CN111603611A - 一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法。本发明的目的在于公开了一种在体外较好地模拟体内血管搏动的力学微环境下，利用人血管壁种子细胞培养出管径大小可调的组织工程血管，克服现有技术制备的血管材料缺乏足够的弹性、力学性能较差的不足，并在此基础上，运用脱细胞技术去除细胞，维持组织工程血管原有胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和空间结构分布，使其力学特性及力学强度与脱细胞前相似；同时去除细胞后，大大降低其免疫排斥反应；该支架由人源细胞分泌的细胞外基质组成，胶原蛋白的组成及含量与原生血管相似，使其具有良好的顺应性和生物相容性，符合再生医学的基本要求；植入后具有较好的抗血栓形成的作用，满足血管移植后的通畅性要求。

Description

一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法，属于组织工程材料领域。
背景技术
心血管疾病是威胁人类健康的严重疾病。缺血性疾病，如动脉粥样硬化性心血管疾病，是全世界死亡率和发病率的主要原因之一。这些疾病导致了对血管移植物的持续需求，以解决重建或血管闭塞和动脉瘤等问题。随着移植血管外科手术的并发症、同种异体移植物的频繁短缺和大动物源性血管的免疫排斥反应等，在20世纪50年代首次引入了人工血管移植来替代闭塞的动脉血管。然而，尽管在药理学、材料学和设备制造各方面取得了进展，这些合成血管移植物的植入并未显著降低总死亡率和发病率。合成的小口径血管(直径≤6mm)移植物陆续表现出血管的顺应性和通畅率低，以及易感染等缺点。
组织工程血管支架材料目前主要面临的两个难题在于：1、体外静态条件下培养的小口径血管的胶原含量不足，且缺乏足够的弹性中膜支撑，力学强度弱，不能制备出具有与正常天然血管相似或相近的力学性能。2、单纯将可降解高分子材料植入体内后，自体细胞难以黏附生长，特别是内皮细胞，由此导致血管的远期通畅率较低。因此，寻求一种模拟体内心脏搏动力学微环境构建组织工程血管的方法是具有重大意义的。
细胞衍生基质管状支架可替换受损或患病的血管，作为血管移植物，其模拟正常血管细胞外基质成分、组合排列方式等，制备、重建或再生血管，且管径大小可调。支架材料的评判标准包括血管的高顺应性、强力学性能、低血栓性和再生重塑性，最终植入体内后能否成功的融合。为了培养较好的组织工程血管，重要的是要考虑血管的结构以及血管所处的微环境。
选取合适的种子细胞对于血管结构是十分关键的，如血管内膜中的内皮细胞可调节凝血、赋予内膜选择通透性并参与免疫细胞搬运。血管中膜是血管壁最厚的一层结构，主要含平滑肌细胞，可分泌胶原蛋白和弹性蛋白，而胶原蛋白的微观取向和纤维厚度决定了细胞外基质的宏观力学性能和嵌入细胞的行为，因此赋予血管一定的力学性能，起到维持血管张力的作用。同样血管外膜中成纤维细胞也可以分泌胶原蛋白和弹性蛋白，以维持血管的粘弹性，保证血管的生物力学性能。因此，种子细胞在满足具有增殖能力、避免免疫反应和可收获性的前提下，应保留原生血管中相关一种或多种细胞类型的合成作用以维持血管的生理功能，以形成与天然血管相似的组织工程血管。
体内的力学微环境对血管的力学性能的形成影响重大。生理状态下的血管搏动及血液流动引起的血管张力和剪切应力能够刺激内皮细胞和平滑肌细胞增殖迁移及分泌相应的生长因子，调节血管的屏障功能、胶原及弹性纤维的形成。因此，不考虑生物力学刺激因素，构建的血管将缺乏足够的力学强度，不能获得接近正常血管的组织结构及力学性能。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种细胞衍生基质管状支架及其制备方法，该细胞衍生基质管状支架能克服现有技术制备的血管材料缺乏具有生物活性的胶原蛋白，及与原生血管相当的胶原含量，且弹性、力学性能较差的不足。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种细胞衍生基质管状支架，所述细胞衍生基质管状支架为将细胞接种于可降解支架材料，施加力学刺激培养，获得具有良好力学性能的组织工程血管，然后进行脱细胞处理而得。
作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述细胞衍生基质由一种或多种种子细胞或细胞片层在特定微环境下分泌获得。
作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述细胞为人血管内皮细胞、人主动脉中膜平滑肌细胞、人主动脉外膜成纤维细胞、多能干细胞中的至少一种。
作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述种子细胞在静态及力学刺激状态下分泌细胞外基质，所述细胞外基质为胶原蛋白、弹性蛋白、葡糖氨基葡聚糖、蛋白聚糖、生长因子中的至少一种。
作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述可降解支架材料为聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚酐、聚氨酯、聚氨基酸-酪氨酸衍生聚碳酸酯中的至少一种。
作为本发明所述细胞衍生基质管状支架的优选实施方式，所述力学刺激通过容积泵及其驱动装置和拉力装置提供，所述力学刺激为周向或轴向的力学刺激。
基于力学微环境三维培养的细胞衍生基质管状支架的获得，首先构建力学微环境的培养系统，该系统包括搏动式和蠕动式的容积泵及其驱动装置和拉力装置，以施加周向和轴向的力学刺激，其中压力、频率参数可调，所用的泵包含罗叶泵、柏林泵、蠕动泵、注射器泵。
第二方面，本发明提供了上述细胞衍生基质管状支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)对可降解支架材料进行预处理：将可降解支架材料制成管状，两端分别与人工血管缝合固定，然后放入碱溶液中浸泡，随后用纯净水浸泡，冲洗干净，吹干备用；
(2)培养体系的组装及消毒：将未缝合的人工血管端和生物反应器相固定，并与循环管路系统连接，构成封闭的循环系统；
(3)将细胞接种于步骤(1)预处理后的可降解支架材料上，静置待细胞在可降解支架材料上黏附后，泵入完全培养基；
(4)静态培养1周，动态培养1～15周，得到组织工程血管，脱细胞处理后，即得细胞衍生基质管状支架。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述培养体系包括容积泵及其驱动装置和拉力装置，所述培养体系的内部环境为生物反应器，所述培养体系的外部环境为37℃恒温恒湿无菌培养箱和循环管路系统。
所述三维培养的内部环境即生物反应器的培养体系，在环形可降解材料上接种一种或多种组合细胞，静置待细胞黏附之后，加适量完全培养基，培养1～15周，期间定期给予换液维持细胞生长营养所需，随着可降解材料的逐步缓慢降解，允许接种细胞嵌入生长并分泌胶原蛋白、弹性蛋白、葡糖氨基葡聚糖、蛋白聚糖和生长因子等使血管保留三维结构和功能蛋白，并具备一定的力学性能。
所述三维培养的外部环境为37℃恒温恒湿无菌培养箱及具有良好且稳定密封性的循环管路系统(由BPT管以及相应的接头连接)，以确保培养体系的无菌性。
本发明生物反应器的材质包含玻璃、硅胶或有机合成材料，由生物材料铸模或3D打印制备而得。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述脱细胞处理为采用化学方法、物理方法、生物方法中的至少一种去除细胞及残留的核物质。
所述化学方法包括离子洗涤剂(CHAPS、SDS、Triton-100X、SodiumDeoxycholate)、醇和丙酮、酸和碱、低渗高渗溶液单组分及多组分联合使用；所述物理方法包括压力、机械磨损、震荡搅拌、超临界流体、冻融；所述生物方法包括胰蛋白酶、核酸酶、中性蛋白酶、胎牛血清、螯合剂-EDTA、EGTA。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，细胞衍生基质管状支架储存于4℃。
本发明的细胞衍生基质管状支架，脱细胞处理后，可进行材料改性，如肝素接枝、内皮化修饰、基因修饰等处理，以提高血管的抗血栓形成、抗血小板聚集，进而提高该支架植入后的远期通畅率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的目的在于较好地模拟了体内心脏搏动力学微环境，克服现有技术制备的血管材料缺乏足够的弹性、力学性能较差的不足，培养出管径(包括直径≤6mm小口径)大小可调的组织工程血管，并在此基础上，运用脱细胞技术去除细胞，维持组织工程血管原有胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和空间结构分布。
(2)本发明构建的组织工程血管脱细胞去除细胞后，可较大程度降低细胞衍生基质支架的免疫排斥反应，且由于该支架由人源细胞分泌的细胞外基质组成，支架的胶原蛋白的组成及含量与原生血管相似，使其具有良好的顺应性和生物相容性，植入后具有较好的抗血栓形成的作用，能够满足血管移植后的通畅性要求。
(3)本发明构建的组织工程血管基于力学微环境三维培养获得，可模拟体内血流动力学的环境，由此获得的组织工程血管经组织染色切片、双光子和二次谐波、电镜等观察具有与天然脉管相似的组织结构、成分和力学性能，能承受血流对血管壁的剪切应力和跨壁压力；在植入体内后，利于自体细胞的嵌入生长，同时脱细胞后具有多种血管生成相关生长因子连接位点，有利于负载生长因子诱导内皮细胞在表面的粘附及生长，减少血栓的形成。
附图说明
图1为本发明细胞衍生基质管状支架制备方法的流程图。
图2为本发明力学微环境下培养体系的二维平面图，其中，1-容积泵，2-生物反应器培养系统，3-PBS bag，4-磁力搅拌器，5-37℃恒温恒湿无菌培养箱，6-外力驱动装置。
图3为本发明制备过程中组织工程血管所处的力学微环境示意图。
图4为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管的大体实物及切片染色图，其中，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图；c、d、e图分别为组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图。
图5为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管的双光子二次谐波成像图，其中，a图为胶原纤维空间排列图，b图为弹性纤维的空间排列图。
图6为本发明基于人主动脉外膜成纤维细胞三维培养的组织工程血管的大体实物及切片染色图，其中，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图；c、d、e图分别为组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图。
图7为本发明组织工程血管脱细胞前后纤维排列的示意图。
图8为本发明基于人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管脱细胞前后的切片染色图，其中a、b、c图分别为脱细胞前组织工程血管的HE、Masson、EVG染色图；d、e、f图分别为脱细胞后细胞衍生基质的HE、Masson、EVG染色图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管
实验材料：人主动脉平滑肌细胞、聚羟基乙酸(PGA)
设备：心脏辅助循环容积泵及驱动装置、37℃恒温恒湿无菌培养箱
本发明细胞衍生基质管状支架制备方法的流程图如图1所示，本发明力学微环境下培养体系的二维平面图如图2所示，具体培养方法包括以下步骤：
(1)PGA支架的制备及预处理：将片状PGA环形缝合在内硅胶上或管状PGA，两端分别与人工血管缝合固定，将缝制好的支架放入碱溶液中浸泡数分钟，随后用纯净水浸泡冲洗干净，吹干备用。
(2)生物反应器内部组装：将PGA支架两端未缝合的人工血管端和生物反应器相固定，并与外管路BPT管连接，再连接容积泵和PBS bag，构成封闭的循环系统。本发明制备过程中组织工程血管所处的力学微环境示意图如图3所示。
(3)接种人主动脉平滑肌细胞：将制备好的平滑肌细胞悬液，接种在PGA支架上，盖上生物反应器并密封，静置数小时使细胞黏附。
(4)待细胞黏附后，通过换液孔加入完全培养基，静态培养1周后，打开容积泵驱动装置，调节培养参数，动态培养3周，期间定期给予换液维持细胞生长营养所需。
(5)培养完成后获取组织工程血管，并做HE、Masson、EVG染色，组织工程血管的胶原纤维及弹性纤维的空间排列情况图如图4所示，c、d、e图分别为HE、Masson、EVG染色图，组织切片染色结果显示平滑肌细胞分泌细胞外基质培养出的组织工程血管结构致密，有一定的空间分布差异，经4周培养富含蓝色的胶原纤维；如图5所示，二次谐波和双光子结果展示了组织工程血管的胶原纤维和弹力纤维空间的表达及排列情况，其中，a图为胶原纤维空间排列图，b图为弹性纤维的空间排列图。本发明组织工程血管的实物图如图4所示，其中，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图。
实施例2人主动脉外膜成纤维细胞三维培养的组织工程血管
实验材料：人主动脉外膜成纤维细胞、聚羟基乙酸(PGA)
设备：容积泵及驱动装置、37℃恒温恒湿无菌培养箱
具体培养方法包括以下步骤：
(1)PGA支架的制备及预处理：将片状PGA环形缝合在内硅胶上或管状PGA，两端分别与人工血管缝合固定，将缝制好的支架放入碱溶液中浸泡数分钟，随后用纯净水浸泡冲洗干净，吹干备用。
(2)生物反应器内部组装：将PGA支架两端未缝合的人工血管端和生物反应器相固定，并与外管路BPT管连接，再连接容积泵和PBS bag，构成封闭的循环系统。
(3)接种人主动脉外膜成纤维细胞：将制备好的人主动脉外膜成纤维细胞悬液，接种在PGA支架上，盖上生物反应器并密封，静置数小时使细胞黏附。
(4)待细胞黏附后，通过换液孔加入500ml完全培养基，静态培养1周后，打开容积泵驱动装置，动态培养3周，定期给予换液维持细胞生长营养所需。
(5)获取人主动脉外膜成纤维细胞三维培养的组织工程血管，并做HE、Masson、EVG染色，如图6所示，a图为组织工程血管的主视图，b图为组织工程血管的横截面图；c、d、e图分别为HE、Masson、EVG染色图，组织切片染色结果显示人主动脉外膜成纤维细胞分泌细胞外基质培养出的组织工程血管结构致密，有一定的空间分布差异，经4周培养富含蓝色的胶原纤维。
实施例3组织工程血管脱细胞处理获取细胞衍生基质及脱细胞效果评估
实验材料：实施例1中制备的人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管、CHAPS、EDTA、胎牛血清
设备：摇床
具体实验方法包括以下步骤：
(1)将人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管置于500ml玻璃试剂瓶，加入400ml的CHAPS-EDTA溶液中，密封，在37℃摇床中反应1～2h。
(2)转移人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管于PBS中，漂洗4～6次。
(3)接着转移人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管于酶中漂洗去除残留核物质。
(4)转移人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管于PBS中，漂洗4～6次。漂洗完成后，细胞衍生基质样本保存在4℃备用。
(5)取10mg人主动脉平滑肌细胞衍生基质，置于真空低温干燥仪中冻干过夜，取出称重取适量加入10ml木瓜酶缓冲液，60℃消化过夜，液体清亮为止；离心，取上清于96孔板中再与等体积quant-iT PicoGreen双链DNA反应液一起孵育；用多功能酶标仪以波长485nm的激发光和波长530nm的散射光测定荧光强度，DNA定量实验结果显示经上述处理细胞去除干净。
(6)取脱细胞后的人主动脉平滑肌细胞衍生基质，做HE、Masson、EVG组织切片染色，本发明细胞衍生基质脱细胞前后纤维排列的示意图如图7所示，实验结果图如图8所示，证实脱细胞是有效的，脱细胞后未见残留的细胞及核物质，且细胞衍生基质及主要成分保留完好。
实施例4细胞衍生基质支架的胶原蛋白含量测定
实验材料：人主动脉平滑肌细胞三维培养的组织工程血管，HydroxyprolineAssay kit(Colorimetric)试剂盒，6mol/L HCl(提取液)，10mol/L NaOH(调PH)
设备：离心机、水浴锅、酶标仪
具体实验方法包括以下步骤：
(1)将获得的人工血管称取约0.2g样品于离心管中，将其尽量剪碎以便消化。
(2)加入2mL的提取液煮沸，消化至没有可见大的团块。
(3)16000rpm室温下离心20min(若离心后仍有杂质，可通过过滤去除)。
(4)用10mol/LNaOH(约1mL)调节pH值至6-8范围内。蒸馏水定容至4mL，取上清待测。
(5)酶标仪预热后，使用Hydroxyproline Assay kit(Colorimetric)试剂盒在波长560nm处测得吸光值，根据标准品的浓度和OD值做出来的标准曲线方程计算出支架的胶原蛋白相对含量为30.348％±5.800％。
实施例5脱细胞后的人主动脉平滑肌细胞衍生基质植入成年比格犬体内
实验动物：比格犬。
实验药品及试剂：生理盐水、碘酊及酒精(消毒用)、脱毛剂、PBS、阿托品、多咪静+舒泰合剂(麻醉用药)、肝素钠、替利定(术后镇痛药物)、多巴胺、肾上腺素(抢救药物)、克赛(低分子肝素)，头孢曲松(术后抗凝使用抗感染药物)。
实验耗材：纱布若干、无菌手套、治疗碗若干、无菌手术衣、无菌手术单、10毫升注射器若干、留置针、弯针、普通缝线若干(3-0缝线、0号缝线)，7-0缝合线5包。
实验器械：有创血压心电监测仪、血氧饱和度监测仪、无影灯、B超机(带耦合剂)、电刀1、吸引器1、直钳1、弯钳1、手术刀1、刀片若干、拉钩(小)3、直剪2、眼科剪2、显微器械一套(16cm弯头显微持针器、显微弯剪、显微直剪、显微镊、显微弯钳、显微直钳4)、无损伤血管钳4、血管夹4、乳突牵开器2。
具体动物实验方案包括以下步骤：
(1)比格犬称重，颈部、腿部手术部位脱毛剂备皮，腿部静脉打留置针。
(2)麻醉：多咪静+舒泰合剂(5ml多咪静溶解舒泰50冻干粉)0.03ml/kg iv或0.05ml/kg im，直到实验动物麻醉满意，行有创股动脉压力监测。
植入细胞衍生基质管状支架前备皮，并全身肝素化处理，约100u/kg，保持ACT大于200s，不超过300s。1小时后复查，再追加肝素250u，复查ACT大于200s，不够的话继续追加，术中使用肝素盐水冲洗管腔。
(3)麻醉后，捆绑固定比格犬在手术台上，呈仰卧位，超声探查犬颈动脉走行、分支和皮下深度，为手术切口定位，观察血管是否通畅、管壁内膜是否增厚，以及测量血管内径和血流速度。
(4)常规手术部位消毒、铺巾，依照术前超声定位结果，切皮，钝性分离皮下组织，顺肌纤维走向分离肌肉，暴露颈动脉。
(5)选取分支较少的区域，分离结扎周围细小分支，注意血管保护。
(6)将待移植细胞衍生基质管状支架放入术野，评估并调整长度及口径。
(7)分别于近心端、远心端夹闭颈动脉，注入生理盐水使血管充盈，在合适部位完整剪断颈动脉，剪下3.5cm颈动脉，注意切口尽量垂直于长轴，同时处理血管两个残端；十分钟内予0.2ml肝素(100U/kg)iv
(8)将待移植血管移入术野，用7-0线连续外翻缝合，将细胞衍生基质管状支架两个断端与狗颈动脉两个断端分别行端端吻合，在第二个口吻合完成前，用细针注射器注入肝素盐水(0.8ml:100ml)，排尽待移植血管内气体。缝合要仔细、严密、无出血，吻合口确保通畅；术后予0.1ml肝素iv
(9)仔细检查吻合口，观察血管通畅情况及吻合口渗漏情况。
(10)术后前4小时内QH超声观察血流，管腔直径，4小时后每6小时观察超声一次。
(11)1个月后未见细胞衍生基质管状支架处有血栓形成，处死动物取出移植血管，血管内外大体照片观察，10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，染色(HE、Masson、EVG染色)。比格犬的动物实验，在术后4h的超声观察中,血流均匀充满管腔，未见血栓形成；在植入1个月以内，细胞衍生基质支架通畅且具有良好适宜的血流速度，未见动脉瘤形成和明显的狭窄，有一定程度的内皮细胞覆盖，说明血管壁重构及细胞衍生基质支架的再生能力强，生物相容性和稳定性好，但仍需实验研究观察中长期的效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述细胞衍生基质管状支架为将细胞接种于可降解支架材料，施加力学刺激培养，获得具有良好力学性能的组织工程血管，然后进行脱细胞处理而得。
2.如权利要求1所述的细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述细胞衍生基质由由一种或多种种子细胞或细胞片层在特定微环境下分泌获得。
3.如权利要求2所述的细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述细胞为人血管内皮细胞、人主动脉中膜平滑肌细胞、人主动脉外膜成纤维细胞、多能干细胞中的至少一种。
4.如权利要求2所述的细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述种子细胞在静态及力学刺激状态下分泌细胞外基质，所述细胞外基质为胶原蛋白、弹性蛋白、葡糖氨基葡聚糖、蛋白聚糖、生长因子中的至少一种。
5.如权利要求1所述的细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述可降解支架材料为聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚酐、聚氨酯、聚氨基酸-酪氨酸衍生聚碳酸酯中的至少一种。
6.如权利要求1所述的细胞衍生基质管状支架，其特征在于，所述力学刺激通过容积泵及其驱动装置和拉力装置提供，所述力学刺激为周向或轴向的力学刺激。
7.如权利要求1～6任一项所述的细胞衍生基质管状支架的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
(1)对可降解支架材料进行预处理：将可降解支架材料制成管状，两端分别与人工血管缝合固定，然后放入碱溶液中浸泡，随后用纯净水浸泡，冲洗干净，吹干备用；
(2)培养体系的组装及消毒：将未缝合的人工血管端和生物反应器相固定，并与循环管路系统连接，构成封闭的循环系统；
(3)将细胞接种于步骤(1)预处理后的可降解支架材料上，静置待细胞在可降解支架材料上黏附后，泵入完全培养基；
(4)静态培养1周，动态培养1～15周，得到组织工程血管，脱细胞处理后，即得细胞衍生基质管状支架。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述培养体系包括容积泵及其驱动装置和拉力装置，所述培养体系的内部环境为生物反应器，所述培养体系的外部环境为37℃恒温恒湿无菌培养箱和循环管路系统。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述脱细胞处理为采用化学方法、物理方法、生物方法中的至少一种去除细胞及残留的核物质。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，细胞衍生基质管状支架储存于4℃。
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