CN103776667B - 一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法，通过切片处理，可以将软骨组织切成厚度为5-20μm的切片，在此过程中软骨组织中的细胞多数被切割破裂。再经反复冻融处理后，细胞结构均被破坏。将组织切片置于提取溶液中，搅拌超声处理。将组织片取出，获得的细胞类成分A。将取出的组织片再置于清洗溶液中，搅拌超声处理，彻底清除细胞类成分。将取出的组织切片置超纯水溶液中搅拌。将组织切片吸干水分后获得基质类成分B。用适当溶剂提取基质成分B中的蛋白质类物质，进行组学分析和活性实验。本发明的优点为：可以实现软骨组织中，细胞类成分和细胞外基质类成分的分离。

Description

一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法

技术领域

本发明涉及用于蛋白质活性分析及功能蛋白质组学研究的软骨组织分级提取方法，具体地说是一种基于组织切片和去细胞化处理的软骨组织分级处理方法的构建。

背景技术

软骨组织主要由软骨细胞及其分泌形成的细胞外基质构成。在对软骨组织进行蛋白质组学分析时，通常对整块软骨组织进行处理。此时，细胞外基质中的高丰度蛋白类成分，如胶原蛋白、纤维联接蛋白等会严重干扰细胞内蛋白质的鉴定。反之，如果想分析细胞外基质中的蛋白质组成变化，细胞内蛋白质也会带来很大的干扰。通过研究发现，软骨组织中的细胞外基质具有较强的机械强度，切成厚度为10μm的厚度时仍能保持较好的片状形态。而此时，细胞外基质中的软骨细胞基本都被切割而碎裂。将软骨组织切片置于提取溶液中，细胞类成分会释放到溶液中，而细胞外基质类成分因为水溶性较差，很少溶解到溶液中。通过收集提取溶液，可以获得细胞类成分，同时排除了细胞外基质类成分的干扰。经过多种溶剂反复冲洗，将残留的细胞类成分彻底清洗干净，可以获得细胞外基质类成分，同时排除细胞类成分的干扰。

在对蛋白质提取物的分析中，认识其蛋白质组成与发现其生物活性都是非常重要的。传统的蛋白质组学研究中，往往应用变性剂或表面活性剂提取蛋白质。这虽然能提高蛋白质的提取效率，但是由于蛋白质已经变性失活，所以无法对其进行活性研究。因此，如何在保持活性的条件下对蛋白质进行提取是需要解决的重要问题。因此，选用冷冻切片技术和非变性溶剂，发展顺序提取方法，实现软骨组织样品中细胞类成分和细胞外基质类成分的分级处理，对于蛋白质组学研究和活性蛋白质的发现具有较大意义。

鹿茸作为哺乳动物唯一能够完整持续再生的器官，在较短时时期内可以产生大量的血管、神经、软骨等组织，被认为是研究组织生长调节机制的理想模型。鹿茸的前软骨区不同于一般的软骨组织，其内含有大量的血管，是鹿茸血管发生最旺盛的部位。以该部位的软骨组织为样品，对细胞类成分和细胞外基质分别进行提取，进而进行活性蛋白质筛选及蛋白质组学分析，对于认识鹿茸血管发生过程中发挥调节作用的功能蛋白质群，进而推动我国传统动物药的深入开发有积极意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种软骨组织中细胞类成分与细胞外基质类成分的分级处理方法，同时可以保持各组分的活性，以期解决活性研究及蛋白质组学分析中，细胞类成分和细胞外基质类成分的互相干扰问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

根据细胞外基质具有较好的机械强度并且水溶性较差的情况，采用冰冻组织切片技术将软骨组织切成5-20μm的组织片，然后依次用提取溶液、碱溶液对其中的细胞类成分进行提取。而后用超纯水彻底清洗细胞外基质中残留的细胞类成分，获得单纯的细胞外基质类成分。

具体为：

1)切片处理

取新鲜动物软骨组织样品，用生理盐水清洗，去除关节附带组织(如半月板，软骨膜，韧带，肌肉)及血液残留。用冷冻切片机切成厚度为10-20μm的组织切片，将组织薄片置于-80℃下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2-4次。

2)分级处理

将组织切片置于提取溶液中，1g组织切片中加入提取溶液为4-10ml，在4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的提取溶液中。重复提取2-4次，合并提取液获得蛋白质组分A。将组织切片取出吸干水分后置于4-10ml清洗溶液中，4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2-4次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4-37℃搅拌1-10min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2-4次。将组织切片取出吸干水分后获得基质类成分B；

提取溶液为下列溶液中的一种，超纯水，生理盐水或PBS溶液；浓度范围在0mM-500mM之间，pH为5-9。

3)活性蛋白质冻干

将组分A置于超滤离心管中(截留分子量为3-10kD)，在500-5000r/min范围内离心30min-6h。向浓缩液中加入4-10ml超纯水，在500-5000r/min范围内离心30min-6h；重复操作2-4次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将细胞外基质类成分B直接进行冻干处理。样品置于-80℃冰箱保存，待用。

本发明的优点为：(1)组织切片法配合反复冻融处理可以实现细胞完全破碎；(2)多种溶剂提取可以全面获得细胞类成分，并去除细胞外基质上残留的细胞类蛋白质，实现较好的分级效果。

本发明涉及一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法，通过切片处理，可以将软骨组织切成厚度为5-20μm的切片，在此过程中软骨组织中的细胞多数被切割破裂。再经反复冻融处理后，细胞结构均被破坏。将组织切片置于4-37℃的提取溶液中，充分搅拌1-5h，超声处理1-5min，软骨组织中的细胞类成分会释放到提取溶液中。将组织片取出，获得的细胞类成分A。组分A可直接用于蛋白质组学分析，也可经透析后冻干处理，用于活性考察。将取出的组织片吸干水分后，再置于清洗溶液中，在4-37℃，充分搅拌1-5h，超声处理1-5min，彻底清除细胞类成分。将取出的组织切片吸干水分后，置于4-37℃的超纯水溶液中搅拌1-10min。将组织切片吸干水分后获得基质类成分B。用适当溶剂提取基质成分B中的蛋白质类物质，进行组学分析和活性实验。本发明的优点为：可以实现软骨组织中，细胞类成分和细胞外基质类成分的分离。相对于对软骨组织整体进行分析，本方法可以降低样品的复杂程度，减少细胞外基质类成分和细胞内成分之间的相互干扰，对于分别研究两者的活性及两者的蛋白质组成意义较大。

附图说明

图1为鹿茸软骨组织分级处理前后蛋白质组学分析结果框图。

具体实施方式

将动物软骨组织用生理盐水清洗，去除血液残留。采用冷冻切片机将软骨组织切成10μm厚的切片，将组织薄片置于-80℃下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2-4次；

将组织切片置于提取溶液中，1g组织切片中加入提取溶液为4-10ml，在4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的提取溶液中。重复提取2-4次，合并提取液置于超滤离心管中(截留分子量为3-10kD)，在500-5000r/min范围内离心30min-6h。向浓缩液中加入4-10ml超纯水，在500-5000r/min范围内离心30min-6h；重复操作2-4次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将组织切片取出吸干水分后置于4-10ml清洗溶液中，4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2-4次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4-37℃搅拌1-10min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2-4次。将组织切片取出吸干水分后冻干，获得基质类成分B。

应用例1

一种从鹿茸软骨组织中制备细胞类成分和细胞外基质类成分的分级提取方法

将新切割下来的鹿茸经真空泵抽出残留的鹿血，用生理盐水清洁鹿茸表面并用75％酒精消毒。将鹿茸组织截断切成厚度为1cm的片状后，置于冷生理盐水中，搅动1-5min；取出鹿茸组织沥干后，置于新的冷生理盐水中，搅动1-5min；重复上述操作2-4次。采用冷冻切片机将鹿茸组织切成10μm厚的切片，将鹿茸薄片置于-80℃下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2-4次；

将按前述处理过的组织切片置于超纯水中，1g组织切片中加入超纯水为4ml，在4℃搅拌2h，超声处理1min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中，重复提取2次，合并提取液后置于超滤离心管中(截留分子量为5kD)，在4000r/min范围内离心50min。向浓缩液中加入4ml超纯水，在4000r/min范围内离心50min；重复操作2次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将组织切片自水中取出，吸干水分后置于4ml浓度为50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶(pH值为10.4)中，4℃搅拌2h，超声处理1min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4℃搅拌5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2次。将组织切片取出吸干水分后冻干，获得基质类成分B。

按参照文献(LiangGao，JournalofChromatographyB，2010，878，3370-3374)，分别对鹿茸软骨全组织，鹿茸细胞类成分A和鹿茸细胞外基质成分B进行蛋白质组学分析，结果如表1和图1所示。

表1鹿茸软骨组织分级处理前后的蛋白质组学分析结果

	鹿茸软骨全组织	细胞类成分A	细胞外基质类成分B
				鉴定肽段数量	326	443	112
鉴定蛋白数量	112	172	56

表1为鹿茸软骨组织分级处理前后蛋白质组学分析结果。结果显示：相对于分级之前鉴定到112个蛋白质，分级之后仅细胞类成分A鉴定到202个蛋白质，细胞外基质类成分B鉴定到56个蛋白质，鉴定数量提高了80％。说明分级处理降低了样品的复杂程度，鉴定到了分级之前被掩盖的低丰度蛋白质。

图1为鹿茸软骨组织分级处理前后蛋白质组学分析结果。结果显示：分级处理后鉴定到的蛋白质基本涵盖了分级处理前鉴定到的蛋白质(占83％)，同时新鉴定到90个蛋白质，说明分级处理效果明显。

同时，细胞类成分A和细胞外基质类成分B共有蛋白质为26个，占两份样品鉴定到蛋白质总数的12.8％，说明两份样品在蛋白质构成上差异较大，分级效果较明显。

应用例2

一种从牛关节软骨中提取细胞类成分和细胞外基质类成分的分级提取方法

用生理盐水清洗牛关节软骨，将软骨组织切成10μm切片，将鹿茸薄片置于-80℃下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2-4次；

将按前述处理过的组织切片置于50mM生理盐水中，1g组织切片中加入生理盐水为4ml，在4℃搅拌2h，超声处理1min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的生理盐水中，重复提取2次，合并提取液后置于超滤离心管中(截留分子量为5kD)，在3000r/min范围内离心50min。向浓缩液中加入4ml超纯水，在3000r/min范围内离心50min；重复操作2次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将组织切片自水中取出，吸干水分后置于4ml浓度为50mMTris-HCl缓冲溶液(pH值为10.0)中，4℃搅拌2h，超声处理1min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4℃搅拌2min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2次。将组织切片取出吸干水分后冻干，获得基质类成分B。

Claims (5)

1.一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获得动物软骨组织，将附带组织及残留血液清除干净；

2)用冷冻切片机将软骨组织切成5-20μm的切片，将切片于-80℃快速冰冻后，再于室温完全融化，重复上述冻融过程1-4次；

3)将组织切片1g置于4-10ml提取溶液中，在4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的提取溶液中；

4)重复步骤3)2-4次，组织切片取出后吸干水分，将所得提取液合并，置于超滤离心管中，截留分子量为3-10kD，在500-5000r/min范围内离心30min-6h；

5)向步骤4)所得浓缩液中加入4-10ml超纯水，在500-5000r/min范围内离心30min-6h；重复操作2-4次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A；

6)将步骤4)所得组织切片置于4-10ml清洗溶液中，在4-37℃搅拌1-5h，超声处理1-5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的清洗溶液中，重复操作2-4次；

7)将步骤6)所得组织切片置于4-10ml超纯水中，在4-37℃搅拌1-10min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中，重复上述步骤(7)的操作2-4次；

8)取出步骤7)中的组织切片，冻干后获得基质类成分B。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

附带组织为下列组织中的一种，半月板，软骨膜，韧带，肌肉。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

提取溶液为下列溶液中的一种，超纯水，生理盐水或PBS溶液；浓度范围在0mM-500mM之间，pH为5-9。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

清洗溶液为下列溶液中的一种，Tris-HCl缓冲溶液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液；浓度范围在50mM-500mM之间，pH为7-11。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：当所述动物软骨组织为鹿茸软骨组织时，其步骤1)如下：

使用真空泵将鹿茸中残留的鹿血抽吸干净，用生理盐水清洁鹿茸表面并用75％酒精消毒；将鹿茸组织切成薄片，将鹿茸置于冷生理盐水中，搅动1-5min；取出鹿茸组织沥干后，置于新的冷生理盐水中，搅动1-5min；重复上述操作2-4次。