CN107376022B - 一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法，将哺乳动物任意卵巢组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞卵巢材料；本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常卵巢的复杂组织结构。

Description

一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法
技术领域
本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法。
背景技术
卵巢早衰可以是自发的或是医源性的。当前的治疗手段包括激素替代疗法和低温储藏技术，它们可能增加卵巢癌的风险，在自体再移植后诱导产生恶性细胞，使得生存率大大降低。
脱细胞技术作为一种新兴的再生医学和组织工程技术，在去除了免疫原性细胞的同时，保留了天然的3D微结构以及细胞外基质中的有效成分胶原，糖胺聚糖(GAG)，细胞因子等，为细胞种植提供优良的载体，使得卵巢再生成为可能。
发明内容
本发明提供了一种适宜的脱细胞卵巢材料的制备方法，目的在于改进现有技术中，卵巢早衰疗法的缺陷，提高患者预后。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：将哺乳动物任意卵巢组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞卵巢材料；
其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为三种溶液中的一种，三种溶液分别为等体积比的氯仿和甲醇溶液，质量浓度10％-50％的丙酮溶液，质量浓度10％-50％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-1％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-5mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.05-0.3mg/ml。
一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料的其制备方法，包括以下步骤：
(1)取哺乳动物卵巢组织，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带组织；
(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1-2mm；
(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡5-10小时；
(4)在有机溶剂溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2-5小时；
(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡6-12小时；
(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡2-5小时；
(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-10小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料。
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(5)-(7)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1。
步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
相对于现有技术，本发明的显著进步在于：
(1)本发明所采用的动物卵巢是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性。
(2)本发明运用一种脱细胞方案即可同时实现对任意物种卵巢组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞卵巢材料。
(3)本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常卵巢的复杂组织结构。
附图说明
图1是本发明的卵巢切片大体外观图
图2是卵巢支架的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图
图3是卵巢支架的DAPI染色无细胞及无细胞核成分残留图
图4是卵巢支架DNA定量检测几乎不含有DNA成分图
图5是卵巢的胶原定量检测保留大量胶原成分图
图6是卵巢的免疫组化染色胶原定性检测保留大量胶原成分图
图7是卵巢扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图
图8是CCK-8检测不同支架浸提液浓度下MSCs的增值情况图
具体实施方案
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此
1.脱细胞卵巢材料的制备与研究
(1)取材：取成年熟雌猪健康卵巢，左右各一，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带组织；
(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1.5mm；
(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡8小时；其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
(4)在等体积比的氯仿和甲醇溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂3小时；
(5)在质量浓度为1％Triton X-100的PBS缓冲液中，其中混合1mmol/L的Tris，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡10小时；
(6)在质量浓度为0.5％SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡3小时；
(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，其中DNA酶浓度为0.3mg/ml，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡5小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料。
步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
其中，混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1，步骤(5)-(7)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1。
对本例所得天然组织来源的卵巢脱细胞材料进行组织学评价、抗原成分定量检测，结果如图1-8。通过图1和2显示完全脱细胞，卵巢材料大体结构保留完好，细胞外基质保留完整，细胞核成分完全去除，无细胞及其碎片残留；图3DAPI染色进一步提示材料中细胞核成分呈阴性，抗原性得到完全去除；图4的DNA抗原成分定量检测说明通过去细胞DNA去除率可以达到95％以上；图5和图6的胶原定量和定性检测发现细胞外基质主要胶原成分得到很好保留；图7的扫描电镜显示卵巢结构保留完整；图8的CCK-8细胞毒性检测表明卵巢脱细胞材料无细胞毒性，生物相容性良好。
实施例2脱细胞卵巢材料的制备和研究
(1)取材：取成年熟雌猪健康卵巢，左右各一，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带组织；
(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1mm；
(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡5小时；其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
(4)在1000ml质量浓度50％的丙酮溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2小时；
(5)在含质量浓度为5％Triton X-200的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡12小时；
(6)在质量浓度为1％SDS的PBS缓冲液中，其中混合5mmol/L的Tris，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡2小时；
(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，其中DNA酶浓度为0.05mg/ml，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料。
得到脱细胞卵巢材料。
实施例3脱细胞卵巢材料的制备和研究
(1)取材：取成年熟雌猪健康卵巢，左右各一，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带等组织；
(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至2mm；
(3)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液，恒温37℃摇床100rpm震荡10小时；其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为2％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
(4)在1000ml质量浓度为50％的乙醇溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂5小时；
(5)在质量浓度为2％Triton X-100的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡6小时；
(6)在质量浓度为0.7％的SDS的PBS缓冲液中，其中混合3mmol/L的Tris，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡5小时；
(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，其中DNA酶浓度为0.1mg/ml，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡10小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料。
实施例4脱细胞卵巢材料的制备和研究
取猪卵巢，步骤(4)在1000ml质量浓度10％的丙酮溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞卵巢材料。
实施例5脱细胞卵巢材料的制备和研究
取猪卵巢，步骤(4)在1000ml质量浓度30％的丙酮溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞卵巢材料。
实施例6脱细胞卵巢材料的制备和研究
取猪卵巢，步骤(4)在1000ml质量浓度10％的乙醇溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞卵巢材料。
实施例7脱细胞卵巢材料的制备和研究
取猪卵巢，步骤(4)在1000ml质量浓度10％的乙醇溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞卵巢材料。
对实施例2-5所得脱细胞卵巢材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测，结果与实施例1类似，这表明脱细胞卵巢材料可通过上述多种方法制得，并且对其进行组织学评价、抗原成分定量检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留。

Claims (2)

1.一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料，其特征在于：将哺乳动物任意卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1-2mm，经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞卵巢材料；
其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
所述的有机溶剂溶液为三种溶液中的一种，三种溶液分别为等体积比的氯仿和甲醇溶液，质量浓度10％-50％的丙酮溶液，质量浓度10％-50％的乙醇溶液；
所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-1％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-5mmol/L的Tris；
所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.05-0.3mg/ml。
2.一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取哺乳动物卵巢组织，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带组织；
(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1-2mm；
(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡5-10小时；
(4)在有机溶剂溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2-5小时；
(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡6-12小时；
(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡2-5小时；
(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-10小时；
(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(5)-(7)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1；
步骤(3)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
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