CN110464877A - 一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法，该制备方法采用TritonX‑100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备。通过形态学观察、超微结构观察、细胞毒性检测、生物相容性检测、复合体冰冻切片观察等方法对脱细胞神经支架的脱细胞效果进行评价。结果显示采用TritonX‑100加冻融酶的复合方法制备的脱细胞神经支架，脱细胞效果充分、支架三维空间结构完整、管道通畅，与细胞、组织相容性好，炎症反应轻微，细胞生长增殖状态良好，适合细胞的黏附生长，是一种理想的支架材料。

Description

一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法
技术领域：
本发明涉及一种脱细胞神经支架的制备方法及其效果评价方法，属于神经支架材料技术领域。
背景技术：
脊髓损伤是常见的高致残率疾病，不但危及患者生命，降低患者的生活质量，巨额的医疗费用给家庭和医疗卫生系统带来沉重的经济负担。因此，寻找有效治疗脊髓损伤的治疗措施迫在眉睫。随着组织工程学的发展,组织工程成为修复中枢神经系统损伤治疗的研究热潮，其关键是应用理想的支架材料，选择合适的种子细胞，结合促进细胞生长的信号因子，构建组织工程化复合体。支架是支撑细胞成长的框架材料，充当植入细胞的附着基质，可以促进细胞的黏附生长，因此选择合适的支架是组织工程应用的关键。
自体神经支架无免疫排斥反应，是脊髓支架的最佳来源，但是自体移植给患者造成二次创伤，增加了手术感染风险，还可能造成供体区的功能缺损，因此限制了其在临床中的广泛应用。研究者开始寻找、研发合适的支架材料来替代自体神经支架。理想的神经支架应该具有良好的组织、细胞生物相容性，利于细胞的黏附、生长，促进轴突的延伸以及对其进行导向作用的特性，从而达到和自体支架相似的功能恢复。
目前已有的支架材料主要包括：天然来源的支架材料和人工合成的支架材料。天然来源的支架材料，如细胞外基质成分（ECM），蚕丝蛋白，利于细胞黏附，其生物力学特性较差，可塑性不强。人工合成材PGA,PLA,PLGA是首批用于神经修复研究的合成支架材料，其物理特性包括具有一定的机械强度，柔韧性，可降解性，渗透性，这些特性可以使他们被优化制备成各种既定形式，但是合成支架材料具有一定的细胞毒性，且生物相容性较差，致使宿主出现较强的炎症应答。有的合成支架材料，虽然能与宿主达到免疫耐受，但与细胞相容性差，不利于细胞的黏附和组织修复。复合支架材料虽然弥补了单一合成材料的不足，但与正常的神经三维空间结构和理化性质还有一定的差距。
天然神经固有的空间形态能够介导再生轴突的延伸。商业化的组织工程化的支架通常是中空的导管，缺乏这种天然的结构空间，因此很多研究人员致力于模仿天然神经，赋予材料支架相似的空间构架，使再生的轴突更好的适应其内环境。制造仿生生物材料基质的常用方法是电纺技术。在体外，电纺支架被证明能够促进细胞的迁移，介导背根神经节轴突的伸展，电纺支架通常是由合成材料制作而成的，如PCL,PAN,PLLA,还有一些天然的材料，像蚕丝，胶原蛋白等。在体内，复合电纺纤维被证明在坐骨神经损伤动物模型中确实能促进轴突的再生，包括神经纤维数量，电活动及运动功能的恢复。这些研究证明支架制作中，与天然神经空间结构相似设计的重要性，其能协助再生轴突向损伤远端延伸前行。除空间构型，很多工程化的导管加入了一些细胞因子，如生长因子和黏附因子，如生长因子NGF，细胞外基质蛋白（ECM），层粘连蛋白。层粘连蛋白通过特殊的多肽序列以及整合信号来介导细胞的黏附、存活，再生轴突伸展，因此它在神经再生方面的功能已经被很好的研究。此外，层粘连蛋白还可以通过层粘连蛋白结合位点充当递送睫状神经营养因子（CNTF），脑源性神经营养因子（BDNF）的介质。在体研究发现，单纯的层粘连蛋白可以提高髓鞘化的轴突数量，通过层粘连蛋白结合位点控释CNTF能促进坐骨神经损伤后轴突再生及传导速度，控释BDNF、CTNF同样能提高大鼠面神经的复合肌肉动作电位（CMAP）。综上所述，生化因素的介入，如层粘连蛋白, CNTF,BDNF等会进一步促进功能修复。
上述各种仿生生物材料，在一定程度上确实能促进细胞的黏附，引导新生轴突的延伸，但制备工序复杂，成本较高，不适合在临床大力推广及应用。脱细胞神经支架，经过脱细胞处理，免疫原性细胞成分脱去，能有效避免免疫排斥反应，同时神经能够保留原有的大部分空间构架和重要的ECM蛋白，像层粘连蛋白，纤维黏连蛋白等，与脊髓神经元生长环境相似，能很好的引导新生轴突的延伸生长，研究发现，脱细胞神经支架具备的这两大优势能加强再生及功能恢复。脱细胞神经支架同样可以作为传递细胞和生长因子的平台，联合其他治疗措施，进一步加强轴突的再生和功能的恢复。
目前，制备脱细胞神经支架的方法很多，包括低温冻融法、辐射法、化学方法等。低温冻融法，通过反复的冻存溶解循环，杀死细胞，使其破裂形成细胞碎片，通过此方法制备的神经支架被证明无免疫原性，但是ECM蛋白成分破坏较为严重，同时残留的细胞成分会引起炎症反应。辐射法可以有效的杀死细胞，同时对ECM破坏较小，但同样不能去除所有的细胞成分。一些化学方法也被应用，旨在更加有效的去除细胞成分，1998年Sondel应用化学方法制备脱细胞神经支架，为支架的制备提供了新思路，但是Sondel的方法并没有将细胞去除干净，支架的空间结构破坏较为严重，之后Hudson在此基础上加以改进，但是制备的支架仍然不理想。
本发明拟在原有脱细胞神经支架的制备方法的基础上进行改良，发明出一种更为理想的脱细胞神经支架制备方法，为临床组织工程化桥接神经元治疗脊髓损伤提供合适的支架材料。
目前常用的脱细胞神经支架脱细胞效果的评价方法有细胞毒性、体外胶原酶敏感性、细胞相容性和植入后局部反应等方法，这些检测方法都较局限，不能全面反映支架的脱细胞效果。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种更为理想的脱细胞支架制备方法，具体的，是通过TritonX-100加冻融酶的复合方法来实现的，本发明还提供了一种验证脱细胞支架制备效果的评价方法。
本发明提供的技术方案如下：一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于采用TritonX-100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备，包括如下步骤：
1.1动物称重，以质量浓度3.5%的水合氯醛麻醉动物，待麻醉生效后，用体积浓度75%的乙醇浸泡消毒10-15min，切片，分离肌肉，无菌条件下切取双侧坐骨神经；将坐骨神经放于装有超纯水的培养皿中，室温下震荡24-25小时；
1.2在质量浓度0.5%的TritonX-100溶液中震荡36-37小时；
1.3然后转入液氮中反复冻融5-6次；
1.4将冻融后的坐骨神经移入装有胰酶的培养皿中，37℃过夜；然后用DNase-I、RNase-A进行处理，37℃ 2-2.5h；
1.5后转入蒸馏水中振荡、漂洗，每1-1.5小时换液1次；
1.6将坐骨神经取出，进行修剪定型，即为做好的脱细胞支架材料，转入PBS缓冲液中4℃，pH 7.2保存；
1.7脱细胞支架材料消毒处理：支架消毒剂选用质量浓度为0.1％的PAA；室温下，将脱细胞支架材料放入15ml离心管中，倒入新鲜配置的质量浓度为0.1％的PAA，浸泡消毒 3-3.5 h，超净台内无菌PBS震荡24-25h，毎2-2.5h换液一次，漂洗结束，封口膜封管，4℃保存备用。
一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于包括如下步骤：
A组（未处理组）：新鲜对照神经；
B组（TritonX-100 加酶组）：脱细胞神经支架；
C组（NaOH组）：脱细胞神经支架；
D组（TritonX-100加冻融酶组）：脱细胞神经支架；
2.1 脱细胞神经支架组织形态学观察
将各组神经进行HE染色处理，HE染色结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整；
2.2脱细胞神经支架超微结构观察
通过透射电镜、扫描电镜分别观察各组神经；
透射电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序；扫描电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间；
2.3脱细胞神经支架DNA含量测定
对各组神经进行DNA含量测定；
DNA含量测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除；
2.4 CCK-8细胞毒性检测
对各组神经进行CCK-8细胞毒性检测；
CCK-8测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；
2.5脱细胞神经支架细胞生物相容性测定
将各组神经进行细胞生物相容性测定；
细胞生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组），可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好；
2.6脱细胞神经支架组织生物相容性测定
将各组神经进行组织生物相容性测定；
组织生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）炎症反应轻微，可见炎症细胞极少；
2.7细胞支架复合体冰冻切片观察
将各组神经的细胞支架复合体冰冻切片观察；
细胞支架复合体冰冻切片观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一；
2.8细胞支架复合体扫描电镜观察
将各组神经的细胞支架复合体扫描电镜观察；
细胞支架复合体扫描电镜观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间。
进一步地，于所述的脱细胞神经支架组织形态学观察的步骤如下：
A组（未处理组）的新鲜对照神经进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后采用OCT包埋剂进行OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片至10μm，冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：A组（未处理组）的新鲜对照神经，纵切面可见大量呈波浪状致密排列的神经纤维，细胞核蓝染，清晰明显，施万细胞长条状包绕轴突，轴突及髓鞘结构完好，未见细胞碎片；；横切面可见直径不一，排列紧密的类圆形轴突细胞，周围包绕施万细胞形成，神经内膜，外膜及神经束膜完整；髓鞘特异性染色甲苯胺蓝染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，横切面可见清晰蓝染的包裹轴突的髓鞘；免疫荧光Laminin染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，Laminin含量丰富，基底膜结构完好；
将B组（TritonX-100 加酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片至10μm，冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞部分去除，支架结构疏松，轴突及髓鞘等成分大部分脱失，但仍可见散在的细胞核及周边束膜、外膜；甲苯胺蓝染色结果显示，轴突和髓鞘大量残留；免疫荧光Laminin染色结果显示，Laminin部分保留，基底膜尚好；
将C组（NaOH组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分大部分去除，仍可见少量细胞核及细胞碎片，支架过于松散，出现不规则空洞；免疫荧光染色显示Laminin脱失较多，基底膜破坏较严重；
将D组（TritonX-100加冻融酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整。
进一步地，所述的脱细胞神经支架超微结构观察的步骤如下：
通过透射电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）；
透射电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%戊二醛前固定过夜，用质量浓度为0.1M的PB漂洗，然后用锇酸进行后固定，再用质量浓度为0.1M PB漂洗，酒精梯度脱水，然后经过丙酮置换，包埋剂梯度浸透，加热聚合，修块切片，行透射电镜观察；
透射电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经，轴突、髓鞘完整，施万细胞包绕致密，可见丰富细胞外基质成分如胶原蛋白和弹力蛋白；经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞大部分去除，但仍能见到部分残留；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞基本去除，但胶原成分、层粘连蛋白等丢失较多，纤维结构散乱，支撑功能不佳；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序；
通过扫描电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）；
扫描电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%的戊二醛固定过夜，用质量浓度为0.1M的PB漂洗3次，每次10-15min，酒精梯度脱水至100%，叔丁醇脱水15min，CO2临界点干燥，真空镀膜仪喷金，行环境扫描电镜观察；
扫描电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经可见其中神经纤维完整，神经束粗细不一，可见中央轴突及外周包绕的髓鞘；经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架轴突及髓鞘大部分去除，呈现管状通道，但基膜管欠通畅，空间结构欠规整；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突及髓鞘成分基本消失，管内无明显残留结构，但基膜管通部分塌陷，空间骨架结构破坏较重；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间。
进一步地，所述的脱细胞神经支架DNA含量测定的步骤如下：
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行DNA含量测定；
DNA含量测定步骤：1.分别取各组脱细胞神经支架30mg粉碎，并放入1.5ml离心管，加200μl Buffer TL；加25μl OB Protease 并震荡混匀，在55℃震荡水浴中孵育至组织完全溶解；2.10000 g离心5min沉淀去除不溶解的组织碎片，小心吸取上清液并转移到另外一个无菌离心管，不留有任何不溶解的碎片；3.加220μl Buffer BL并震荡混匀，70℃下孵育10min，加220μl 无水乙醇（室温，质量浓度为96-100%），并以最大震荡速度震荡15s； 4.在2ml收集管中放置HiBind DNA柱，把包括沉淀在内的所有溶解产物转移到柱内，8000 g离心1 min集结DNA，弃流过的液体；5.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用500μl Buffer HB吹打冲洗；8000 g离心1 min；弃滤过液及收集管；6.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用700μl乙醇稀释过的DNA Wash Buffer 吹打冲洗；8000 g离心1 min；弃滤过液，收集管在下一个步骤中重复利用；7.把柱放回步骤6中的2 ml 收集管，按上面的方法用700μl乙醇稀释过的DNA Wash Buffer 吹打冲洗，弃滤过液；8.把柱放回同一个的2ml 收集管，并以最大速度（大于12000g）离心空柱2min干燥柱；把柱放到1.5ml无菌离心管，加50-200μl 预热（70℃）的洗脱液，在室温下放置3min；从柱中洗脱DNA，10000 g离心1min，再加100-200μl洗脱液重复洗脱，Nanodrop测定DNA浓度；
DNA含量测定结果显示：A组（未处理组）神经DNA含量丰富，经过脱细胞处理，各组支架DNA有不同程度的降低，与正常对照组相比，B组（TritonX-100 加酶组）支架DNA，一半以上被脱除，C组（NaOH组）支架70%DNA被去除，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除；
进一步地，所述的CCK-8细胞毒性检测的步骤如下：
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行CCK-8细胞毒性检测；
CCK-8测定方法：1.胎盘间充质干细胞的培养：复苏胎盘间充质干细胞，加入含体积分数为10% FBS的DMEM/F12培养，待细胞生长平铺80-90%，2.5 g/L胰酶消化传代，调整细胞浓度为1×107/L，100μl/孔接种于96孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；2.脱细胞神经支架浸提液的制备：将各组脱细胞神经支架消毒灭菌后，按0.1g/ml无血清DMEM的比例置于15mlEP管中，封口膜封闭，37℃浸泡72 h，取出神经支架，将浸提液离心，取上清液加入体积分数为10% 的胎牛血清及青链霉素混合液备用；3. CCK-8检测脱细胞神经支架的细胞毒性：胎盘间充质干细胞培养24h，将96孔细胞培养板PBS洗涤2次，实验组加入 100μl脱细胞神经支架浸提液培养，对照组加入等量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液；分别于培养的1、3、5天，每组取5孔平行样，每孔加入10μl CCK-8液，继续培养4h，用酶标仪测定450 nm处吸光度，比较各组吸光度值有无差异；
CCK-8测定结果反应细胞数目及增殖趋势，与空白对照组相比，同一时间点，A组（未处理组）和D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组），细胞数目降低少，但无明显差异，细胞生长状态尚可，D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好，不同时间点，同组细胞之间，细胞数目显著增多，差异明显。
进一步地，所述的脱细胞神经支架细胞生物相容性测定的步骤如下：
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定方法：将各组脱细胞神经支架制备成5mm长的节段，置于培养皿中，和胎盘间充质干细胞共培养48小时，观察细胞的生长状态，取出共培养支架，固定脱水，行冰冻切片，HE染色，观察细胞与支架的黏附情况；
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定结果：细胞支架共培养48小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态，结果显示细胞胞体饱满，胞质均一，生长良好，细胞平铺80-90%，各组支架之间细胞生长状态无显著差异图；共培养支架取出固定后行冰冻切片，HE染色结果显示，B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架，细胞附着较少；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架，可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好。
进一步地，所述的脱细胞神经支架组织生物相容性测定的步骤如下：
脱细胞神经支架组织生物相容性测定方法：健康成年SD大鼠，雌雄各半，在严格无菌条件下，将消毒各组脱细胞神经支架植入大鼠背背肌肉内，分别于手术后第1、4周每组各取4只SD大鼠全身麻醉心脏灌注，切开皮肤肉眼观察植入部位组织反应的特异和程度；随后移植物取样，制备标本，记录组织病理学试验反应分级，评价生物学反应程度；
脱细胞神经支架组织生物相容性测定结果：术后各组大鼠活动正常，进食良好，切口处无红肿，感染或坏死；1周时打开肌肉，暴露移植物，各组支架被肌肉组织包裹，将移植物与周围肌肉同时取下，行冰冻切片，HE染色结果显示，A组（未处理组）炎症反应非常严重，镜下可见大量炎症细胞包裹神经，聚集成团；与A组比较，B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）炎症反应减轻，但仍可见较多炎症细胞浸润；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架炎症反应轻微，可见炎症细胞极少。
进一步地，所述的细胞支架复合体冰冻切片观察的步骤如下：
细胞支架复合体冰冻切片观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察细胞的黏附状况；
细胞支架复合体冰冻切片观察结果：倒置荧光显微镜显示A组（未处理组）新鲜未处理神经内几乎无细胞长入；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架显示细胞进入支架并存活生长，但数量不多，且细胞分布不均匀；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一。
进一步地，所述的细胞支架复合体扫描电镜观察的步骤如下：
细胞支架复合体扫描电镜观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行扫描电镜观察，检测细胞的黏附，生长及迁移状况；
细胞支架复合体扫描电镜观察结果： D组（TritonX-100加冻融酶组）支架细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间；B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）支架，细胞少量黏附生长；A组（未处理组）几乎无细胞长入。
本发明的有益效果是： 1．本发明运用TritonX-100加冻融酶的复合方法进行脱细胞支架的制备。本发明用TritonX-100加冻融酶的复合方法制作的脱细胞神经支架脱细胞效果充分，空间结构完整，与细胞、组织相容性好，适合细胞的黏附生长，具有良好的仿生空间结构及细胞相容性，是制作组织工程神经支架的一种理想方法，可以为临床组织工程化桥接神经元治疗脊髓损伤提供合适的支架材料。2. 本发明通过形态学观察、细胞毒性检测、生物相容性检测等方法对脱细胞神经支架的脱细胞效果进行评价。本发明通过光镜观察来判定脱细胞神经支架基底膜结构的完整性，通过超微结构观察来判定细胞去除情况和显微结构形态，通过神经支架DNA含量测定来判定DNA的去除情况，通过CCK-8细胞毒性检测、细胞共培养和组织移植来判定支架对细胞的毒性，检测指标可以更加全面、准确的判定脱细胞神经支架脱细胞的效果。
附图说明：
图1为本发明的脱细胞神经支架组织形态学观察图；
图2为本发明的脱细胞神经支架超微结构图；
图3为本发明的脱细胞神经支架DNA含量测定图；
图4为本发明的脱细胞神经支架CCK-8细胞毒性检测图；
图5为本发明的脱细胞神经支架细胞生物相容性测定图；
图6为本发明的脱细胞神经支架组织生物相容性测定图；
图7为本发明的细胞支架复合体冰冻切片观察图；
图8为本发明的细胞支架复合体扫描电镜观察图。
具体实施方式：下面结合实施例进一步描述本发明：
本发明中，首先进行脱细胞神经支架的制备，然后通过光镜、HE染色、甲苯胺蓝染色和Laminin免疫荧光染色进行形态学观察，通过支架DNA含量测定和CCK-8吸光度值测定进行细胞毒性检测、通过脱细胞神经支架体内植入，HE染色和扫描电镜的方法进行生物相容性检测的方法对脱细胞神经支架的脱细胞效果进行评价。
实施例1：脱细胞神经支架的制备
本发明采用TritonX-100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备。
实验动物：健康成年SD 大鼠，雌雄不限，体重180～200 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。
主要仪器设备：-80冰箱（海尔牌），回旋式恒温振荡器(上海聚莱实验仪器有限公司生产), 低温摇床（上海捷辰仪器有限公司生产），冰冻切片机（Leica品牌）。
主要试剂：Triton X-100,青霉素G、链霉素（下述具体步骤中没有提及，请补充） ,胰酶（Gibco）、液氮、DNase-I、RNase-A（sigma）、PBS缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司生产）、OCT包埋剂（莱卡）。
具体步骤：大鼠称重，以质量浓度3.5%的水合氯醛麻醉SD大鼠，待麻醉生效后，SD大鼠固定于大鼠板上，腹部朝上，用体积浓度75%的乙醇浸泡消毒10-15min，切片，分离肌肉，无菌条件下切取双侧坐骨神经；将坐骨神经放于装有超纯水的培养皿中，室温下震荡24-25小时；在质量浓度0.5%的TritonX-100溶液中震荡36-37小时；然后转入液氮中反复冻融5-6次；将坐骨神经移入装有胰酶的培养皿中37℃ 过夜；然后用DNase-I、RNase-A进行处理，37℃ 2-2.5h；转入蒸馏水中振荡、漂洗，在此期间，每1-1.5小时换液1次；将坐骨神经取出，进行修剪定型，即为做好的脱细胞支架材料，转入PBS缓冲液中4℃，pH 7.2保存。
结果观察：新鲜未处理的神经肉眼大体外观为乳白色，神经致密而饱满，不透明，质地较脆，隐约可见神经纤维纹理；经脱细胞处理之后，支架呈半透明状浅白色，神经纤维纹理消失，质地软而韧。
脱细胞支架材料消毒处理：支架消毒剂选用质量浓度为0.1％的PAA（PAA，过氧乙酸，现用现配）。室温下，将支架放入15ml离心管中，倒入新鲜配置的质量浓度为0.1％PAA，浸泡消毒 3-3.5 h，超净台内无菌PBS震荡24-25h，毎2-2.5h换液一次，漂洗结束，封口膜封管，4℃保存备用，脱细胞神经支架制成。
实施例2：脱细胞神经支架制备效果的评价
A组（未处理组）：新鲜对照神经；
B组（TritonX-100 加酶组）：脱细胞神经支架；
C组（NaOH组）：脱细胞神经支架；
D组（TritonX-100加冻融酶组）：上述制备方法制备的脱细胞神经支架；
2.1 脱细胞神经支架组织形态学观察
A组（未处理组）的新鲜对照神经进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛（4%paraformaldehyde，PFA）和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后采用OCT包埋剂进行OCT包埋。组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干。
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片。
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
HE染色结果显示：A组（未处理组）的新鲜对照神经，纵切面可见大量呈波浪状致密排列的神经纤维，细胞核蓝染，清晰明显，施万细胞长条状包绕轴突，轴突及髓鞘结构完好，未见细胞碎片（图1.A.a）；横切面可见直径不一，排列紧密的类圆形轴突细胞，周围包绕施万细胞形成，神经内膜，外膜及神经束膜完整（图1.B.a）。髓鞘特异性染色甲苯胺蓝染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，横切面可见清晰蓝染的包裹轴突的髓鞘（图1.C.a)。免疫荧光Laminin染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，Laminin含量丰富，基底膜结构完好（图1.D.a)。
将B组（TritonX-100 加酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛（4% paraformaldehyde，PFA）和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋。组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干。
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片。
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
HE染色结果显示：许旺细胞部分去除，支架结构疏松，轴突及髓鞘等成分大部分脱失，但仍可见散在的细胞核及周边束膜、外膜；甲苯胺蓝染色结果显示，轴突和髓鞘大量残留；免疫荧光Laminin染色结果显示，Laminin部分保留，基底膜尚好。
将C组（NaOH组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛（4%paraformaldehyde，PFA）和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋。组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干。
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片。
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分大部分去除，仍可见少量细胞核及细胞碎片，支架过于松散，出现不规则空洞；免疫荧光染色显示Laminin脱失较多，基底膜破坏较严重；
将D组（TritonX-100加冻融酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛（4% paraformaldehyde，PFA）和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋。组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干。
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片。
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整（图1）。
2.2脱细胞神经支架超微结构
通过透射电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）。
透射电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%戊二醛前固定过夜，用质量浓度为0.1M 的PB漂洗，然后用锇酸进行后固定，再用质量浓度为0.1M PB漂洗，酒精梯度脱水，然后经过丙酮置换，包埋剂梯度浸透，加热聚合，修块切片，行透射电镜观察。
透射电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经，轴突、髓鞘完整，施万细胞包绕致密，可见丰富细胞外基质成分如胶原蛋白和弹力蛋白（图2.A.a）。经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞大部分去除，但仍能见到部分残留；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞基本去除，但胶原成分、层粘连蛋白等丢失较多，纤维结构散乱，支撑功能不佳；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序（图2.A.b，c，d）。
通过扫描电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）。
扫描电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%的戊二醛固定过夜，用质量浓度为0.1M 的PB漂洗3次，每次10-15min，酒精梯度脱水至100%，叔丁醇脱水15min，CO2临界点干燥，真空镀膜仪喷金，行环境扫描电镜观察。
扫描电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经可见其中神经纤维完整，神经束粗细不一，可见中央轴突及外周包绕的髓鞘（图2.B.a）。经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架轴突及髓鞘大部分去除，呈现管状通道，但基膜管欠通畅，空间结构欠规整；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突及髓鞘成分基本消失，管内无明显残留结构，但基膜管通部分塌陷，空间骨架结构破坏较重；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间（图2.B.b，c，d）。
2.3脱细胞神经支架DNA含量测定
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行DNA含量测定。
DNA含量测定步骤：1.分别取各组脱细胞神经支架30mg粉碎，并放入1.5ml离心管，加200μl Buffer TL。加25μl OB Protease 并震荡混匀，在55℃震荡水浴中孵育至组织完全溶解。2.10000 g离心5min沉淀去除不溶解的组织碎片，小心吸取上清液并转移到另外一个无菌离心管，不留有任何不溶解的碎片。3.加220μl Buffer BL并震荡混匀，70℃下孵育10min，加220μl 无水乙醇（室温，96-100%），并以最大震荡速度震荡15s。 4.在2ml收集管中放置HiBind DNA柱，把包括沉淀在内的所有溶解产物转移到柱内，8000 g离心1 min集结DNA，弃流过的液体。5.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用500μl Buffer HB吹打冲洗。8000 g离心1 min。弃滤过液及收集管。6.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用700μl乙醇稀释过的DNA Wash Buffer 吹打冲洗。8000 g离心1 min。弃滤过液，收集管在下一个步骤中重复利用。7.把柱放回步骤6中的2 ml 收集管，按上面的方法用700μl乙醇稀释过的DNAWash Buffer 吹打冲洗，弃滤过液。8.把柱放回同一个的2 ml 收集管，并以最大速度（大于12000g）离心空柱2min干燥柱。把柱放到1.5ml无菌离心管，加50-200μl 预热（70℃）的洗脱液，在室温下放置3min。从柱中洗脱DNA，10000 g离心1min，再加100-200μl洗脱液重复洗脱，Nanodrop测定DNA浓度。
DNA含量测定结果显示：A组（未处理组）神经DNA含量丰富，经过脱细胞处理，各组支架DNA有不同程度的降低，与正常对照组相比，B组（TritonX-100 加酶组）支架DNA，一半以上被脱除，C组（NaOH组）支架70%DNA被去除，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除（图3）。
2.4 CCK-8细胞毒性检测
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行CCK-8细胞毒性检测。
CCK-8测定方法：1.胎盘间充质干细胞的培养：复苏胎盘间充质干细胞，加入含体积分数为10% FBS（Gibco胎牛血清）的DMEM/F12培养，待细胞生长平铺80-90%，2.5 g/L胰酶消化传代，调整细胞浓度为1×107/L，100μl/孔接种于96孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。2.脱细胞神经支架浸提液的制备：将各组脱细胞神经支架消毒灭菌后，按0.1g/ml无血清DMEM的比例置于15mlEP管中，封口膜封闭，37℃浸泡72 h，取出神经支架，将浸提液离心，取上清液加入体积分数为10% 的胎牛血清及青链霉素混合液备用。3. CCK-8检测脱细胞神经支架的细胞毒性：胎盘间充质干细胞培养24h，将96孔细胞培养板PBS洗涤2次，实验组加入 100μl脱细胞神经支架浸提液培养，对照组加入等量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液。分别于培养的1、3、5天，每组取5孔平行样，每孔加入10μl CCK-8液，继续培养4h，用酶标仪测定450 nm处吸光度(A值)，比较各组吸光度值有无差异。
CCK-8测定结果反应细胞数目及增殖趋势，与空白对照组相比，同一时间点，A组（未处理组）和D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组），细胞数目降低少，但无明显差异，细胞生长状态尚可，D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好，不同时间点，同组细胞之间，细胞数目显著增多，差异明显（图4）。
2.5脱细胞神经支架细胞生物相容性测定
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定方法：将各组脱细胞神经支架制备成5mm长的节段，置于培养皿中，和胎盘间充质干细胞共培养48小时，观察细胞的生长状态，取出共培养支架，固定脱水，行冰冻切片，HE染色，观察细胞与支架的黏附情况。
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定结果：细胞支架共培养48小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态，结果显示细胞胞体饱满，胞质均一，生长良好，细胞平铺80-90%，各组支架之间细胞生长状态无显著差异图（图5.a）。共培养支架取出固定后行冰冻切片，HE染色结果显示，B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架，细胞附着较少；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架，可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好（图5. b，c，d）。
2.6脱细胞神经支架组织生物相容性测定
脱细胞神经支架组织生物相容性测定方法：健康成年SD大鼠，雌雄各半，在严格无菌条件下，将消毒各组脱细胞神经支架植入大鼠背背肌肉内，分别于手术后第1、4周每组各取4只SD大鼠全身麻醉心脏灌注，切开皮肤肉眼观察植入部位组织反应的特异和程度。随后移植物取样，制备标本，记录组织病理学试验反应分级，评价生物学反应程度。
脱细胞神经支架组织生物相容性测定结果：术后各组大鼠活动正常，进食良好，切口处无红肿，感染或坏死。1周时打开肌肉，暴露移植物，各组支架被肌肉组织包裹，将移植物与周围肌肉同时取下，行冰冻切片，HE染色结果显示，A组（未处理组）炎症反应非常严重，镜下可见大量炎症细胞包裹神经，聚集成团；与A组比较，B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）炎症反应减轻，但仍可见较多炎症细胞浸润；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架炎症反应轻微，可见炎症细胞极少（图6）。
2.7细胞支架复合体冰冻切片观察
细胞支架复合体冰冻切片观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察细胞的黏附状况。
细胞支架复合体冰冻切片观察结果：倒置荧光显微镜显示A组（未处理组）新鲜未处理神经内几乎无细胞长入；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架显示细胞进入支架并存活生长，但数量不多，且细胞分布不均匀；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一（图7）。
2.8细胞支架复合体扫描电镜观察
细胞支架复合体扫描电镜观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行扫描电镜观察，检测细胞的黏附，生长及迁移状况。
细胞支架复合体扫描电镜观察结果： D组（TritonX-100加冻融酶组）支架细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间；B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）支架，细胞少量黏附生长；A组（未处理组）几乎无细胞长入（图8）。
应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分都属于现有技术。上述针对较佳实施例的描述较细致，但不能因此认为是对本发明专利保护范围的限制。

Claims (10)

1.一种脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于采用TritonX-100加冻融酶的复合方法进行脱细胞神经支架制备，包括如下步骤：
1.1动物称重，以质量浓度3.5%的水合氯醛麻醉动物，待麻醉生效后，用体积浓度75%的乙醇浸泡消毒10-15min，切片，分离肌肉，无菌条件下切取双侧坐骨神经；将坐骨神经放于装有超纯水的培养皿中，室温下震荡24-25小时；
1.2在质量浓度0.5%的TritonX-100溶液中震荡36-37小时；
1.3然后转入液氮中反复冻融5-6次；
1.4将冻融后的坐骨神经移入装有胰酶的培养皿中，37℃过夜；然后用DNase-I、RNase-A进行处理，37℃ 2-2.5h；
1.5后转入蒸馏水中振荡、漂洗，每1-1.5小时换液1次；
1.6将坐骨神经取出，进行修剪定型，即为做好的脱细胞支架材料，转入PBS缓冲液中4℃，pH 7.2保存；
1.7脱细胞支架材料消毒处理：支架消毒剂选用质量浓度为0.1％的PAA；室温下，将脱细胞支架材料放入15ml离心管中，倒入新鲜配置的质量浓度为0.1％的PAA，浸泡消毒 3-3.5 h，超净台内无菌PBS震荡24-25h，毎2-2.5h换液一次，漂洗结束，封口膜封管，4℃保存备用。
2.一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于包括如下步骤：
A组（未处理组）：新鲜对照神经；
B组（TritonX-100 加酶组）：脱细胞神经支架；
C组（NaOH组）：脱细胞神经支架；
D组（TritonX-100加冻融酶组）：脱细胞神经支架；
2.1 脱细胞神经支架组织形态学观察
将各组神经进行HE染色处理，HE染色结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整；
2.2脱细胞神经支架超微结构观察
通过透射电镜、扫描电镜分别观察各组神经；
透射电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序；扫描电镜结果显示，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间；
2.3脱细胞神经支架DNA含量测定
对各组神经进行DNA含量测定；
DNA含量测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除；
2.4 CCK-8细胞毒性检测
对各组神经进行CCK-8细胞毒性检测；
CCK-8测定结果显示：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；
2.5脱细胞神经支架细胞生物相容性测定
将各组神经进行细胞生物相容性测定；
细胞生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组），可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好；
2.6脱细胞神经支架组织生物相容性测定
将各组神经进行组织生物相容性测定；
组织生物相容性测定结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）炎症反应轻微，可见炎症细胞极少；
2.7细胞支架复合体冰冻切片观察
将各组神经的细胞支架复合体冰冻切片观察；
细胞支架复合体冰冻切片观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一；
2.8细胞支架复合体扫描电镜观察
将各组神经的细胞支架复合体扫描电镜观察；
细胞支架复合体扫描电镜观察结果：D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间。
3.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的脱细胞神经支架组织形态学观察的步骤如下：
A组（未处理组）的新鲜对照神经进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后采用OCT包埋剂进行OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片至10μm，冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：A组（未处理组）的新鲜对照神经，纵切面可见大量呈波浪状致密排列的神经纤维，细胞核蓝染，清晰明显，施万细胞长条状包绕轴突，轴突及髓鞘结构完好，未见细胞碎片；；横切面可见直径不一，排列紧密的类圆形轴突细胞，周围包绕施万细胞形成，神经内膜，外膜及神经束膜完整；髓鞘特异性染色甲苯胺蓝染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，横切面可见清晰蓝染的包裹轴突的髓鞘；免疫荧光Laminin染色结果显示，A组（未处理组）的新鲜对照神经，Laminin含量丰富，基底膜结构完好；
将B组（TritonX-100 加酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片至10μm，冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞部分去除，支架结构疏松，轴突及髓鞘等成分大部分脱失，但仍可见散在的细胞核及周边束膜、外膜；甲苯胺蓝染色结果显示，轴突和髓鞘大量残留；免疫荧光Laminin染色结果显示，Laminin部分保留，基底膜尚好；
将C组（NaOH组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分大部分去除，仍可见少量细胞核及细胞碎片，支架过于松散，出现不规则空洞；免疫荧光染色显示Laminin脱失较多，基底膜破坏较严重；
将D组（TritonX-100加冻融酶组）脱细胞神经支架进行染色处理：经质量浓度为4%的多聚甲醛和质量浓度为3%的戊二醛固定，4℃过夜，蔗糖梯度脱水（质量浓度为15%蔗糖1天，质量浓度为30%蔗糖2-3天），液氮冷冻后OCT包埋；组织由冰冻切片机进行切片（10μm），冰冻切片贴片后室温放置待自然晾干，-20度保存，染色之前取出，放室温自然解冻至风干；
冰冻切片行HE染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，苏木精染色2min，流水冲洗5min，盐酸酒精分化20秒，流水冲洗10min,蒸馏水30秒，体积浓度为75%酒精30秒，伊红2min，体积浓度为85%酒精30秒，体积浓度为95%酒精30秒, 体积浓度为100%酒精30秒，二甲苯 I 30秒，二甲苯II 30秒，中性树胶封片；
冰冻切片行甲苯胺蓝染色：质量浓度为4%的多聚甲醛固定30min,蒸馏水洗3次，每次2min，质量浓度为1%甲苯胺蓝溶液60℃，5-10min，质量浓度为0.5%冰醋酸分化，镜下控制分化程度，蒸馏水漂洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；
HE染色结果显示：许旺细胞，轴突及髓鞘等成分基本完全脱除，未见散在的细胞核及周边束膜、外膜，支架结构松散适度，Laminin保留充分，基底膜基本完整。
4.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的脱细胞神经支架超微结构观察的步骤如下：
通过透射电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）；
透射电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%戊二醛前固定过夜，用质量浓度为0.1M的PB漂洗，然后用锇酸进行后固定，再用质量浓度为0.1M PB漂洗，酒精梯度脱水，然后经过丙酮置换，包埋剂梯度浸透，加热聚合，修块切片，行透射电镜观察；
透射电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经，轴突、髓鞘完整，施万细胞包绕致密，可见丰富细胞外基质成分如胶原蛋白和弹力蛋白；经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞大部分去除，但仍能见到部分残留；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突、施万细胞基本去除，但胶原成分、层粘连蛋白等丢失较多，纤维结构散乱，支撑功能不佳；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架轴突、施万细胞去除彻底，细胞外基质成分良好，显微结构松散有序；
通过扫描电镜观察A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）；
扫描电镜步骤：各组神经经过质量浓度为2.5%的戊二醛固定过夜，用质量浓度为0.1M的PB漂洗3次，每次10-15min，酒精梯度脱水至100%，叔丁醇脱水15min，CO2临界点干燥，真空镀膜仪喷金，行环境扫描电镜观察；
扫描电镜结果显示：A组（未处理组）的新鲜神经可见其中神经纤维完整，神经束粗细不一，可见中央轴突及外周包绕的髓鞘；经脱细胞处理，B组（TritonX-100 加酶组）去细胞神经支架轴突及髓鞘大部分去除，呈现管状通道，但基膜管欠通畅，空间结构欠规整；C组（NaOH组）去细胞神经支架，轴突及髓鞘成分基本消失，管内无明显残留结构，但基膜管通部分塌陷，空间骨架结构破坏较重；D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架，轴突、髓鞘成分几乎完全消失，管内未见残留结构，基膜完整，基膜管更通畅，基底膜管排列整齐，空隙均匀，空间骨架结构保存良好，为细胞的黏附生长提供了理想的三维空间。
5.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的脱细胞神经支架DNA含量测定的步骤如下：
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行DNA含量测定；
DNA含量测定步骤：1.分别取各组脱细胞神经支架30mg粉碎，并放入1.5ml离心管，加200μl Buffer TL；加25μl OB Protease 并震荡混匀，在55℃震荡水浴中孵育至组织完全溶解；2.10000 g离心5min沉淀去除不溶解的组织碎片，小心吸取上清液并转移到另外一个无菌离心管，不留有任何不溶解的碎片；3.加220μl Buffer BL并震荡混匀，70℃下孵育10min，加220μl 无水乙醇（室温，质量浓度为96-100%），并以最大震荡速度震荡15s； 4.在2ml收集管中放置HiBind DNA柱，把包括沉淀在内的所有溶解产物转移到柱内，8000 g离心1 min集结DNA，弃流过的液体；5.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用500μl Buffer HB吹打冲洗；8000 g离心1 min；弃滤过液及收集管；6.把柱放到另外一个2 ml 收集管，并用700μl乙醇稀释过的DNA Wash Buffer 吹打冲洗；8000 g离心1 min；弃滤过液，收集管在下一个步骤中重复利用；7.把柱放回步骤6中的2 ml 收集管，按上面的方法用700μl乙醇稀释过的DNA Wash Buffer 吹打冲洗，弃滤过液；8.把柱放回同一个的2ml 收集管，并以最大速度（大于12000g）离心空柱2min干燥柱；把柱放到1.5ml无菌离心管，加50-200μl 预热（70℃）的洗脱液，在室温下放置3min；从柱中洗脱DNA，10000 g离心1min，再加100-200μl洗脱液重复洗脱，Nanodrop测定DNA浓度；
DNA含量测定结果显示：A组（未处理组）神经DNA含量丰富，经过脱细胞处理，各组支架DNA有不同程度的降低，与正常对照组相比，B组（TritonX-100 加酶组）支架DNA，一半以上被脱除，C组（NaOH组）支架70%DNA被去除，D组（TritonX-100加冻融酶组）去细胞神经支架DNA含量最低，95%DNA被去除。
6.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的CCK-8细胞毒性检测的步骤如下：
对A组（未处理组）；B组（TritonX-100 加酶组）；C组（NaOH组）；D组（TritonX-100加冻融酶组）进行CCK-8细胞毒性检测；
CCK-8测定方法：1.胎盘间充质干细胞的培养：复苏胎盘间充质干细胞，加入含体积分数为10% FBS的DMEM/F12培养，待细胞生长平铺80-90%，2.5 g/L胰酶消化传代，调整细胞浓度为1×107/L，100μl/孔接种于96孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；2.脱细胞神经支架浸提液的制备：将各组脱细胞神经支架消毒灭菌后，按0.1g/ml无血清DMEM的比例置于15mlEP管中，封口膜封闭，37℃浸泡72 h，取出神经支架，将浸提液离心，取上清液加入体积分数为10% 的胎牛血清及青链霉素混合液备用；3. CCK-8检测脱细胞神经支架的细胞毒性：胎盘间充质干细胞培养24h，将96孔细胞培养板PBS洗涤2次，实验组加入 100μl脱细胞神经支架浸提液培养，对照组加入等量含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液；分别于培养的1、3、5天，每组取5孔平行样，每孔加入10μl CCK-8液，继续培养4h，用酶标仪测定450 nm处吸光度，比较各组吸光度值有无差异；
CCK-8测定结果反应细胞数目及增殖趋势，与空白对照组相比，同一时间点，A组（未处理组）和D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组），细胞数目降低少，但无明显差异，细胞生长状态尚可，D组（TritonX-100加冻融酶组）细胞数目无明显降低，细胞生长状态良好，不同时间点，同组细胞之间，细胞数目显著增多，差异明显。
7.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的脱细胞神经支架细胞生物相容性测定的步骤如下：
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定方法：将各组脱细胞神经支架制备成5mm长的节段，置于培养皿中，和胎盘间充质干细胞共培养48小时，观察细胞的生长状态，取出共培养支架，固定脱水，行冰冻切片，HE染色，观察细胞与支架的黏附情况；
脱细胞神经支架细胞生物相容性测定结果：细胞支架共培养48小时，倒置显微镜下观察细胞生长状态，结果显示细胞胞体饱满，胞质均一，生长良好，细胞平铺80-90%，各组支架之间细胞生长状态无显著差异图；共培养支架取出固定后行冰冻切片，HE染色结果显示，B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架，细胞附着较少；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架，可见大量细胞黏附，细胞充分伸展，黏附生长状态良好。
8.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的脱细胞神经支架组织生物相容性测定的步骤如下：
脱细胞神经支架组织生物相容性测定方法：健康成年SD大鼠，雌雄各半，在严格无菌条件下，将消毒各组脱细胞神经支架植入大鼠背背肌肉内，分别于手术后第1、4周每组各取4只SD大鼠全身麻醉心脏灌注，切开皮肤肉眼观察植入部位组织反应的特异和程度；随后移植物取样，制备标本，记录组织病理学试验反应分级，评价生物学反应程度；
脱细胞神经支架组织生物相容性测定结果：术后各组大鼠活动正常，进食良好，切口处无红肿，感染或坏死；1周时打开肌肉，暴露移植物，各组支架被肌肉组织包裹，将移植物与周围肌肉同时取下，行冰冻切片，HE染色结果显示，A组（未处理组）炎症反应非常严重，镜下可见大量炎症细胞包裹神经，聚集成团；与A组比较，B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）炎症反应减轻，但仍可见较多炎症细胞浸润；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架炎症反应轻微，可见炎症细胞极少。
9.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的细胞支架复合体冰冻切片观察的步骤如下：
细胞支架复合体冰冻切片观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察细胞的黏附状况；
细胞支架复合体冰冻切片观察结果：倒置荧光显微镜显示A组（未处理组）新鲜未处理神经内几乎无细胞长入；B组（TritonX-100 加酶组）和C组（NaOH组）支架显示细胞进入支架并存活生长，但数量不多，且细胞分布不均匀；D组（TritonX-100加冻融酶组）支架显示大量细胞黏附生长，密度较大且分布均一。
10.根据权利要求2所述的一种脱细胞神经支架的制备方法的效果评价方法，其特征在于所述的细胞支架复合体扫描电镜观察的步骤如下：
细胞支架复合体扫描电镜观察步骤：将感染GFP的胎盘间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化离心，调整细胞浓度为1×106/ml，在解剖显微镜下，应用5μl Hamilton微量进样器吸取细胞悬液，在培养皿中采用散点注射法将细胞注入脱细胞神经支架，于37℃，5% CO2培养箱中培养，构建神经支架复合体，分别于术后24h，取材，行扫描电镜观察，检测细胞的黏附，生长及迁移状况；
细胞支架复合体扫描电镜观察结果： D组（TritonX-100加冻融酶组）支架细胞大量黏附生长，细胞胞体饱满，突起充分伸展，贴附与支架空隙间；B组（TritonX-100 加酶组）、C组（NaOH组）支架，细胞少量黏附生长；A组（未处理组）几乎无细胞长入。
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