CN106432715A - 一种交替共聚物P(OE‑alt‑CL)的制备方法及其应用 - Google Patents
一种交替共聚物P(OE‑alt‑CL)的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种交替共聚物P(OE‑alt‑CL)的合成方法,以及该聚合物在药物传递领域的应用。本发明的交替共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性,用其制备的纳米微球药物载体能够利用pH引发药物缓慢释放,因此在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种交替共聚物P(OE-alt-CL)制备方法及其药物传递应用,属于聚合物合成及药物缓控释放技术领域。
背景技术
癌症作为威胁人类健康的主要疾病之一,其发病率及致死率不断升高。治疗癌症的手段主要包括手术切除、放疗、化疗。其中化疗在癌症治疗中占据着不可替代的地位。然而,在传统的抗肿瘤药物给药方式中,小分子药物往往具有代谢快,半衰期短,血药浓度低,无肿瘤靶向性等缺点,从而使得达肿瘤部位的药物很少,因此需要多次给药来提高肿瘤部位的药物浓度,以达到治疗的效果。一般的抗肿瘤药物对于癌细胞和正常细胞的毒性没有选择性,因此传统的给药方式给患者带来了较大的毒副作用。
为了解决上述缺点,纳米药物缓控释载体因其突出优点而在抗肿瘤研究中成为了热点。其优点主要包括如下几点:(1)纳米药物缓控释载体能够保护药物的活性,提高了药物的稳定性;(2)提高了药物在血液中的循环时间,这有利于药物在肿瘤部位聚集,减少给药次数,从而降低了患者的痛苦;(3)药物释放缓慢,减少了人体对药物的对抗作用,从而提高了药物的有效性和安全性;(4)通过主动靶向和被动靶向在肿瘤部位聚集。
在诸多纳米药物缓控释载体中,具有环境响应性的纳米药物载体被广泛研究,其中pH响应性纳米药物载体成为了研究者的宠儿。原酸酯键相比于其他酸敏感的化学键如缩醛、缩酮、乙烯基醚等具有更高的酸敏感性,可通过调节聚原酸酯的分子量以及疏水性来调控原酸酯的降解速度,从而调节药物的释放速率,因此有望通过合理的分子设计得到一种pH响应性的缓控释药物载体。
发明内容
一种交替共聚物P(OE-alt-CL),其结构如化学式I所示:
其中OE表示原酸酯;CL表示聚己内酯,其数均分子量为500-20000;n表示整数值10-120。
一种交替共聚物P(OE-alt-CL)的制备方法,具体步骤如下:将一种二氨基原酸酯单体(4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷))、聚己内酯二醇活性酯(NPC-CL-NPC),无水三乙胺和无水N,N-二甲基甲酰胺按摩尔比1:1:3:(20-50)加入到100毫升反应瓶中,通氮气常温反应3-5天后,用无水乙醚沉降3次,用乙酸乙酯洗3次,油泵负压干燥得到聚合物。
一种交替共聚物P(OE-alt-CL)的制备方法,所述聚己内酯二醇活性酯(NPC-CL-NPC)的制备方法如下:将聚己内酯二醇,对硝基苯基氯甲酸酯(NPC),无水三乙胺,无水二氯甲烷按摩尔比1:3:3:(50-200)加入到250mL的圆底反应瓶中反应过夜,NaH2PO4(0.4M)萃取两次后的粗产品用硅胶柱分离得到目标产物,其中所用洗脱剂是由摩尔比为二氯甲烷:甲醇=1:2.8-3的混合溶剂组成。
一种抗肿瘤纳米微球药物载体,包括上述的交替共聚物P(OE-alt-CL),以及抗肿瘤药物;其中所述的抗肿瘤药物选自喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶等。
一种抗肿瘤纳米微球药物载体,其制备方法如下:将交替共聚物P(OE-alt-CL),抗肿瘤药物,二氯甲烷按质量比5:1:(5-10)混合后缓慢滴加到4.8-5%聚乙烯醇水溶液中,超声后加入到0.26-0.3%聚乙烯醇水溶液中,室温搅拌3-5h,5000-15000rpm离心得到目的纳米微球药物载体,然后冻干保存。
本发明的优点是:
1、与传统的主链含原酸酯的聚合物的制备相比,其制备方法简单、高效、经济。
2、引入了生物相容性好的疏水性聚己内酯。
3、被包载在纳米微球中的药物的释放速率可控,并具有缓释的效果。
附图说明
附图1是实施例1中聚己内酯二醇活性酯NPC-CL-NPC的1H NMR。
附图2是实施例2中交替共聚物P(OE-alt-CL)的1H NMR。
附图3是实施例4中纳米微球药物载体平均粒径以及透射电镜观察的形貌,其中a,b为P(OE-alt-CL530)形成的纳米粒子NPs-1的粒径及形貌;c,d为P(OE-alt-CL2000)形成的纳米粒子NPs-2的粒径及形貌。
附图4是实施例6中纳米微球药物载体包载阿霉素后的体外释放结果。
附图5是实施例7中纳米微球药物载体包载阿霉素后定性检测细胞摄取结果。
附图6是实施例8中纳米微球药物载体包载阿霉素后定量检测细胞摄取结果。
附图7是实施例9中纳米微球药物载体包载阿霉素后的生理稳定性试验结果。
附图8是实施例10中纳米微球药物载体的细胞毒性试验结果,其中a为NPs-1和NPs-2的细胞毒性;b,c为NPs-1-DOX和NPs-2-DOX的细胞毒性;d为IC50。
具体实施方式
实施例1
聚己内酯二醇活性酯NPC-CL530-NPC的合成:
向500mL的两口瓶中依次加入3.2g(6.0mmol)分子量为530的聚己内酯二醇,3.65g(18.1mmol)对硝基苯基氯甲酸酯,1.83g(18.1mmol)三乙胺,200mL的二氯甲烷,氮气环境下搅拌反应过夜,NaH2PO4(0.4M)萃取两次,粗产品用硅胶柱(洗脱剂:二氯甲烷:甲醇=1:3)进一步纯化得到油状目的产物NPC-CL530-NPC 2.98g,产率57.34%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ,ppm):1.31-1.44(m,-CH2CH2CH2CH2CCOO-),1.56-1.73(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),2.28-2.39(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),3.68(t,4H,-CH2OCH2-),3.99-4.1,4.25-4.32(m,-OCOOCH2-),4.18-4.24(t,4H,-COOCH2-),7.36(d,4H,-CH=C-O-),8.26(d,4H,-CH=C-NO2)(图1)。
聚己内酯二醇活性酯NPC-CL2000-NPC的合成:
向500mL的两口瓶中依次加入2.4g(1.2mmol)分子量为2000的聚己内酯二醇,0.73g(3.6mmol)对硝基苯基氯甲酸酯,0.37g(3.7mmol)三乙胺,200mL的二氯甲烷,氮气环境下搅拌反应过夜,NaH2PO4(0.4M)萃取两次,粗产品用硅胶柱(洗脱剂:二氯甲烷:甲醇=1:3)进一步纯化得到油状目的产物NPC-CL2000-NPC 1.38g,产率49.25%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ,ppm):1.31-1.44(m,-CH2CH2CH2CH2CCOO-),1.56-1.73(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),2.28-2.39(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),3.68(t,4H,-CH2OCH2-),3.99-4.1,4.25-4.32(m,-OCOOCH2-),4.18-4.24(t,4H,-COOCH2-),7.36(d,4H,-CH=C-O-),8.26(d,4H,-CH=C-NO2)(图1)。
实施例2
交替共聚物P(OE-alt-CL530)的制备:
向50mL的反应瓶中依次加入1.72g(2.0mmol)聚己内酯二醇活性酯NPC-CL530-NPC,0.62g(2.0mmol)4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷),0.42g(4.1mmol)三乙胺,20mL的N,N-二甲基甲酰胺常温搅拌反应5天,用无水乙醚沉降3次,乙酸乙酯洗后,油泵负压干燥得到目的聚合物P(OE-alt-CL530)1.51g,产率87.22%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ,ppm):1.31-1.44(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),1.56-1.73(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),2.28-2.39(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),3.37(s,-NHCH2-),3.44-3.74(m,-CH2OCH2-,-NH CH2CH2-),3.76-3.88,4.11-4.17(m,-OCH2CH-),3.99-4.11(m,-OCOOCH2-),4.18-4.24(t,-COOCH2-),4.27-4.49(m,-CH2CH(O)CH2-),5.81(d,2H,CH-C(O)3)(图2)。
交替共聚物P(OE-alt-CL2000)的制备:
向50mL的反应瓶中依次加入0.94g(0.4mmol)聚己内酯二醇活性酯NPC-CL2000-NPC,0.12g(0.4mmol)4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷),0.08g(0.79mmol)三乙胺,20mL的N,N-二甲基甲酰胺常温搅拌反应5天,用无水乙醚沉降3次,乙酸乙酯洗后,油泵负压干燥得到目的聚合物P(OE-alt-CL2000)0.98g,产率92.41%。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ,ppm):1.31-1.44(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),1.56-1.73(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),2.28-2.39(m,-CH2CH2CH2CH2COO-),3.37(s,-NHCH2-),3.44-3.74(m,-CH2OCH2-,-NH CH2CH2-),3.76-3.88,4.11-4.17(m,-OCH2CH-),3.99-4.11(m,-OCOOCH2-),4.18-4.24(t,-COOCH2-),4.27-4.49(m,-CH2CH(O)CH2-),5.81(d,2H,CH-C(O)3)(图2)
实施例3
交替共聚物P(OE-alt-CL)的分子量及其分布的检测:
分别取两种聚合物用DMF溶解并保证聚合物浓度为2mg/mL,用孔径为0.45μm有机相滤头过滤后,通过Waters 1515GPC检测聚合物的分子量及其分布,其中以DMF为流动相,流速为1mL/min,进样量为60μL,结果如表1。
实施例4
纳米微球药物载体的制备
将20mg的聚合物加入到0.4mL的二氯甲烷中充分溶解后,在涡旋的条件下加入到0.8mL的5%的聚乙烯醇溶液中,然后立即超声(3次,每次10s,间隔5s,功率300W),超声后立即加入到20mL的0.3%的聚乙烯醇溶液中,搅拌3h,使二氯甲烷挥发。在10000rpm下,离心10min,用0.01M pH8.0的缓冲液再分散后。通过DLS和透射电镜检测纳米载体的粒径分布及形貌,结果如图3。
实施例5
包载阿霉素的纳米微球药物载体的制备
将20mg的聚合物和4mg的阿霉素加入到0.4mL的二氯甲烷中充分溶解后,在涡旋的条件下加入到0.8mL的5%的聚乙烯醇溶液中,然后立即超声(3次,每次10s,间隔5s,功率300W),超声后立即加入到20mL的0.3%的聚乙烯醇溶液中,搅拌3h,使二氯甲烷挥发。在10000rpm下,离心10min,用0.01M pH8.0的缓冲液再分散载药微球备用。其载药量和包封率(表2)计算公式如下:
载药量(%)=纳米粒子中阿霉素的量/载药纳米粒子的总量×100%
包封率(%)=纳米粒子中阿霉素的量/加入的总共阿霉素的量×100%
实施例6
纳米微球药物载体包载阿霉素后的体外释放检测
分别取阿霉素浓度为500μg/ml的纳米粒子1mL于截留分子量为8kD-14kD的透析袋中,用棉线扎紧透析袋,放入到50mL的EP管中,再在EP管中加入5mL的缓冲液,设3个重复,在37℃,100rpm条件下振荡,分别在30min、1、2、3........12、24、36、48......120h取出缓冲液,并加入新的缓冲液,然后检测缓冲液中的阿霉素浓度,然后计算阿霉素的释放量,释放结果如图4。
实施例7
纳米微球药物载体包载阿霉素后定性检测细胞摄取
将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)或者小鼠肝癌细胞(H22)加入到底部带有盖玻片的12孔板中,保证每孔105个细胞左右,培养过夜后,去除培养基,加入1.8mL新鲜培养基,0.2mL的自由阿霉素以及载药纳米粒子(最终阿霉素浓度都为8μg/mL)共培养4h后,去除培养基,PBS冲洗2次,4%多聚甲醛液固定细胞(5min左右),PBS冲洗2次,染核试剂染细胞核(5min),PBS洗2次,最后用激光共聚焦显微镜观察,结果如图5。
实施例8
纳米微球药物载体包载阿霉素后定量检测细胞摄取
将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)或者小鼠肝癌细胞(H22)加入到6孔板中,保证每孔2.5×105个细胞左右,培养过夜后,去除培养基,加入1.8mL新鲜培养基,0.2mL的自由阿霉素以及载药纳米粒子(最终阿霉素浓度都为8μg/mL)共培养4h后,去除培养基,PBS洗2次,胰酶消化,培养基终止消化后离心收集细胞,用1mL的PBS分散后用流式细胞仪检测,结果如图6。
实施例9
纳米微球药物载体包载阿霉素后的生理稳定性评估
将冻干载药纳米粒子分别用生理盐水,10mmol pH 7.4的PBS,胎牛血清再分散,并保持浓度为1mg/mL。分别在1、3、5、7、9天用DLS检测载药纳米粒子的粒径以及光散射强度,结果如图7。
实施例10
纳米微球药物载体的细胞毒性检测
将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)或者小鼠肝癌细胞(H22)加入到6孔板中,保证每孔浓度在4,000个左右,贴壁24h后,去除培养基,加入180μl的新鲜培养基,20μl的自由阿霉素或者载药纳米粒子(阿霉素浓度从0.5-16μg/mL)或者空白纳米粒子(浓度从31.25-1000μg/mL),共培养24h后,去除培养基,加入180μl的新鲜培养基和20μl MTT(5mg/mL)共培养4h后,去除培养基,加入150μl的DMSO,震荡10min后,在570nm波长下检测,结果如图8。
其中表1为:实施例3中交替共聚物P(OE-alt-CL)的分子量及其分子量分布。
表1
Polymer | Mn(×104) | Mw(×104) | PDI(Mw/Mn) |
P(OE-alt-CL530) | 2.2 | 3.81 | 1.73 |
P(OE-alt-CL2000) | 4.1 | 7.87 | 1.92 |
表2为实施例5中纳米微球药物载体包载阿霉素的载药量及包封率,其中NPs-1-DOX为NPs-1包载阿霉素后的纳米微球;NPs-2-DOX为NPs-2包载阿霉素后的纳米微球。
表2
Sample | DLC(%) | DLE(%) | Diameter(nm) | PDI |
NPs-1-DOX | 11.4 | 56.7 | 223.9 | 0.114 |
NPs-2-DOX | 16.2 | 78.5 | 278.7 | 0.119 |
Claims (5)
1.一种交替共聚物P(OE-alt-CL),其结构如化学式I所示:
其中OE表示原酸酯;CL表示聚己内酯,其数均分子量为500-20000;n表示整数值10-120。
2.一种权利要求1所述交替共聚物P(OE-alt-CL)的制备方法,其合成步骤如下:将一种二氨基原酸酯单体(4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷))、聚己内酯二醇活性酯(NPC-CL-NPC),无水三乙胺和无水N,N-二甲基甲酰胺按摩尔比1:1:3:(20-50)加入到100毫升反应瓶中,通氮气常温反应3-5天后,用无水乙醚沉降2-4次,用乙酸乙酯洗2-4次,油泵负压干燥得到聚合物。
3.根据权利要求2所述交替共聚物P(OE-alt-CL)的制备方法,其特征在于,所述聚己内酯二醇活性酯(NPC-CL-NPC)的制备方法如下:将聚己内酯二醇,对硝基苯基氯甲酸酯(NPC),无水三乙胺,无水二氯甲烷按摩尔比1:3:3:(50-200)加入到250mL的圆底反应瓶中反应过夜,NaH2PO4(0.4M)萃取两次后的粗产品用硅胶柱分离得到目标产物,其中所用洗脱剂是由摩尔比为二氯甲烷:甲醇=1:2.8-3的混合溶剂组成。
4.一种抗肿瘤纳米微球药物载体,其特征在于,包括权利要求1、2所述的交替共聚物P(OE-alt-CL),以及抗肿瘤药物;其中所述的抗肿瘤药物选自喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶等。
5.根据权利要求4所述的纳米微球药物载体,其制备方法如下:将交替共聚物P(OE-alt-CL),抗肿瘤药物,二氯甲烷按质量比5:1:(5-10)混合后缓慢滴加到4.8-5%聚乙烯醇水溶液中,超声2-3分钟,加入到0.26-0.3%聚乙烯醇水溶液中,室温搅拌3-5h,5000-15000rpm离心得到目的纳米微球药物载体,然后冻干保存。
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