CN109568592B - 一种纳米凝胶ng1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米凝胶NG1，包括如式I所示的MOEMPoloxamer以及甲基丙烯酰普鲁兰多糖，MOEMPoloxamer的结构式如下：
Figure DDA0001896137450000011
其中，R为烷基；x为2‑10，y为31‑60，本发明以普兰尼克为起始原料合成MOEMPoloxamer，合成过程如下所示：
Figure DDA0001896137450000012
，合成MOEMPoloxamer后，将MOEMPoloxamer与甲基丙烯酰普鲁兰多糖制备成纳米凝胶NG1，同时本发明将上述制备得到的纳米凝胶NG1包载抗肿瘤药物如阿霉素，通过本发明公开的技术方案成功制备得到一种对环境更加敏感，释放更加快，治疗效果更佳的纳米凝胶NG1。

Description

一种纳米凝胶NG1及其应用
技术领域
本发明涉及药物载体制备领域，尤其涉及的是一种纳米凝胶NG1及其应用。
背景技术
癌症是威胁全球公共卫生健康主要问题之一。据统计，每年有近千万患者被诊断出癌症，目前人数仍在持续增加。癌症即通常所说的恶性肿瘤，其生物学特征主要有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等特点。
目前，癌症的治疗方式仍然采用传统手段，如手术、化疗、放疗。其中化疗是治疗癌症的主要手段之一，化疗主要利用化学药物(包括内分泌药物)治疗恶性癌症。其主要特点是给药方式简单多样、光谱性好、整体性治疗以及可多种药物协同给药等优点。然而常用的化疗药物在杀死癌症细胞的同时，也对人体的正常细胞有一定的毒副作用，尤其是对分裂、增殖，比较快的细胞如骨髓造血细胞.胃肠道粘膜上皮细胞等。同时化疗药物对肿瘤的选着性较差，甚至对正常的组织和器官具有很强的毒副作用。为了解决这一问题，将化疗药物与纳米载体结合，利用纳米载体进行药物输送以及控制药物的释放，以增强化疗药物的的最佳治疗效果。
纳米药物系统主要是指将药物或活性物质包埋或嵌入在纳米载体中，然后，基于增强滞留渗透效应，可以在肿瘤组织区缺被动富集，改变药物在体内的分布，延长药物的作用时间，实现最大化治疗、最小化毒副作用，最终实现药物在体内缓控释放。相比于传统的小分子化疗药物，纳米传递系统具有增强药物循环的稳定性、对机体毒副作用小、载药量较高、提高药物对细胞的渗透等作用。研究表明，酸性条件是肿瘤组织固有的生理指标以及从血管到癌细胞内部胞器间存在着明显的pH梯度变化。例如：在肿瘤的的外围环境其pH值为6.5，而内涵体和溶酶体的pH值为5.0至6.5之间，细胞质的pH值为7.4。因此，利用将能够对肿瘤组织和细胞相关的微环境刺激做出响应的模块整合到聚合物组装体中设计酸敏感的纳米药物载体，以增强药物的靶向效率，促进细胞的摄取，同时提高肿瘤组织和细胞内的药物浓度。
目前，酸敏感主要是依据离子基团的pKa值的变化，其包括一种是可质子化基团的化合物，如伯胺、羧酸、两性离子。另一种是各种对酸不稳定的聚合物，它们通常含有某些酸不稳定的化学键，如缩醛、缩酮、腙键、乙烯基醚、原酸酯等，这些化学键在中性及碱性条件下保持稳定，在特定的酸性条件下发生断裂。
相比各种酸敏感化学键，原酸酯基在酸性条件下降解速率更快、生物降解性更高，以及易于实现降解速率的精确调控。因此，有望通过合理的设计得到一种pH响应性的缓控释药物载体，在血液循环中能够稳定存在，而当靶向到病理部位被细胞内化后，作为对酸性环境刺激的响应，其物理化学结构发生改变，进而迅速释放药物，最终更快、更高效的起到肿瘤治疗的作用。
基于以上研究背景，通过pH敏感键的调控，制备一种治疗肿瘤的药物，意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种纳米凝胶NG1及其应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种纳米凝胶NG1，包括如式I所示的MOEMPoloxamer以及甲基丙烯酰普鲁兰多糖，MOEMPoloxamer的结构式如下：
Figure BDA0001896137430000031
其中，R为烷基；
x为2-10，y为31-60。
优选地，所述R为甲基。
上述MOEMPoloxamer的合成过程如下所示：
Figure BDA0001896137430000032
上述MOEMPoloxamer的制备方法包括以下步骤：
S1、式1-3所示化合物的制备：
依次称取如式I-1所示化合物、如式I-2所示化合物、对甲苯磺酰胺于反应器中，负压反应6-12h，反应结束后，反应液经萃取、干燥、浓缩后，得到浓缩物，将浓缩物置于NaOH-THF反应体系中，密封反应8-14h后，减压回收溶剂至干，浓缩物采用透析袋透析，冷冻干燥得到式1-3所示化合物；
S2、式I所示MOEMPoloxamer的制备：
依次称取如式1-3所示化合物、甲基丙烯酸酐、三乙胺于反应器中，加入二氯甲烷作为溶剂，常温反应6-12h后，反应液经萃取、浓缩，浓缩物采用透析袋透析，冷冻干燥得到式I所示MOEMPoloxamer。
优选地，所述步骤S1中，式I-2所示化合物、式I-1所示化合物、对甲苯磺酰胺添加量的摩尔比为3:1:2‰；浓缩物与NaOH添加量的摩尔比为1:4，四氢呋喃溶剂的加入量为80-100mL；
所述步骤S2中式1-3所示化合物、甲基丙烯酸酐、三乙胺添加量的摩尔比1:3:8，二氯甲烷加入量为90mL。
优选地，所述步骤S1以及步骤S2中的浓缩物均采用截留分子量为1000的透析袋，透析2-3天。
上述纳米凝胶NG1的制备方法如下：
称取甲基丙烯酰普鲁多糖50-150mg，以及量取15-30mL的缓冲液于反应器中，搅拌分散溶解后，往反应器中加入100-300mg的过硫酸钾溶解，加入50-150mL式I所示的MOEMPoloxamer，氮气保护下，于65-90℃条件下，油浴加热15-45min，反应结束后，反应液采用透析袋透析24h，冷冻干燥得到纳米凝胶NG1。
优选地，所述纳米凝胶NG1的制备方法如下：
称取甲基丙烯酰普鲁多糖100mg于反应器中，量取25mL的缓冲液，搅拌分散溶解后，往反应器中加入200mg的过硫酸钾溶解，加入100mL式I所示的MOEMPoloxamer，氮气保护下，于80℃条件下，油浴加热30min，反应结束后，反应液采用透析袋透析24h，冷冻干燥得到纳米凝胶NG1。
优选地，反应结束后，反应液采用截留分子量为14000的透析袋透析。
本发明同时公开上述纳米凝胶NG1在制备包载药物中的应用。
优选地，所述包载药物为抗肿瘤药。
优选地，所述抗肿瘤药为顺铂，卡铂，5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素、卡培他滨中的任一一种药物。
优选地，所述抗肿瘤药为阿霉素。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1)在具有增敏性化合物分子普兰尼克基础上引入具有pH敏感性的原酸酯键，使得对环境更加敏感，释放更加快，治疗效果更佳；
2)此发明所制备MOEMPoloxamer，其制备方法相对简单，经济实惠和易操作；
3)通过在纳米凝胶NG1的基础上，包埋一种或者多种的抗肿瘤试剂，这里我们选择具有广谱的抗肿瘤效果的阿霉素为模型药，通过静脉注射给药，从而达到更好的治疗肿瘤的效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中选取聚合物MOEMPoloxamer的1H-NMR图。
图2是本发明实施例1中MOEMPoloxamer的1H-NMR图。
图3是本发明实施例1中MOEMPoloxamer与甲基丙烯酰普鲁多糖的FT-IR检测谱图，
图3中d部分为甲基丙烯酰普鲁多糖FT-IR检测谱图，f部分为MOEMPoloxamer的检测谱图；
甲基丙烯酰普鲁多糖FT-IR检测谱图中，p代表普鲁兰多糖对照峰，q代表甲基丙烯酰普鲁兰多糖峰；
MOEMPoloxamer的检测谱图中，n代表MOEMPoloxamer峰，m代表式I-1所示的普兰尼克分子峰。
图4是本发明实施例2中选取制备NG1纳米凝胶以及其平均粒径、形貌图；
图4中，a表示NG1纳米凝胶的粒径与分布；b分别表示NG1的透射电镜图。
图5是本发明实施例3中选取的纳米凝胶NG1的pH降解的粒径变化；
图5中，a对应纳米凝胶NG1粒径的变化，b对应纳米凝胶NG1光散射强度变化结果。
图6是本发明实施例5中选取的纳米凝胶NG1包载阿霉素的体外药物在不同pH缓冲液中，阿霉素药物释放的能力数据图。
图7是本发明实施例6中选取的纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子的细胞毒性试验结果；
图7中，a、b分别为空白纳米凝胶NG1对H22和HepG2的细胞毒性；c、d，分别为FreeDOX和包载阿霉素的纳米凝胶对H22细胞24h、48h后的毒性；e、f，分别为Free DOX和包载阿霉素的纳米凝胶对HepG2细胞24h、48h后的毒性。
图8是本发明实施例7中选取的纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子后的定量摄取情况；
图8中，a、b为通过激光共聚焦拍摄HepG2和H22细胞对载药纳米凝胶摄取的定性分析结果。
附图9是本发明实施例8中选取的纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子后细胞凋亡情况；
图9中，a、b、c、d分别为空白对照，空白纳米粒子NG1，Free DOX，载药纳米粒子NG1/DOX，在H22细胞中凋亡的结果。e,f,g,h分别为空白对照，空白纳米粒子NG1，Free DOX，载药纳米粒子NG1/DOX，在HepG2细胞中凋亡的结果。
图10是本发明实施例9中选取的纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子后在小鼠体内的抗肿瘤效果；
图10中a、b、c、d分别为小鼠的体重，肿瘤的体积，肿瘤的重量，肿瘤(1,2,3,4分别为生理盐水，NG1，Free DOX,NG1-DOX样品组)的示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
MOEMPoloxamer、甲基丙烯酰普鲁兰多糖聚合物的结构表征：
用1H-NMR表征式I所示的MOEMPoloxamer结构，如图1所示；以及甲基丙烯酰普鲁兰多糖聚合物结构，如图2所示。
FT-IR表征式I所示的MOEMPoloxamer、以及甲基丙烯酰普鲁兰多糖聚合物结构，如图3所示。
1H-NMR检测方法如下：
称取2mg聚合物加入到EP管中，用氘代试剂溶解，加入到备用的核磁中，在核磁共振波普仪下检测质子的特征峰。
FT-IR检测方法如下：
将1～2mg样品与200mg纯KBr研细均匀，置于磨具中，在油压机的作用下压成薄片，然后放到傅里叶红外光谱仪中进行检测。
实施例2
普兰尼克，其结构通式如I-1化合物所示，以普兰尼克作为起始原料，经多步反应制备得到如式I所示MOEMPoloxamer。
MOEMPoloxamer的制备：
MOEMPoloxamer的合成过程如下：
Figure BDA0001896137430000081
MOEMPoloxamer的制备方法包括以下步骤：
S1、式1-3所示化合物的制备：
依次称取如式I-1所示化合物(10g)、如式I-2所示化合物(3.44g)、对甲苯磺酰胺(25.13mg)于反应器中，负压反应8h，反应结束后，反应液用二氯甲烷和饱和氯化钠进行萃取，有机相无水硫酸镁干燥、浓缩后，得到浓缩物，将浓缩物置于NaOH-THF反应体系中，其中，NaOH(2g)，THF 100mL，反应体系密封反应12h后，减压回收THF至干，浓缩物采用截留分子量为1000的透析袋，透析3天，冷冻干燥得到式1-3所示化合物(8g)。
S2、式I所示MOEMPoloxamer的制备：
依次称取如式1-3所示化合物(8g)、甲基丙烯酸酐(1.69g)、三乙胺(2.95g)于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷100mL作为溶剂，常温反应8h后，反应液以二氯甲烷、饱和氯化钠和10％碳酸钠体系进行萃取，有机相浓缩，浓缩物采用截留分子量为1000的透析袋，透析3天，冷冻干燥得到式I所示MOEMPoloxamer。
实施例3
纳米凝胶NG1的制备以及粒径和形貌测试：
纳米凝胶NG1制备方法如下：
称取100mg甲基丙烯酰普鲁多糖加入到100mL单口梨形烧瓶内，加入25mLpH为7.4的缓冲液，磁力搅拌使其充分溶解。向烧瓶内加入200mg过硫酸钾完全溶解后，加入式I所示MOEMPoloxamer 100mL，通入氮气保护后，80℃油浴锅加热搅拌30min。反应结束后，用截留分子量为14000的透析袋透析24h，冷冻干燥得到纳米凝胶NG1。
纳米凝胶NG1粒径和形貌测试方法如下：
取1mL制备成功的纳米凝胶NG1加入到纳米粒度仪(DLS)中，每一测试运行三次。按照同样的方法测定载阿霉素粒子的粒径。在通过透射电镜成像观察凝胶的形貌，检测结果如图4所示。
实施例3
纳米凝胶NG1酸降解探究
取5mL不同pH值的PBS缓冲液(pH为5、6.5和7.4)分散纳米凝胶NG1，室温下孵育。在设定不同的时间点通过DLS检测其粒径和光散射强度的变化。如图5所示。
实施例4
纳米凝胶NG1包载阿霉素
纳米凝胶NG1包载阿霉素的纳米粒子(NG1/DOX)的制备方法如下：
依据已报道文献中的方法，建立盐酸阿霉素标准曲线。在481nm下用酶标仪测定吸光度，绘制pH＝7.4缓冲液的盐酸阿霉素的标准曲线。
分别称取100mg空纳米凝胶NG1，充分溶解pH＝7.4的缓冲液中，在分别称取2mg盐酸阿霉素加入，维持溶液pH为7.4-8，避光搅拌反应8h。反应结束后，将两种载药的纳米粒子离心，取上清，收集沉淀。在481nm下检测上清吸光度，以标准曲线为参照，分别计算两种载药纳米凝胶NG1的载药量和载药效率。其载药量和载药效率如表1所示，
表1
Figure BDA0001896137430000101
载药量和载药效率的计算公式如下：
载药量(％)＝(阿霉素的投料质量-上清中阿霉素的质量)/干燥产物的总质量×100％
载药效率＝(阿霉素的投料质量-上清中阿霉素的质量)/阿霉素的投料质量×100％。
纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子粒径测试:
纳米凝胶NG1包载阿霉素粒子粒径测试方法与实施例2中纳米凝胶NG1粒径方法相同。
实施例5
纳米凝胶NG1包载阿霉素体外药物释放的研究
纳米凝胶NG1包载阿霉素体外药物释放的研究方法如下：
将收集的纳米凝胶NG1包载阿霉素的纳米粒子悬液分别取1mL于截留分子量为3500的透析袋中，用棉线扎紧透析袋，放入到50mL的EP管中，于EP管中加入6mL的缓冲液，pH分别为5.0，6.5和7.4，设3个重复，在37℃，120rpm条件下振荡，分别在设定的时间点取出缓冲液，并加入等量的新鲜缓冲液，然后测定其阿霉素浓度，然后计算阿霉素的释放量，结果如图6所示。
实施例6
载药纳米凝胶NG1体外细胞毒性试验
将人肝癌细胞(HepG2)和鼠肝癌细胞(H22)加入到96孔板中，通过细胞计数的方法，保证每孔细胞数目至少5,000个，细胞培养24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基以及20μl的配置好不同浓度的自由阿霉素或载阿霉素后粒子样品(12.5μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)，共培养24h后，然后去除培养基，加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT(5mg/mL)(H22细胞孔内无需弃旧培养基，直接加入20μl MTT溶液)共培养4h后，去除培养基，加入150μl的DMSO(H22细胞孔内无需弃旧培养基，直接加入150μl三联溶解液)，微型震荡仪震荡10min后，在570nm波长下检测每孔的吸光值。按照同样的方法测定空纳米载体NG1的细胞毒性，检测结果如图7所示。
实施例7
载药纳米凝胶NG1的细胞摄取
载药纳米凝胶NG1细胞的定性摄取制备方法如下：将人肝癌细胞(HepG2)和鼠肝癌细胞(H22)培养到对数生长期，恰当的稀释，将细胞加入到含有洁净的载玻片的无菌6孔板中，细胞培养24h后，去除培养基，加入1800μl的新鲜培养基，200μl的配置好的自由阿霉素或载阿霉素后粒子样品(40μg/ml)，共培养4h。终止培养，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗2-3次，加入100μl的4％多聚甲醛固定液，固定5min，用PBS缓冲液清洗2-3次，加入100μl的染核试剂Hoechst33258,避光下染核5min。弃去染色液，用PBS缓冲液清洗2-3次，最后加入1mL的PBS，取出载玻片，激光共聚焦下观察成像，成像结果如图8所示。
实施例8
载药纳米凝胶NG1的细胞凋亡
载药纳米凝胶NG1细胞的定性摄取制备方法如下：将人肝癌细胞(HepG2)和鼠肝癌细胞(H22)培养到对数生长期，恰当的稀释，将细胞加入到无菌6孔板中，细胞培养24h后，去除培养基，加入1800μl的新鲜培养基，200μl的配置好的自由阿霉素或载阿霉素后粒子样品(40μg/ml)，共培养24h，然后弃去培养基，用PBS清洗2-3次，加入500μl Binding Buffer,吹打混匀后，加入5μlAnnexinV-FITC，避光反应5min，最后加入5μl PI，转移至流式管中，用流式细胞仪检测成像，成像结果如图9所示。
实施例9
载药纳米凝胶NG1在小鼠体内的抗肿瘤效果
小鼠肿瘤模型的建立：将冻存的小鼠肝癌H22细胞复苏后，接种到ICR级小鼠腹腔内，待腹水生成后，再接种到每一只小鼠腋下，7天后选择肿瘤体积50mm3左右，体重为20-25g左右的小鼠为实验模型。
小鼠体内抗肿瘤效果：将建立的肿瘤模型小鼠随机分成6组，每组8只，通过尾静脉注射，分别注射生理盐水、空纳米载体凝胶、自由阿霉素(药量6mg/kg)以及载药纳米凝胶NG1(药量6mg/kg)。在7天内，每天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长径A和短径B，以及小鼠的体重，7天后，处死小鼠，取各组小鼠的肿瘤。计算小鼠肿瘤体积(体重)，绘制肿瘤体积(体重)生长曲线。其小鼠肿瘤体积计算公式：肿瘤体积＝B2×A/2。结果如图10所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种纳米凝胶NG1，其特征在于，包括如式I所示的MOEMPoloxamer以及甲基丙烯酰普鲁兰多糖，MOEMPoloxamer的结构式如下：
Figure FDA0001896137420000011
其中，R为烷基；
x为2-10，y为31-60。
2.根据权利要求1所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述R为甲基。
3.根据权利要求1或2所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，式I所示MOEMPoloxamer的合成过程如下所示：
Figure FDA0001896137420000012
4.根据权利要求3所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述MOEMPoloxamer的制备方法包括以下步骤：
S1、式1-3所示化合物的制备：
依次称取如式I-1所示化合物、如式I-2所示化合物、对甲苯磺酰胺于反应器中，负压反应6-12h，反应结束后，反应液经萃取、干燥、浓缩后，得到浓缩物，将浓缩物置于NaOH-THF反应体系中，密封反应8-14h后，减压回收溶剂至干，浓缩物采用透析袋透析，冷冻干燥得到式1-3所示化合物；
S2、式I所示MOEMPoloxamer的制备：
依次称取如式1-3所示化合物、甲基丙烯酸酐、三乙胺于反应器中，加入二氯甲烷作为溶剂，常温反应6-12h后，反应液经萃取、浓缩，浓缩物采用透析袋透析，冷冻干燥得到式I所示MOEMPoloxamer。
5.根据权利要求4所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述步骤S1中，式I-2所示化合物、式I-1所示化合物、对甲苯磺酰胺添加量的摩尔比为3:1:2‰；浓缩物与NaOH添加量的摩尔比为1:4，四氢呋喃溶剂的加入量为80-100mL；
所述步骤S2中式1-3所示化合物、甲基丙烯酸酐、三乙胺添加量的摩尔比1:3:8，二氯甲烷加入量为90mL。
6.根据权利要求4所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述步骤S1以及步骤S2中的浓缩物均采用截留分子量为1000的透析袋，透析2-3天。
7.根据权利要求1-6任一项所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述纳米凝胶NG1的制备方法如下：
称取甲基丙烯酰普鲁多糖50-150mg，以及量取15-30mL的缓冲液于反应器中，搅拌分散溶解后，往反应器中加入100-300mg的过硫酸钾溶解，加入50-150mL式I所示的MOEMPoloxamer，氮气保护下，于65-90℃条件下，油浴加热15-45min，反应结束后，反应液采用透析袋透析24h，冷冻干燥得到纳米凝胶NG1。
8.根据权利要求7所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，所述纳米凝胶NG1的制备方法如下：
称取甲基丙烯酰普鲁多糖100mg于反应器中，量取25mL缓冲液，搅拌分散溶解后，往反应器中加入200mg的过硫酸钾溶解，加入100mL式I所示的MOEMPoloxamer，氮气保护下，于80℃条件下，油浴加热30min，反应结束后，反应液采用透析袋透析24h，冷冻干燥得到纳米凝胶NG1。
9.根据权利要求8所述的纳米凝胶NG1，其特征在于，反应结束后，反应液采用截留分子量为14000的透析袋透析。
10.一种采用如权利要求1-9任一项所述的纳米凝胶NG1在制备包载药物中的应用。
11.根据利要求10所述的纳米凝胶NG1在制备包载药物中的应用，其特征在于，所述包载药物为抗肿瘤药。
12.根据利要求11所述的纳米凝胶NG1在制备包载药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药为顺铂，卡铂，5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素、卡培他滨中的任一一种药物。
13.根据利要求12所述的纳米凝胶NG1在制备包载药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药为阿霉素。
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