CN103961750A - 一种小口径原位组织工程血管及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小口径原位组织工程血管及构建方法，方法为：(1)将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入聚己内酯二氯甲烷溶液中，反应，沉淀，干燥；(2)将聚乙二醇二胺二氯甲烷溶液加入到步骤(1)获得的沉淀物二氯甲烷溶液中，反应，沉淀，干燥后得到聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物；(3)采用静电纺丝技术，以聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合溶液，制备管型支架材料；(4)将管型支架材料浸入含EDC/NHS的肝素溶液，进行肝素化修饰，得到一种小口径原位组织工程血管。本发明的原位组织工程血管，具有与天然脉管相似的力学性能及良好的血液相容性；在体内逐步降解的同时允许自体细胞的长入；成品易于保存。
Description
技术领域
本发明属于生物材料与组织工程领域，涉及一种小口径原位组织工程血管及构建方法。
背景技术
心血管疾病是威胁人类健康的严重疾病。心血管疾病的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗和外科手术治疗三大类。当人体局部血管发生严重病变，不能保证血液的正常供应且不适于药物治疗和介入治疗时，则需进行外科血管移植治疗。在军事医学中，血管战创伤，尤其是四肢血管的战创伤是部队战时和平时的常见伤情，受伤原因主要包括炸伤、枪伤、机器致伤、车祸伤及刀伤等，受伤类型主要有血管完全或部分断裂、创伤性动脉瘤、创伤性动静脉瘘等，因此也常常需要外科血管移植治疗。
目前，临床上应用的血管移植物主要是自体血管，例如在冠脉搭桥术中用大隐静脉或胸廓内动脉替代冠状动脉。虽然自体血管手术效果较好，但常常因来源有限而面临无血管可用的问题。因此，人们不得不把目光集中到人工血管替代物上。目前临床上可得到的人工血管替代物多限于可膨性聚四氟乙烯(e-PTFE)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，即涤纶制成的人工合成血管。这些血管替代物用于中等直径(6-10mm，ID)和大直径的(＞10mm，ID)血管是比较成功的，但当用于小口径血管(＜6mm，ID)，易造成血栓形成和内膜增生，其有效性受到严重限制，远不能满足临床需要。
在体外模拟构建机体组织或器官，为器官缺损者提供移植替代物一直是人类追求的伟大理想之一，人们把这门科学称为“组织工程”。组织工程血管(TEBVs)是指模拟正常血管壁的细胞和细胞外基质(ECM)成分，制备、重建或再生血管。TEBVs的构建方法多种多样，但归纳起来，主要是两种策略，即“有支架构建法”和“无支架构建法”。有支架构建法是将种子细胞种植在管型支架材料上，在体外仿生生物反应器中得到功能性的活组织，然后植入体内。有支架构建法不但工艺复杂，成品难以保存，而且由于受到种子细胞来源、支架材料等多种因素的限制，真正实现临床应用还有很长的路要走。无支架构建法的特点是不采用外来支架材料，利用“宿主”自身细胞和其产生的细胞外基质，在仿生生物反应器中直接构建TEBVs。这种TEBVs由于不使用外源性细胞和支架材料，植入后不产生免疫排斥反应，因而有望于应用临床，但其制备过程更加复杂，整个生产过程需要4个月以上，不利于实现产业化和商品化。
随着生物可降解材料和组织工程支架制备工艺的不断发展，人们提出了原位组织工程血管的概念。但尚未有原位组织工程血管及制备方法报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种小口径原位组织工程血管。
本发明的第二个目的是提供一种小口径原位组织工程血管的及构建方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种小口径原位组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
(1)在0～4℃，搅拌条件下，将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入质量体积浓度为8％～10％的聚己内酯二氯甲烷溶液中，室温下反应2～4h，反应混合物放入0～4℃乙醚中沉淀，沉淀物真空干燥；所述吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、聚己内酯的质量比为1∶1～1.5∶3000，所述聚己内酯的分子量为40,000～100,000；
(2)以二氯甲烷为溶剂，分别配制质量体积浓度为50％～70％的聚乙二醇二胺溶液和质量体积浓度为6％～8％的步骤(1)获得的沉淀物溶液，在搅拌条件下，按体积比为1∶20～30的比例，将聚乙二醇二胺溶液一滴滴地加入到沉淀物溶液中，室温下反应12～24h，将反应混合物加入到0～4℃的乙醇中沉淀，真空干燥后得到聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物；所述聚乙二醇二胺的分子量为2000～6000；
(3)将外径为2～6mm的不锈钢管安装至静电纺丝旋转接收装置上，然后以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为1～3∶1～3聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成质量体积浓度为8％～10％的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术制备管型支架材料；
(4)以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制质量体积浓度为0.4％～0.6％的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入管型支架材料，于室温，60～80r/min搅拌条件下反应2～6h；用0.01mol/L PBS溶液浸泡肝素化的管型支架材料2～4h，其间换所述PBS溶液3-6次，再用蒸馏水浸泡2～4h，其间换蒸馏水3-6次；真空干燥，消毒灭菌后得到一种小口径原位组织工程血管，所述EDC与肝素的质量比为1∶1～2，EDC与NHS质量比为1～2∶1，所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
上述方法构建的一种小口径原位组织工程血管。
本发明的优点：
本发明首次尝试了以聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物、PTMC为生物可降解材料构建小口径原位组织工程血管，主要具有以下4方面的优点：(1)具有与天然脉管相似的力学性能，其断裂拉伸强度为3.0～7.0Mpa，断裂伸长率为20～40％，爆破强度为2000～3000mmHg，缝合强度为1.5～2.5N；(2)具有良好的血液相容性，溶血率在0.38％～0.60％范围内，均值为0.51％，凝血酶原时间、活化的部分凝血活酶时间分别为89.77±6.54s、15.74±0.86s；(3)能通过细胞介导的材料表面侵蚀作用发生逐步的降解，可以持续刺激巨噬细胞积聚，提供适当的慢性炎症反应环境，有利于自体干细胞和祖细胞在支架材料表面及内部的黏附和生长，体内植入3个月，自体细胞侵蚀约占管壁厚度的25％；(4)成品易于保存，适合工业化生产。
附图说明
图1为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯管型支架材料大体观。
图2为扫描电镜显示聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯静电纺丝片状材料表面形态特征。
图3为扫描电镜显示聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯静电纺丝管型支架材料横断面的形态特征。
图4为甲苯胺蓝染色显示肝素化后的聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯静电纺丝片状材料。
图5肝素-甲苯胺蓝络合物紫外-可见光吸收光谱，A：甲苯胺蓝与自由肝素结合；B：肝素化修饰聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯片状材料室温下浸入5mL甲苯胺蓝水溶液(0.1mol/L HCl，2g/L NaCl，0.4g/L甲苯胺蓝)4h。
图6为激光共聚焦显微镜显示聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯复合纤维材料表面内皮细胞生长情况。
图7为苏木素-伊红染色法显示小口径原位组织工程血管(实施例1制备)植入小鼠皮下组织1个月组织形态学变化。
图8为免疫荧光染色显示小口径原位组织工程血管(实施例1制备)植入小鼠皮下组织1个月，材料降解及周围CD68+巨噬细胞分布情况。
图9为苏木素-伊红染色法染色显示两种管型材料植入小鼠皮下组织1个月，内腔组织形态学变化，A：聚己内酯管型材料；B：小口径原位组织工程血管(实施例1制备)。
图10为免疫荧光染色显示小口径原位组织工程血管(实施例1制备)植入小鼠皮下组织1个月，内腔CD105+间充质干细胞及CD11+炎症细胞分布情况。
图11为苏木素-伊红染色法染色显示小口径原位组织工程血管(实施例1制备)植入小鼠皮下组织3个月组织形态学变化。
具体实施方式
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
本发明所涉及的EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。PCL-PEG/PTMC是聚己内酯-聚乙二醇二胺嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯的缩写
实施例1
一种小口径原位组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
(1)在2℃，搅拌条件下，将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入浓度为9％(w/v)的聚己内酯二氯甲烷溶液中，室温下反应3h，反应混合物放入2℃乙醚中沉淀，沉淀物真空干燥；所述吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、聚己内酯的质量比为1∶1.2∶3000，所述聚己内酯的分子量为70,000；
(2)以二氯甲烷为溶剂，分别配制浓度为60％(w/v)的聚乙二醇二胺溶液和浓度为7％(w/v)的步骤(1)获得的沉淀物溶液，在搅拌条件下，按体积比为1∶25的比例，将聚乙二醇二胺溶液一滴滴地加入到沉淀物溶液中，室温下反应18h，将反应混合物加入到2℃的乙醇中沉淀，真空干燥后得到聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物；所述聚乙二醇二胺的分子量为4000；
(3)将外径为4mm的不锈钢管安装至静电纺丝旋转接收装置上，然后以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为1∶1聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成浓度为9％(w/v)的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术制备管型支架材料，具体方法为：装入带有直径18G点胶针头的20ml注射器中，将带有2mm外径的不锈钢管安装至旋转接收装置上，进行静电纺丝，纺丝条件为：转速500rpm，电压25kV，针头喷嘴于收集装置距离20cm。微量注射器速度3ml/h，溶液体积2ml。电喷后从不锈钢管上小心取下聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物/聚三亚基碳酸酯管型支架材料，真空干燥24h，去除残留的有机溶剂和水分，密封包装，4℃保存待用；
(4)以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制浓度为0.5％(w/v)的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入管型支架材料，于室温，70r/min搅拌条件下反应4h；用0.01mol/LPBS溶液浸泡肝素化的管型支架材料3h，其间换所述PBS溶液4次，再用蒸馏水浸泡3h，其间换蒸馏水4次；真空干燥，消毒灭菌后得到一种小口径原位组织工程血管，所述EDC与肝素的质量比分别为1∶1.5，EDC与NHS质量比为1.5∶1。
实施例2
一种小口径原位组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
(1)在4℃，搅拌条件下，将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入浓度为8％(w/v)的聚己内酯二氯甲烷溶液中，室温下反应4h，反应混合物放入4℃乙醚中沉淀，沉淀物真空干燥；所述吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、聚己内酯的质量比为1∶1∶3000，所述聚己内酯的分子量为40,000；
(2)以二氯甲烷为溶剂，分别配制浓度为50％(w/v)的聚乙二醇二胺溶液和浓度为6％(w/v)的步骤(1)获得的沉淀物溶液，在搅拌条件下，按体积比为1∶20的比例，将聚乙二醇二胺溶液一滴滴地加入到沉淀物溶液中，室温下反应12h，将反应混合物加入到4℃的乙醇中沉淀，真空干燥后得到聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物；所述聚乙二醇二胺的分子量为2000；
(3)将外径为2mm的不锈钢管安装至静电纺丝旋转接收装置上，然后以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为2∶3聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成浓度为8％(w/v)的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术制备管型支架材料；真空干燥24h，去除残留的有机溶剂和水分，密封包装，4℃保存待用；
(4)以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制浓度为0.4％(w/v)的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入管型支架材料，于室温，60r/min搅拌条件下反应6h；用0.01mol/L PBS溶液浸泡肝素化的管型支架材料2h，其间换所述PBS溶液3次，再用蒸馏水浸泡2h，其间换蒸馏水3次；真空干燥，消毒灭菌后得到一种小口径原位组织工程血管，所述EDC与肝素的质量比分别为1∶1，EDC与NHS质量比为1∶1。
实施例3
一种小口径原位组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
(1)在0℃，搅拌条件下，将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入浓度为10％(w/v)的聚己内酯二氯甲烷溶液中，室温下反应2h，反应混合物放入0℃乙醚中沉淀，沉淀物真空干燥；所述吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、聚己内酯的质量比为1∶15∶3000，所述聚己内酯的分子量为100,000；
(2)以二氯甲烷为溶剂，分别配制浓度为70％(w/v)的聚乙二醇二胺溶液和浓度为8％(w/v)的步骤(1)获得的沉淀物溶液，在搅拌条件下，按体积比为1∶30的比例，将聚乙二醇二胺溶液一滴滴地加入到沉淀物溶液中，室温下反应24h，将反应混合物加入到0℃的乙醇中沉淀，真空干燥后得到聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物；所述聚乙二醇二胺的分子量为6000；
(3)将外径为6mm的不锈钢管安装至静电纺丝旋转接收装置上，然后以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为3∶1聚己内酯聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成浓度为10％(w/v)的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术制备管型支架材料，真空干燥24h，去除残留的有机溶剂和水分，密封包装，4℃保存待用；
(4)以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制浓度为0.6％(w/v)的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入管型支架材料，于室温，80r/min搅拌条件下反应2h；用0.01mol/L PBS溶液浸泡肝素化的管型支架材料4h，其间换所述PBS溶液6次，再用蒸馏水浸泡4h，其间换蒸馏水6次；真空干燥，消毒灭菌后得到一种小口径原位组织工程血管，所述EDC与肝素的质量比分别为1∶2，EDC与NHS质量比为2∶1。
实施例4
PCL-PEG/PTMC片状材料制备：
以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为1∶1聚己内酯-聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成浓度为9％(w/v)的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术，通过平板接收装置制备片层材料。真空干燥24h，去除残留的有机溶剂和水分，密封包装，4℃保存待用。
实施例5
肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料的制备
以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制浓度为0.5％(w/v)的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入实施例4制备的PCL-PEG/PTMC片状材料，于室温，70r/min搅拌条件下反应4h；用0.01mol/L PBS溶液浸泡肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料3h，其间换所述PBS溶液4次，再用蒸馏水浸泡3h，其间换蒸馏水4次；真空干燥，消毒灭菌后得到肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料，所述EDC与肝素的质量比分别为1∶1，EDC与NHS质量比为2∶1。
实施例6
对实施例1涉及的小口径原位组织工程血管及相关材料分别留取标本，依下述方法分别进行形态学、肝素含量、力学性能及生物相容性检测。
一、检测方法
(一)PCL-PEG/PTMC支架材料的形态学观察
将实施例4制备的PCL-PEG/PTMC片状材料和实施例1步骤(3)获得的管型支架材料入临界点干燥仪中干燥2h；离子溅射仪中喷金3min，于扫描电镜下观察各样品形态学特征，采用图像分析系统测量静电纺丝直径见图2和图3。
(二)肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料肝素含量的测定
1.肝素标准曲线的绘制：将0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2mg肝素钠分别溶解于2mL0.1mol HCl/0.2％NaCl液体中；加入2mL质量分数为0.0004的甲苯胺蓝至每个标本中，室温下反应4h形成肝素-甲苯胺蓝络合物，3000g离心10min，去除上清液，重复以上过程3次；以5mL4∶1乙醇与0.1mol/L NaOH混合液(V/V)溶解沉淀液，1∶10稀释后，于530nm处以分光光度计测吸光值。
2.肝素含量测定：将实施例5获得的片状材料室温下浸入5mL甲苯胺蓝水溶液(0.1mol/L HCl，2g/L NaCl，0.4g/L甲苯胺蓝)4h；形成肝素-甲苯胺蓝络合物之后，蒸馏水洗涤3次，每次1h，静置过夜；肝素-甲苯胺蓝络合物以5mL4∶1乙醇与0.1mol/L NaOH混合液(V/V)溶解，1∶5稀释后，于530nm处以分光光度计测吸光值，见图5。
(三)力学性能检测
1.断裂拉伸强度和断裂伸长率的检测：将各实施例中获得的小口径原位组织工程血管沿长轴切开，在Instron万能材料实验机上进行拉伸实验，记录断裂拉伸强度和断裂伸长率，检测原位组织工程血管抗拉伸能力和变形能力。
2.爆破强度测定：将各实施例中得到的小口径原位组织工程血管标本连接于爆破压测量表，游离端封闭，装置内充盈PBS液，调节加压螺栓压缩腔内的液体，记录管型材料爆破前所达到的最高压力，检测小口径原位组织工程血管对压力变化的耐受能力。
3.缝合强度测定：将各实施例中得到的小口径原位组织工程血管一端夹在Instron万能材料实验机上，另一端以6-0的尼龙缝合线连接于另一个夹具上，然后以1mm/min的速度匀速牵拉，记录完全断裂时的拉力，检测原位组织工程血管的可缝合性。
(四)生物相容性检测
1.血液相容性检测
1)溶血率测定：肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料与PCL-PEG/PTMC片状材料各5g，剪成5mm×20mm小条；新鲜健康志愿者静脉血与抗凝剂(枸橼酸葡萄糖缓冲液)按9∶1(体积比)均匀混合；该抗凝血再与生理盐水按1∶1.25(体积比)稀释，得到稀释抗凝血；按表1所示方法分组，并在各试管内分别加入试样、生理盐水或蒸馏水，将所有试管放入37℃温箱恒温30min，向各管分别加入稀释抗凝血0.2mL，轻摇混匀，37℃温箱中孵育60min，各管液体750g离心5min，以蒸馏水为参比，在波长545nm处测定上清液的吸光度。按公式HR＝(DtDnc)/(DpcDnc)×100％，式中HR为溶血率，Dt为试验样品的吸光度；Dnc为阴性对照的吸光度；Dpc为阳性对照的吸光度。
表1
2)凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)检测：取健康志愿者(10d内未使用过任何药物)的静脉血，按体积比9∶1比例加入含抗凝剂的塑料试管中，轻轻混合均匀；在4℃下，以300g离心20min，分离血细胞，得到富血小板血浆(PRP)然后将部分PRP在4℃下，以2000g继续离心20min，得到乏血小板血浆(PPP)；将实施例4、实施例5中获得的片状材料裁为10mm×10mm的小块10个，分别放入10个EP管中，滴加0.5ml PPP在37℃下孵育30min；从5个EP管中分别取50μL残留的PPP加入5个测试管中，分别加入50μL APTT试剂和0.025M CaCl2溶液50μL，37℃孵育3min，记录血浆凝固时间，对照组采用相同方法检测未与试样孵育的PPP；从剩余的5个EP管中分别取50μL残留的PPP加入5个测试管中，分别加入100μL PT试剂，记录血浆凝固时间，对照组采用相同方法检测未与试样孵育的PPP。
2.细胞毒性实验：以含10％胎牛血清的DMEM培养液为阴性对照，含0.64％苯酚的培养液为阳性对照；观察实施例4、实施例5中获得的片状材料浸提液(用含10％胎牛血清的DMEM培养液进行浸泡得到的浸提液)对Eahy926内皮细胞生长的影响，MTT比色法测定各组吸光度，按公式：细胞相对增殖率(RGR)＝实验组吸光度/阴性对照组吸光度×100％，计算细胞RGR。
3.内皮细胞种植实验：将圆形盖玻片贴于实施例4的平板接收装置上，采用实施例4的方法，获得载有PCL-PEG/PTMC片状材料的圆形盖玻片，并按实施例5的方法进行肝素化修饰，经紫外灭菌处理后，将载有PCL-PEG/PTMC片状材料的圆形盖玻片和载有肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料的圆形盖玻片放入24孔培养板中，于37℃，含10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡2h以上；取对数生长期的Eahy926细胞，胰酶消化成单细胞悬液并调整细胞浓度至2×105/mL，吸出培养板中残留培养液，以1ml/孔接种24孔培养板，置37℃，5％CO2培养箱中培养，每组设复孔6个，培养72h；0.01M PBS洗3次后4％PFA固定30分钟。PBS洗3次，0.3％TritonX-100渗透后，采用TRITC结合的鬼笔环肽孵育1h，用含有DAPI的荧光封固剂染核、封片，采用共聚焦显微镜观察Eahy926黏附生长情况。
4.体内埋置实验：BALB/c小鼠20只，0.4％戊巴比妥麻醉(4mg/100g)动物；切开小鼠背部皮肤，钝性分离脊柱两侧皮下组织，制备两个皮下组织囊；脊柱左侧植入实施例1制备的小口径原位组织工程血管(长1.5cm，内径2mm)，右侧植入相同大小的PCL管型材料作为对照；缝合皮下组织及皮肤；手术后动物于清洁级动物室常规饲养。每组动物于材料埋置1m、3m后，分别处死10只；取出材料及周围皮下组织，OCT包埋，冰冻切片5-7μm，HE染色观察异物反应、材料降解及细胞长入情况。免疫荧光方法检测材料及周围组织中炎性细胞(CD11b+)、巨噬细胞(CD68+)、间充质干细胞(CD105+)表达情况。
二、检测结果
(一)PCL-PEG/PTMC支架材料的形态学特征
PCL-PEG/PTMC管型支架材料大体观，如图1所示。扫描电镜检测结构表明，实施例4获得的PCL-PEG/PTMC片状材料和实施例1步骤(3)获得的PCL-PEG/PTMC管型支架材料表面形态有所不同。前者表面形态如图2所示，为随机排列的多孔隙样结构，纤维直径223±89nm。后者，纤维排列随机性下降，纤维间孔隙减小，如图3所示。
(二)肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料肝素含量的测定
甲苯胺蓝能与肝素及其它酸性糖类物质共轭形成络合物沉淀。PCL-PEG/PTMC片状材料经甲苯胺蓝水溶液浸染后呈淡蓝色，经摇动洗涤后可基本脱色；肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料经浸染后变为蓝色，如图4所示。肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料-甲苯胺蓝络合物可用碱性乙醇溶液重新溶解，因此可采用甲苯胺蓝法测定肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料中肝素的含量。紫外可见分光光度计光谱扫描显示，甲苯胺蓝溶液与肝素溶液、肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料形成的络合物的λmax均在540～560nm范围内，如图5所示。根据肝素-甲苯胺兰络合物稀释液的紫外吸收标准曲线，测得实施例5获得的肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料肝素含量为3.27±0.53mg/g。
(三)力学性能检测结果：以天然脉管为对照，小口径原位组织工程血管力学性能检测结果如表2所示，与天然脉管的力学性质具有较好的一致性。
表2
(四)生物相容性检测结果
1.血液相容性检测结果
1)溶血率测定：PCL-PEG/PTMC片状材料溶血率在0.13％-0.66％范围内，均值为0.44％；肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料溶血率在0.38％～0.60％范围内，均值为0.51％，均明显小于5％的溶血试验参考标准，可认为PCL-PEG/PTMC片状材料和肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料无溶血作用。
2)凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)检测结果：对照组APTT、PT分别为43.53±2.03s、11.97±0.77s；PCL-PEG/PTMC片状材料APTT、PT分别为40.03±2.96s、11.31±0.65s，与对照组无明显差异；肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料APTT、PT分别为89.77±6.54s、15.74±0.86s，与对照组相比都有一定程度的延长，以APTT增加幅度较大，提示肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料具有抗凝血作用。
2.细胞毒性实验结果：MTT比色法检测结果如下表所示。阴性对照组、PCL-PEG/PTMC片状材料及肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料组OD值之间无统计差异(P＞0.05)；阳性对照组与上述3组比较统计学差异明显(P＜0.01)。PCL-PEG/PTMC片状材料及肝素化修饰PCL-PEG/PTMC片状材料RGR分别为93.65，92.17，位于75～99之间，反应级别均为1，符合国家标准规定的安全性范围。
表3
注：**表示与阳性对照组相比，P＜0.01
3.内皮细胞种植实验：鬼笔环肽免疫荧光染色后，经共聚焦显微镜观察显示，培养72h，Eahy926细胞能够紧密粘附于PCL-PEG/PTMC片状材料和肝素化PCL-PEG/PTMC片状材料表面，细胞呈梭形或不规则的三角形，细胞充分伸展，细胞间间隙较小，基本融合成完整的内皮层，如图6A、B所示。细胞计数结果表明，两种材料表面粘附的细胞数量相似(P＞0.05)，无统计学差异。
4.体内埋置实验：小口径原位组织工程血管及PCL管型材料植入小鼠皮下组织1m后，HE染色显示，两种管型材料周围纤维结缔组织包囊都不明显，管壁的多孔结构容许自体细胞的渗入，PCL管型材料由于其结构较疏松，渗入细胞数量较多，约占管壁厚度的25％，小口径原位组织工程血管渗入细胞数量略少于PCL材料，约占管壁厚度19％，如图7所示；PCL管型材料未见可观察到的降解，而在小口径原位组织工程血管边缘可见侵蚀性降解及巨噬细胞积聚，降解后的材料由自体细胞填充如图8所示；在两种管型材料腔内可见积液，小口径原位组织工程血管积液内细胞成份较之PCL管型材料有较多细胞成份，如图9A、B所示；免疫荧光染色显示其内含有CD11b+炎性细胞和CD105+间充质干细胞，如图10所示。小口径原位组织工程血管和PCL管型材料植入小鼠皮下组织3m后，PCL管型材料自体细胞渗入数量未见明显变化，未见可观察到的材料降解，而小口径原位组织工程血管管壁自体细胞渗入数量明显增多，约占管壁厚度的25％，小口径原位组织工程血管随自体细胞的渗入而逐渐降解，如图11所示。
Claims (2)
1.一种小口径原位组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
(1)在0～4℃，搅拌条件下，将吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯加入质量体积浓度为8％～10％的聚己内酯二氯甲烷溶液中，室温下反应2～4h，反应混合物放入0～4℃乙醚中沉淀，沉淀物真空干燥；所述吡啶、对硝基苯基氯甲酸酯、聚己内酯的质量比为1∶1～1.5∶3000，所述聚己内酯的分子量为40,000～100,000；
(2)以二氯甲烷为溶剂，分别配制质量体积浓度为50％～70％的聚乙二醇二胺溶液和质量体积浓度为6％～8％的步骤(1)获得的沉淀物溶液，在搅拌条件下，按体积比为1∶20～30的比例，将聚乙二醇二胺溶液一滴滴地加入到沉淀物溶液中，室温下反应12～24h，将反应混合物加入到0～4℃的乙醇中沉淀，真空干燥后得到聚己内酯-聚乙二醇二胺嵌段共聚物；所述聚乙二醇二胺的分子量为2000～6000；
(3)将外径为2～6mm的不锈钢管安装至静电纺丝旋转接收装置上，然后以体积比为3∶1的二氯甲烷、N-二甲基甲酚胺的混合溶液为溶剂，以质量比为1～3∶1～3聚己内酯-聚乙二醇二胺嵌段共聚物与聚三亚基碳酸酯的混合物为溶质，配制成质量体积浓度为8％～10％的混合溶液，搅拌均匀，采用静电纺丝技术制备管型支架材料；
(4)以0.05mol/L，pH＝5.6的脂肪醇聚氧乙烯醚磺基琥珀酸酯二钠盐缓冲液为溶剂，配制质量体积浓度为0.4％～0.6％的肝素溶液；在肝素溶液中加入EDC和NHS，37℃下，活化肝素的羟基团10min，浸入管型支架材料，于室温，60～80r/min搅拌条件下反应2～6h；用0.01mol/L PBS溶液浸泡肝素化的管型支架材料2～4h，其间换所述PBS溶液3-6次，再用蒸馏水浸泡2～4h，其间换蒸馏水3-6次；真空干燥，消毒灭菌后得到一种小口径原位组织工程血管，所述EDC与肝素的质量比为1∶1～2，EDC与NHS质量比为1～2∶1，所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
2.权利要求1的方法构建的一种小口径原位组织工程血管。
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