；
所述侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物、缚酸剂和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1∶(2～4)∶(50～80)；
所述阿霉素盐酸盐的化学结构式为：
Figure 51319DEST_PATH_IMAGE004
(4) 以N, N-二甲基甲酰胺为溶剂，将叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶于N, N-二甲基甲酰胺中，加热至一定温度后，加入炔丙胺，反应结束后得到炔丙基叶酸；
其中，叶酸、炔丙胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比分别为1∶(1～3)∶2∶2；
所述炔丙基叶酸的化学结构式为：
Figure 381806DEST_PATH_IMAGE005
(5) 在碱性条件下，将聚两性离子前药端基的三硫代酯键进行胺解，形成巯基。在惰性气体中，以二甲基亚砜和去离子水作为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，加入炔丙基叶酸，通过点击反应得到具有叶酸靶向的酸敏感性聚两性离子前药；
其中含有巯基的聚两性离子前药、偶氮二异丁腈和炔丙基叶酸的摩尔比分别为1∶(0.5～10)∶(0.5～2)。
本发明首次利用可逆加成-断裂链转移聚合和点击反应相结合的方法，制备了聚两性离子及叶酸靶向的酸敏感前药；在水溶液中形成核壳结构的聚合物前药胶束，具有较好的稳定性。所制备的聚合物前药胶束具有酸敏感的特性，易于在肿瘤细胞环境中快速释放出原药，从而达到抑制肿瘤增殖的目的，并且制备方法简单，易于工业化生产。
进一步的技术方案，在步骤(1)～(5)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：
(i) 甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯的纯化：在反应结束后，过滤浓缩后，加入无水乙醚，分别利用1 mol/L HCl溶液、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水溶液进行萃取，每种溶液萃取三次。用无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯。然后通过柱层析进一步对所得到的粗产物进行提纯，以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，浓缩收集产物。将产物置于真空箱中干燥至恒重，得到淡黄色粘稠液体为甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
(ii) 炔丙基叶酸的纯化：在反应结束后，利用超纯水作为沉淀剂，缓慢滴加，出现深黄色沉淀，将沉淀用丙酮清洗三次，得到深黄色固体，将产物置于真空箱中干燥至恒重，得到炔丙基修饰的叶酸；
(iii) 基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的纯化：对于步骤(2)、(3)和(5)中，在反应结束后，用超纯水透析48～96 h，并利用氨水将透析水的pH值调至碱性；最后，将透析袋中所得到的溶液冷冻干燥，即可获得步骤(2)、(3)和(5)的产物。
上述技术方案中：步骤(i)中，所述石油醚和乙酸乙酯体积比为1∶0.5～2；步骤(iii)中，透析时采用截留分子量为7000 Da的透析袋，透析水的pH值为9～11。
本发明公开的基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX，可以在水溶液中自组装成前药胶束，疏水性阿霉素形成聚合物前药胶束的核，聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物形成前药胶束的壳层，能够防止胶束在体内循环过程中发生解离。阿霉素分子中的氨基与侧链带有醛基的聚合物通过希夫碱键连接，在弱酸性条件下，希夫碱键断裂，使胶束发生解离，快速释放出抗癌药物。
由于上述方法的实施，本发明与现有的技术相比，具有以下优点：
1. 本发明首次通过可逆加成-断裂链转移聚合、点击反应以及希夫碱反应相结合，制备了含有两性离子及叶酸靶向的酸敏感聚合物前药；可以控制分子量和载药量的大小，按需给药。
2. 本发明首次采用聚两性离子为聚合物前药胶束的壳层，具有较好的胶束稳定性，降低聚合物前药胶束的毒副作用，有利于促进前药胶束的跨膜运输，提高药物利用率。
3. 本发明利用点击反应将靶向分子叶酸键合到聚合物前药的末端，致使叶酸靶向的聚合物前药胶束能够与肿瘤细胞上的叶酸受体特异性结合，可介导聚合物前药胶束通过内吞作用进入肿瘤细胞内，可有效防止聚合物前药胶束被外排泵出细胞，增加药物的利用率。
4. 本发明的聚合物结构和聚合物前药的药物含量可有效控制，实验条件较为温和，操作简单，提纯方便，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例一中甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；
图2为实施例二中P(MPC-co-PEGMA-BZ)的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代重水；
图3为实施例三中炔丙基叶酸的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代二甲亚砜；
图4为实施例四中游离阿霉素以及P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX前药的高效液相色谱图。
图5为实施例四中叶酸与FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX的紫外光谱图；
图6为实施例六中FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束动态光散射曲线和透射电镜照片；
图7为实施例七中P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX形成的聚合物前药胶束在不同pH值的缓冲溶液中的药物释放曲线；
图8为实例八中FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX前药与原药阿霉素的抑制肿瘤细胞增殖性能测试图；
图9为实施例八中P(MPC-co-PEGMA-BZ)聚合物对L929细胞、HeLa细胞以及HepG2细胞毒性测试图；
图10为实施例九中HeLa细胞对叶酸靶向的FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX前药胶束，无叶酸靶向的P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX前药胶束以及游离阿霉素的内吞照片图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一：甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯(PEGMA-BZ)的合成
首先，在惰性气体气氛条件下，以甲基丙烯酸酯聚乙二醇(PEGMA-OH)和对醛基苯甲酸为原料，以N, N’-二异丙基碳二亚胺为吸水剂和4-二甲氨基吡啶为催化剂，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯(PEGMA-BZ)。具体合成方法如下：将放入搅拌子的250mL支管圆底烧瓶，在120℃烘箱中干燥24 h，取出，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连，将支管圆底烧瓶抽真空至室温后，再通入高纯氮气。在通气过程中，加入聚乙二醇甲基丙烯酸酯(10.0 g, 0.02 mol)、对醛基苯甲酸(6.0 g, 0.04 mol)原料，向支管圆底烧瓶加入100 mL干燥后的四氢呋喃(THF)溶剂；将N, N’-二异丙基碳二亚胺(10.1 g，0.04mol)、4-二甲氨基吡啶(1.22 g, 0.01 mol)和50 mL四氢呋喃(THF)加入恒压漏斗中。待完全密封后，将反应瓶和恒压漏斗转移至-5℃低温恒温反应浴中，缓慢滴加N, N’-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶。待滴加完毕，转移至30℃油浴中反应48 h。
反应结束后，除去反应产生的白色固体，将溶液浓缩至10 mL后，加入100 mL无水乙醚，分别利用1 mol/L HCl溶液，饱和NaHCO3溶液，饱和食盐水溶液进行萃取，每种溶液各萃取三次，并用无水硫酸钠干燥5 h后，浓缩后，得到粗产物甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；通过柱层析进一步提纯粗产物，以乙酸乙酯和石油醚(V/V=1/1)为洗脱剂，浓缩收集产物。将产物置于真空箱中干燥至恒重，得到淡黄色粘稠液体为甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯(PEGMA-BZ 12.5 g)，产率为78.1%，产物的核磁共振氢谱图见图1。
实施例二：聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物的合成
将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120 ℃烘箱中干燥24 h，取出，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连，将支管圆底烧瓶抽真空至室温后，再通入高纯氮气。在通气过程中，分别依次加入(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯(CEP)(10 mg, 0.038 mmol)、甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯(1.90 g, 3.04 mmol)和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(1.12g, 3.80 mmol)；向支管烧瓶中加入16 mL二甲基亚砜和去离子水(V/V=1: 1)混合溶液，再通入高纯氮气，抽真空，如此反复三次后充满氮气。搅拌待完全溶解，转移至70℃油浴中反应12 h。
迅速降温终止反应。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对聚合反应的溶液进行透析，透析时间为48 h，每6 h更换一次透析水，目的是除去未参加反应的单体。将透析液冷冻干燥，获得淡黄色的固体。即聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯) (P(MPC-co-PEGMA-BZ)，产率为76.0%，产物的核磁共振氢谱图见图2；其中，x为45～55，y为55～65。
实施例三：聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)前药的合成
向50 mL的单口瓶中依次加入P(MPC-co-PEGMA-BZ)(150 mg, 0.0025mmol)、阿霉素盐酸盐(80 mg, 0.147 mmol)和0.5 mL三乙胺，再加入10 mL等量的二甲基亚砜和去离子水(V/V=1: 1)，超声10 min后，转移至30℃油浴中反应48 h。待反应结束后，用超纯水透析72h，并利用氨水将透析水溶液的pH调至碱性，目的是透析出去未参加反应的游离阿霉素以及调至碱性环境，防止酸敏感性官能团断裂。最后，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到深红色的聚合物-阿霉素前药，称为P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX。产率为78.3%，产物的核磁共振氢谱图见图3。
实施例四：炔丙基叶酸的合成
向50 mL单口烧瓶中加入叶酸(1.0 g, 0.0022 mol)和15 mL溶剂N, N-二甲基甲酰胺，待完全溶解后，转移至0℃冰水浴中。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(440mg, 0.0025 mol)和N-羟基琥珀酰亚胺(260 mg, 0.0025 mol)，充分搅拌0.5 h。加入炔丙胺(124 mg, 2.25 mmol)/ N, N-二甲基甲酰胺（5 mL）溶液。将反应装置转移至30℃油浴中，继续反应24 h。
反应结束后，将反应液逐滴加入到100 mL水中，缓慢形成黄色粘稠状的沉淀，离心5 min，收集固体产物，并用100 mL丙酮多次清洗产物。将产物置于真空干燥箱中干燥至恒重，收集的产物即为炔丙基叶酸，产率71.2%。
实施例五：含有叶酸靶向的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)前药的合成
将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120℃烘箱中至少干燥24 h，取出，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连，将支管圆底烧瓶抽真空至室温后，再通入高纯氮气，在通气过程中，分别依次加入聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)阿霉素前药(100 mg, 0.0015 mmol)、炔丙基叶酸(7.37 mg, 0.015 mmol)和偶氮二异丁腈(5 mg, 0.030 mmol)。再向支管瓶中加入10 mL等量的二甲基亚砜和去离子水(V/V=1: 1)，再通入高纯氮气，抽真空，如此反复三次后充满氮气。搅拌待完全溶解后，转移至70℃油浴中反应12 h。
迅速降温，终止反应。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对溶液进行透析，透析时间为48 h，每6 h更换一次透析水。并用氨水将透析水溶液的pH值调为9～11。透析结束后，将透析液冷冻干燥，获得深红色的固体为基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药，即含有叶酸靶向的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)前药，称为FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX，产率为88.7%。其中，x为45～55，y为55～65。
采用UltiMate 3000高效液相色谱仪对阿霉素以及聚合物-阿霉素前药进行分析。样品测试时参数设置：柱温为30℃、流动相乙腈/超纯水（50/50 v/v），流速1 mL min-1,激发波长为254 nm。测试的样品用色谱纯的乙腈溶解。结果表明：阿霉素小分子药物的流出时间为5.2 min，而聚合物-阿霉素前药的流出时间为3.7 min。这说明聚合物-阿霉素前药中不含有游离的阿霉素，聚合物-阿霉素前药已成功制备。测试结果如图4所示。
采用紫外分光光度计(UV-vis)对聚合物前药中叶酸的含量进行计算。附图5 为叶酸和FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX的紫外光谱图。在波长220～400 nm 范围内，叶酸的最大吸收峰在283 nm，FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX在该范围内没有最大吸收峰，而FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX的最大吸收峰在278 nm，这是由于叶酸上助色基团的缘故，导致叶酸的吸收峰蓝移。通过计算可知，聚合物前药胶束中的叶酸含量为0.28%（wt%）。从而也可以证明含有叶酸靶向的聚合物被成功制备。
实施例六：采用直接溶解法制备聚合物前药胶束
将25 mg FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX聚合物前药溶解在pH 7.4缓冲溶液中，搅拌24 h后，使聚合物前药进行自组装。在25 mL的容量瓶中定容，从而得到浓度为1 mg/mL的前药胶束溶液。
附图6为FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX在超纯水中自组装形成胶束的透射电镜照片(A)和动态光散射曲线(B)；如附图6(A)所示，聚合物前药在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的纳米粒子形貌，附图6(B)为动态光散射测试对应胶束的粒径分布曲线，可以看出聚合物前药胶束平均粒径为100 nm。
实施例七：聚合物前药中阿霉素含量以及阿霉素的体外药物释放
使用UV-3150分光光度计测定所合成的聚合物前药中的DOX含量。测试前,利用1 mol/L盐酸溶液配置一系列不同浓度的阿霉素标准溶液，并将冻干后的聚合物前药溶于1 mol/L盐酸溶液中。稀释三个不同的浓度，并对前药中阿霉素的含量进行测定。通过拟合阿霉素标准曲线，测定出聚合物前药中阿霉素的含量为20.3%。
称取50 mg聚合物前药P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX，溶解在pH 7.4的缓冲溶液中，继续搅拌24 h，加入到50 mL容量瓶中并定容，从而得到浓度为1.0 mg mL-1的聚合物前药胶束溶液。取5 mL聚合物前药胶束溶液置于截留分子量为12000 Da的透析袋中，分别用30 mL不同pH值的缓冲溶液加入到放有透析袋的大离心管中，缓冲溶液分为两种：(1)磷酸缓冲液(pH 7.4, 10 mM)；(2)磷酸缓冲液(pH 5.0, 10 mM)。然后，将大离心管置于37.5℃的恒温振荡仪中，以160 r/min速度进行振荡。在设定的时间点，依次取出5 mL释放液并补加相应体积的缓冲溶液。每组实验进行3个平行实验，最后取平均值。取出的释放液用荧光分光光度计对DOX浓度进行测定。聚合物前药胶束在不同pH条件下的释放曲线如附图7所示，随着pH值的降低，药物释放速率明显快于正常生理条件下；同时，在pH 5.0缓冲溶液中药物累计释放率最大。从药物释放的趋势可以看出，该混合胶束具有明显的pH响应性，可以达到控制药物释放的目的。
实施例八：聚合物前药胶束抑制肿瘤细胞增殖性能测试
将人子宫颈癌细胞(HeLa cells)培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO2(相对湿度为90%)的培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中，培养24 h。用直接溶解法配置FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX聚合物前药(阿霉素浓度为150 μg mL-1)，将一系列不同浓度的胶束溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养4 h后，用酶标仪(Bio-Rad model 680)在570 nm下测量对应的吸光度。细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cell viability) (%) = [A]treated/[A]control × 100%，其中，[A]treated为(FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX)聚合物前药胶束存在下测得的吸光度，而[A]control为不含聚合物前药的情况下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如图8所示，与抗癌药物阿霉素相比，聚合物前药胶束中阿霉素浓度为50 mg L-1时，HeLa细胞的存活率为24%。因此，可以说明合成的聚合物前药具有抑制HeLa细胞增殖的能力。
附图9为P(MPC-co-PEGMA-BZ)聚合物对L929细胞、HeLa细胞以及HepG2细胞的毒性测试。结果表明，聚合物对L929细胞、HeLa细胞以及HepG2细胞的存活率均高于90%。这说明聚合物胶束具有较低的毒性和良好的生物相容性。
实施例九：细胞内吞测试
以HeLa细胞作为实验细胞，利用活细胞工作站的荧光显微镜，对前药胶束的体外细胞内吞效果进行观察。将HeLa细胞培养在含有10% FBS的DMEM培养基中，置于37.5℃、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中进行培养。将生长活跃期的细胞接种于Φ35 mm含有1 mL培养基的培养皿中，使其贴壁生长。取出后移除培养基，用PBS缓冲溶液洗三次，随后加入1 mL配制好的染料H33342，放入培养箱中培养30 min完成对细胞核的染色。取出后移除带有染料的培养基，用PBS溶液冲洗三次，确保将培养皿中残留的染料冲洗干净。然后在培养皿中加入1mL含有聚合物前药胶束的培养基（其中，有无叶酸靶向酸敏感前药胶束以及阿霉素浓度分别为4 mg•L-1），放入活细胞工作站的培养箱中用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光强度随时间的变化。图10显示了HeLa细胞在不同胶束或药物体系的内吞效果：（A）有叶酸靶向的FA-P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX酸敏感前药胶束；（C）无叶酸靶向的P(MPC-co-PEGMA-BZ)-g-DOX前药胶束；（B）游离阿霉素。这些结果表明：叶酸靶向的酸敏感性前药胶束比没有叶酸修饰的前药胶束进入HeLa细胞的速度更快；与游离阿霉素和无叶酸修饰的载药胶束相比，含有叶酸靶向的前药胶束更易进入HeLa细胞，荧光强度较高。
本发明采用2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，利用可逆加成-断裂链转移聚合的方法，得到侧链含有醛基的共聚物。该醛基与抗肿瘤药物阿霉素通过席夫碱反应，得到含有酸敏感性阿霉素前药。将得到的聚合物前药进行胺解，得到端基含有巯基的聚合物前药，通过点击反应与炔丙基叶酸反应，得到具有叶酸靶向的酸敏感阿霉素前药。
本发明中，聚2-甲基丙烯酸氧基乙基磷酸胆碱(PMPC)相比较PEG和PLA而言，具有较好的水溶性，作为胶束的外层具有较好的稳定性。此外，聚2-甲基丙烯酸氧基乙基磷酸胆碱的结构与细胞膜的结构类似，与细胞膜的融合性较好，促进细胞内吞作用。因此，将聚2-甲基丙烯酸氧基乙基磷酸胆碱构筑成聚合物前药胶束的壳层，在肿瘤细胞内释放出原药后，聚合物载体由于其良好的水溶性能够有效快速地被肾脏排出。对于聚合物前药胶束而言，通常是通过肿瘤组织透过性增强及滞留效应(EPR)来提高前药胶束的在肿瘤部位的聚集。但是，被动靶向受到较大的限制，本发明利用叶酸对聚合物前药胶束进行修饰，提高前药胶束与癌细胞表面的叶酸受体的特异性结合，可实现聚合物前药胶束对肿瘤的主动靶向。

Claims (5)

1.一种基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂、催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂和引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物；
（3）在缚酸剂的存在下，侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐在混合反应溶剂中通过希夫碱反应，得到基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药；
（4）基于两性离子的酸敏感阿霉素前药胺解得到含有巯基的聚两性离子前药；然后在惰性气体中，在引发剂存在的条件下，炔丙基叶酸与含有巯基的聚两性离子前药通过点击反应得到基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药；
所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药由如下化学结构式表达：
Figure 547602DEST_PATH_IMAGE001
式中，x为40～80，y为50～70。
2.根据权利要求1所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的数均分子量为1.0×104～3.0×104 g mol-1。
3.根据权利要求1所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，惰性气体为氮气；吸水剂为N, N’-二异丙基碳二亚胺；催化剂为4-二甲氨基吡啶；聚乙二醇甲基丙烯酸酯、对醛基苯甲酸、N, N’-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(1～2)∶(1～5)∶0.5；
步骤(2)中，惰性气体为氮气；链转移剂为(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯；引发剂为偶氮二异丁腈；反应溶剂为二甲基亚砜和水的混合物；(4-氰基戊酸)三硫代乙酸酯、偶氮二异丁腈引发剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯的摩尔比为1∶0.5∶(40～80)∶80；
步骤(3)中，缚酸剂为三乙胺、乙二胺、四甲基乙二胺、N, N-二异丙基乙胺中的一种；反应溶剂为二甲基亚砜和水的混合物；侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物、缚酸剂和阿霉素盐酸盐的摩尔比为1∶(2～4)∶(50～80)；
步骤(4)中，惰性气体为氮气；引发剂为偶氮二异丁腈；在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下，叶酸与炔丙胺进行反应，得到炔丙基叶酸；叶酸、炔丙胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶(1～3)∶2∶2；含有巯基的聚两性离子前药、偶氮二异丁腈和炔丙基叶酸的摩尔比为1∶(0.5～10)∶(0.5～2)。
4.根据权利要求1所述基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，酯化反应时，反应温度为20℃～40℃，反应时间为30 h～60 h；步骤(2)中，可逆加成-断裂链转移反应的温度为50℃～80℃，时间为5 h～15 h；步骤(3)中，希夫碱反应时，反应温度为20℃～40℃，反应时间为30 h～60 h；步骤(4)中，点击反应时，反应温度为60℃～80℃，反应时间为15 h～40 h。
5.一种基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）惰性气体条件下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯和对醛基苯甲酸为原料，在吸水剂和催化剂存在下，通过酯化反应得到甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯；
（2）惰性气体条件下，以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯为反应单体，在链转移剂、引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移反应制备侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物；
（3）在缚酸剂的存在下，侧链含有醛基的聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-co-甲基丙烯酸酯聚乙二醇对醛基苯甲酸酯)共聚物与阿霉素盐酸盐在反应溶剂中通过希夫碱反应，得到基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药；
（4）基于两性离子的酸敏感性阿霉素前药胺解，得到含有巯基的聚两性离子前药；在惰性气体中，引发剂存在的条件下，炔丙基叶酸与含有巯基的聚两性离子前药通过点击反应，得到基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药；
（5）基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药在溶液中自组装，制备基于两性离子及叶酸靶向的酸敏感性阿霉素前药胶束。
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