CN105920671A - 神经移植物的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经移植物的制备方法及其产品，制备方法包括如下步骤：猪神经组织提取、去除与神经组织相连的脂肪组织和结缔组织、液氮冻融、化学洗涤和消毒灭菌。本发明将冻融和化学洗涤两种方法相结合，改善了神经组织骨架的结构完整性，猪神经组织中细胞成分去除彻底，降低了免疫性，本发明制得的神经移植物产品可以达到神经快速生长、功能恢复的目标，为临床治疗提供了可行方案。

Description

神经移植物的制备方法及其产品
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及神经移植物的制备方法，本发明还涉及该方法制备的神经移植物产品。
背景技术
人体外周神经损伤非常常见，主要发生在外伤事故中或外科手术中。神经断裂常常导致人体功能丧失，以至残疾。因此，神经断裂需要及时手术修补。神经修补的基本方法是将两断端缝合，但是在通常情况下，神经损坏造成一段神经缺失，形成间隙，需要神经移植。
神经损伤后，远端神经变性，坏死，神经组织被吸收，但支持神经的骨架管道仍然存在。近段神经有再生的能力。在神经骨架导管完整存在下，近段神经末梢生长，可沿着导管延长至所支配的器官如肌肉器官，使其恢复功能。但是，神经损伤时，神经损坏造成一段神经缺失，形成间隙，近段新生的神经不能直接远端的神经骨架管中。此时，需要手术植入导管来引导近段神经的再生。
从神经再生角度来说，理想的神经移植为自体移植，自体神经不产生排异反应，无需处理，保存完整的促神经再生细胞及神经组织骨架。但缺点是自体神经移植可造成新的神经功能损伤，适宜移植的神经组织的数量及长度有限，限制了广泛临床应用。
为克服自体神经移植的缺陷，医学界一直在尝试替代自体移植的方法。这些方法包括硅胶神经导管，可降解生物材料导管及自体静脉血管等。但这些导管缺乏促进神经再生及生长的生物成分，没有支持神经生长的组织骨架，因而效果不理想。近些年来，科学家对同种异体移植进行了大量的实验研究，有部分已进入临床试验。直接移植异体神经可产生免疫排斥反应，病人需要应用免疫抑制药物。
近期的科学研究发现，神经组织中引起排异反应的抗原成分主要是细胞成分，应用各种方法去除细胞后，其免疫性大大降低，这些研究成果促进了同种异体和异种之间的神经移植的临床研究及应用。影响去细胞神经组织的质量的因素有：细胞成分的清除度，神经骨架的完整性及促进神经再生的物质的保存度。细胞成分清除的越干净，其免疫性就越低；神经骨架保存越完整，越有利于神经的生长，对靶组织的重新支配。最新的研究发现，神经组织骨架同时含有促进和抑制神经生长的物质。在处理神经的过程中，关键技术是如何最适度的保留和激活促生长成分，去除抑制成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的神经组织移植物的制备方法，该方法改善了神经组织骨架的结构完整性，神经骨架的孔密度高。
本发明的上述目的是通过如下方案实现的：
一种神经移植物的制备方法，以猪的神经组织为原料，包括冻融和化学洗涤过程，具体包括如下步骤：
1)、猪神经组织提取
从6～12个月的猪提取坐骨神经、胫神经和腓总神经组织，神经组织长度为10～30cm、直径为2～6mm；
2)、去除与神经组织相连的脂肪组织和结缔组织
使用磷酸钠盐缓冲液冲洗3～8次，置于磷酸钠盐缓冲液中，-80℃冰箱保存备用；
3)、液氮冻融
将步骤2)的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，置液氮中1～10min后，再水浴融化，重复1～5遍；
4)、化学洗涤
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，再分别使用下述溶液A、B、C和D进行冲洗：
溶液A：磷酸钠缓冲液，含100mM硫代甜菜碱(SB-10)；
溶液B：磷酸钠缓冲液，pH为7.2～7.4，含NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；
溶液C：磷酸钠缓冲液，含1mM硫代甜菜碱(SB-10)、0.1％曲拉通x-200(Triton X-200)；
溶液D：磷酸钠缓冲液，每毫升含软骨素酶ABC(Chondroitinase)2单位；
5)、消毒灭菌
以伽马射线进行消毒灭菌，于溶液B中-70℃冷冻保存；手术前于36℃水浴融化，然后置于溶液D孵育10～20小时。
进一步，上述步骤4)的化学洗涤包括如下具体过程：
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗5～20小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗10～30分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗12～36小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗1～10分钟，重复2～4次；
置于溶液A中，振荡冲洗5～20小时；
置于溶液B中，振荡冲洗10～30分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗10～24小时；
最后置于溶液B中，振荡冲洗1～10分钟，重复2～4次。
为了更好地去除猪神经组织中细胞成分、降低其免疫性，以及保证神经骨架的完整性，上述步骤4)的化学洗涤步骤更进一步地具体如下：
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗10小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗15分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗24小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次；
置于溶液A中，振荡冲洗10小时；
置于溶液B中，振荡冲洗15分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗15小时；
最后置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次。
同时，上述步骤3)液氮冻融过程进一步为：将步骤2)的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，置液氮中2min后，再37℃水浴融化，重复2遍。
本发明一种神经移植物，其由上述釆用冻融和化学洗涤方法制备得到的产品。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明将冻融和化学洗涤两种方法相结合，大大改善了神经组织骨架的结构完整性，猪神经组织中细胞成分去除彻底，降低了免疫性，本发明制得的神经移植物产品可以达到神经快速生长、功能恢复的目标，为临床治疗提供了可行方案。
附图说明
图1为本发明的工艺示意图；
图2为三种方法所得产品的神经骨架的孔密度对比图(其中，混合法即为本发明所釆用的方法)。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到，如硫代甜菜碱(Sulfobetaines 10)、曲拉通x-200(Triton X-200)、软骨素酶ABC(Chondroitinase)、NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4均从sigma公司购得。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练入员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1
一种神经移植物的制备方法，制备工艺如图1所示，以猪的神经组织为原料，包括冻融和化学洗涤过程，包括如下步骤：
1)、猪神经组织提取
从6～12个月的猪提取坐骨神经、胫神经和腓总神经组织，屠宰后3至6小时获取，神经组织长度为10～30cm、直径为2～6mm；
2)、去除与神经组织相连的脂肪组织和结缔组织
使用磷酸钠盐缓冲液冲洗5次，置于磷酸钠盐缓冲液中，-80℃冰箱保存备用；
3)、液氮冻融
将步骤2)的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，置液氮中2min后，再37℃水浴融化，重复5遍。
4)、化学洗涤
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，再分别使用下述溶液A、B、C和D进行冲洗：
溶液A：磷酸钠缓冲液，含100mM硫代甜菜碱(SB-10)；
溶液B：磷酸钠缓冲液，pH为7.2～7.4，含NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L；
溶液C：磷酸钠缓冲液，含1mM硫代甜菜碱(SB-10)、0.1％曲拉通x-200(Triton X-200)；
溶液D：磷酸钠缓冲液，每毫升含软骨素酶ABC(Chondroitinase)2单位；
5)、消毒灭菌
以伽马射线进行消毒灭菌，于溶液B中-70℃冷冻保存；手术前于36℃水浴融化，然后置于溶液D孵育16小时。
神经骨架孔密度比较：
将本实施例(混合法)制得的神经移植物与单独釆用冻融方法和化学洗涤方法进行神经骨架孔密度的比较，单独冻融法和单独化学洗涤法的具体工艺同于本实施例相应步骤所示，通过三种不同的方法处理神经组织后，用10％甲醛固定，将神经骨架组织横断面切片置于载玻片上，于光学显微镜下计算神经骨架的孔密度。结果表明，如图2所示，本发明混合方法处理神经组织的神经骨架孔的密度显著高于另外两种方法。
细胞成分比较：
苏木精-伊红染色(H&E)，将三种方法产生的神经骨架组织固定，用石蜡包埋，切片。然后进行H&E染色。三种方法产生的神经骨架H&E染色均未发现细胞成分。表明三种方法在去除细胞成分方面效果没有明显区别。
实施例2
与实施例1相比，不同之处在于液氮冻融的次数和化学洗涤时振荡冲洗时间不同：
液氮冻融重复3遍；
化学洗涤时，将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗5小时；再置于溶液B中，振荡冲洗10分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗12小时；再置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次；置于溶液A中，振荡冲洗5小时；置于溶液B中，振荡冲洗10分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗10小时；最后置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次。
实施例3
与实施例1相比，不同之处在于液氮冻融的次数和化学洗涤时振荡冲洗时间不同：
液氮冻融重复3遍；
化学洗涤时，将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗20小时；再置于溶液B中，振荡冲洗30分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗36小时；再置于溶液B中，振荡冲洗10分钟，重复3次；置于溶液A中，振荡冲洗20小时；置于溶液B中，振荡冲洗30分钟；置于溶液C中，振荡冲洗24小时；最后置于溶液B中，振荡冲洗10分钟，重复3次。
申请人声明，所属技术领域的技术人员在上述实施例的基础上，将上述实施例某组分的具体含量点值，与发明内容部分的技术方案相组合，从而产生的新的数值范围，也是本发明的记载范围之一，本申请为使说明书简明，不再罗列这些数值范围。

Claims (5)

1.神经移植物的制备方法，以猪的神经组织为原料，包括冻融和化学洗涤过程，其特征在于包括如下步骤：
1)、猪神经组织提取
从6～12个月的猪提取坐骨神经、胫神经和腓总神经组织，神经组织长度为10～30cm、直径为2～6mm；
2)、去除与神经组织相连的脂肪组织和结缔组织
使用磷酸钠盐缓冲液冲洗3～8次，置于磷酸钠盐缓冲液中，-80℃冰箱保存备用；
3)、液氮冻融
将步骤2)的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，置液氮中1～10min后，再水浴融化，重复1～5遍；
4)、化学洗涤
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，再分别使用下述溶液A、B、C和D进行冲洗：
溶液A：磷酸钠缓冲液，含100mM硫代甜菜碱；
溶液B：磷酸钠缓冲液，pH为7.2～7.4；
溶液C：磷酸钠缓冲液，含1mM硫代甜菜碱、0.1％曲拉通x-200；
溶液D：磷酸钠缓冲液，每毫升含软骨素酶ABC 2单位；
5)、消毒灭菌
以伽马射线进行消毒灭菌，于溶液B中-70℃冷冻保存；手术前于36℃水浴融化，然后置于溶液D孵育10～20小时。
2.如权利要求1所述的神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的化学洗涤包括如下步骤：
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗5～20小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗10～30分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗12～36小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗1～10分钟，重复2～4次；
置于溶液A中，振荡冲洗5～20小时；
置于溶液B中，振荡冲洗10～30分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗10～24小时；
最后置于溶液B中，振荡冲洗1～10分钟，重复2～4次。
3.如权利要求2所述的神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的化学洗涤包括如下步骤：
将步骤3)液氮冻融处理后的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗后，置于溶液A中，振荡冲洗10小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗15分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗24小时；
再置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次；
置于溶液A中，振荡冲洗10小时；
置于溶液B中，振荡冲洗15分钟；
置于溶液C中，振荡冲洗15小时；
最后置于溶液B中，振荡冲洗5分钟，重复3次。
4.如权利要求1所述的神经移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)液氮冻融过程为：
将步骤2)的神经组织于室温下使用蒸馏水冲洗，置液氮中2min后，再37℃水浴融化，重复2遍。
5.一种神经移植物，其特征在于是由权利要求1～4任意一种方法制备得到的产品。
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