CN103330719B

CN103330719B - 一种袋鼠骨素及其提取方法

Info

Publication number: CN103330719B
Application number: CN201310153713.7A
Authority: CN
Inventors: 屈贤琴; 金星亮; 杨五宁; 金肖强
Original assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: NANJING YOUER BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: CN103330719A

Abstract

本发明公开了一种袋鼠骨素及其提取方法，取袋鼠骨清洗、碾碎后，酸消化以去矿物质化，利用蛋白质提取液进一步多次消化，然后用有机溶剂浸提去除杂质，干燥获得袋鼠骨素蛋白颗粒。本发明的提取方法获得的蛋白颗粒每克含有蛋白质9.5～10.7mg，骨钙素4.8～6.13mg，骨形成蛋白4.35×10^-3ng。本发明的方法可从袋鼠骨中提取五百多种蛋白质混合物，包括骨钙素、骨粘连蛋白、骨形成蛋白、碱性磷酸酶、胰岛素样生长因子等，其中与骨代谢相关的蛋白有三十多种，对诱导骨髓间充质干细胞分化为骨细胞和软骨细胞有较理想的促进作用，可用于防治骨关节疾病如骨质疏松症等。本发明的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒含有的蛋白质及相关有效成分多，提取效果好，可作为防治骨关节疾病的保健品和药品的基本原料，提高了袋鼠产品的品质和效果。

Description

一种袋鼠骨素及其提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种袋鼠骨素及其提取方法。

背景技术

袋鼠是澳洲的特有的物种，袋鼠工业也因此得到重视。目前袋鼠皮革和袋鼠肉都得到广泛的开发，而袋鼠骨的应用则很少，尽管目前市场上有些公司出售袋鼠骨胶囊，但该保健品仅仅通过简单的研磨制成，价格昂贵且保健效果低。

动物骨骼中含有如骨钙素、骨粘连蛋白、骨形成蛋白、碱性磷酸酶、胰岛素样生长因子等，对于钙质补充、防治骨质疏松、增强体质有较好的效果，可用于补钙，治疗骨质疏松症。而袋鼠骨中含有较多的有效成分，却没有进行很好的开发。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种袋鼠骨素的提取方法；本发明的另一个目的是提供前述方法提取获得的袋鼠骨素蛋白。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种袋鼠骨素的提取方法包括如下步骤：

（1）去除与袋鼠骨相连的软组织，PBS清洗后剁碎、碾压获得袋鼠骨碎片；

（2）向所述袋鼠骨碎片中加入盐酸溶液，于4℃下封盖消化，清洗后获得去矿化骨碎片；

（3）向所述去矿化骨碎片中加入蛋白质提取液，于4℃下封盖消化，然后离心收集上层液；该步骤再重复1～2次；

其中，所述蛋白质提取液中包括PBS、盐酸胍、Tris、脱氧胆酸、SDS、氟化钠、焦磷酸钠、PMSF、抑肽酶、亮肽素、胃酶抑素A；

（4）将所述步骤（3）收集到的上层液与预冷的丙酮-三氯乙酸混合溶液混合，加盖密封，低温静置沉淀蛋白质，然后高速离心，除去上清液；

（5）开放空间挥发有机溶剂，获得干燥的袋鼠骨素蛋白颗粒。

作为本发明的进一步优化，所述步骤（4）之后还通过加入预冷丙酮浸提有机杂质，高速离心后出去上清液。该步骤与所述步骤（4）优选条件下，是在零下20摄氏度浸提，效果最好。

为符合袋鼠骨细胞特质，所述步骤（2）中的盐酸溶液浓度为1.2mol/L，每克袋鼠骨碎片中加入6～8ml。在该浓度下盐酸消化速度较快，且可较完整地保留活性物质的有效性。

所述步骤（3）中，每克去矿化袋鼠骨碎片中加入8～10ml所述蛋白质提取液，所述提取液包括PBS、5～10mol/L盐酸胍、0.01～0.2mol/L Tris、20～30mmol/L脱氧胆酸、0.2%SDS、15～25mmol/L氟化钠、15～25mmol/L焦磷酸钠、1～3mmol/L PMSF、2～4mmol/L抑肽酶、3～5mmol/L亮肽素、2～4mmol/L胃酶抑素A。所述步骤（3）的消化时间为60～90小时，作为优选方案，消化时间为72小时。

作为本发明的最优方案，所述步骤（3）中，蛋白质提取液包括PBS、8mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris、24mmol/L脱氧胆酸、0..2%SDS、20mmol/L氟化钠、20mmol/L焦磷酸钠、2mmol/L PMSF、3.08mmol/L抑肽酶、4.2mmol/L亮肽素、2.91mmol/L胃酶抑素A。

本发明所述袋鼠骨取自目前所有品种的袋鼠，作为优选方案，所述袋鼠骨取自东部灰大袋鼠（Macropus giganteus）。

对于本发明上述袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒，经过Bradford法分光光度计测定，所述袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质9.5～10.7mg。

经测定，所述袋鼠骨素蛋白颗粒中每克含有骨钙素4.8～6.13mg，骨形成蛋白4.35×10^-3ng。

有益效果：本发明的袋鼠骨素提取方法可从袋鼠骨中提取五百多种蛋白质混合物，包括骨钙素、骨粘连蛋白、骨形成蛋白、碱性磷酸酶、胰岛素样生长因子等，其中与骨代谢相关的蛋白有三十多种，对诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞有较理想的促进作用，作为可治疗骨关节疾病保健品和药物的原料。本发明的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒含有的蛋白质及相关有效成分多，提取效果好，提高了袋鼠产品的市场品质和效果。

附图说明

图1是试验例3中人类骨髓间充质干细胞染色后下高倍显微镜成像图；

图2是试验例3中通过加入本发明袋鼠骨素后诱导分化获得的成骨细胞在碱性磷酸酶染色下的高倍显微镜成像图；

图3是试验例3中通过加入本发明袋鼠骨素后诱导分化获得的软骨细胞在天狼猩红染色下的高倍显微镜成像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一种袋鼠骨素的提取方法，包括步骤如下：

（1）选取健康袋鼠的骨骼，由于澳洲袋鼠工业比较发达，而东部灰大袋鼠（Macropus giganteus）的种群数量较大，袋鼠肉和袋鼠皮加工业较发达，因此选用其作为袋鼠骨的原料。将袋鼠骨用利刀去除与袋鼠骨相连的软组织，PBS清洗后剁碎、碾压获得袋鼠骨碎片，碎片的长宽为2～10毫米，厚度为1～2毫米，然后移至玻璃容器内。

（2）向袋鼠骨碎片中加入盐酸溶液，盐酸溶液浓度为1.2mol/L，每克袋鼠骨碎片中加入6～8ml，于4℃下封盖消化12小时去矿化，用纯净水清洗3次后，移液吸取洗液，获得去矿化骨碎片。

（3）向去矿化骨碎片中加入蛋白质提取液，于4℃下封盖消化72小时，每克去矿化袋鼠骨碎片中加入8～10ml蛋白质提取液，提取液包括PBS、5～10mol/L盐酸胍、0.01～0.2mol/L Tris、20～30mmol/L脱氧胆酸、0.2%SDS、15～25mmol/L氟化钠、15～25mmol/L焦磷酸钠、1～3mmol/L PMSF、2～4mmol/L抑肽酶、3～5mmol/L亮肽素、2～4mmol/L胃酶抑素A。

优选地，蛋白质提取液包括PBS、8mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris、24mmol/L脱氧胆酸、0..2%SDS、20mmol/L氟化钠、20mmol/L焦磷酸钠、2mmol/L PMSF、3.08mmol/L抑肽酶、4.2mmol/L亮肽素、2.91mmol/L胃酶抑素A。

然后于7500xg25℃离心10分钟，收集上层液；该步骤再重复1～2次，离心获得的沉渣丢弃。

（4）将步骤（3）收集到的上层液按4:1的体积比，与预冷的丙酮-三氯乙酸混合溶液混合，其中丙酮-三氯乙酸混合溶液中，三氯乙酸按体积占10%。以上溶液混合后加盖密封，于零下20摄氏度静置沉淀蛋白质，然后15000x g高速离心，除去上清液。

然后加入同体积的100%丙酮，于零下20摄氏度恒温15分钟，再以15000xg离心5分钟，移除上层液。

（5）开放空间挥发有机溶剂，1～2小时后即可获得干燥的袋鼠骨素蛋白颗粒。

对于本发明上述袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒，经过Bradford法分光光度计测定，袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质9.5～10.7mg。

在将上述袋鼠骨素蛋白颗粒通过Tris-HCl/1%SDS SDS-PAGE电泳进行蛋白质组学分析，将凝胶上分级的蛋白质切割回收，进行凝胶中胰蛋白酶的消化，采用纳升级反向高效液相色谱进行进一步分割和定性，经测定，该方法获得的袋鼠骨中可提取到蛋白质532种，其中，袋鼠骨素蛋白颗粒中每克含有骨钙素4.8～6.13mg，骨形成蛋白4.35×10^-3ng。

试验例1

袋鼠被誉为世界上跳得最远的哺乳动物，现有研究发现袋鼠的骨骼中，和骨代谢有关的活性成分其生物活性和吸收能力较强。本发明采用袋鼠骨，特别是采用东部灰大袋鼠获得的袋鼠骨素，提取效率高，经鉴定含有的有效成分也高。

本试验通过选取不同动物，采用和实施例1相同的提取方法，获得若干干燥颗粒状样品，然后在相同条件下进行SDS-PAGE电泳分级、切割、回收，以骨钙素和骨形成蛋白作为主要参考指标，结果如表1所示：

表1不同物种相同提取方法下蛋白提取效果

试验例2

现有技术往往通过碾压、粉碎等简单的方法获得骨粉，有的也通过加热，导致其有效成分损失极大，其利用率大大受到影响。而本发明通过先后通过酸消化和酶消化，蛋白质有效成分的提取效果显著。下面结合试验进行说明。

选取东部灰大袋鼠骨骼，分为3组进行试验，组A采用如实施例1的方式提取，组B采用如实施例1中步骤（1）、（2）后，粉碎成细末，通过Bradford法分光光度计测定蛋白质含量，结果如表2所示：

表2不同提取方法对蛋白质提取率的影响

虽然目前消化骨组织并获得骨蛋白质和有效成分的方法很多，但本方法的蛋白质提取液实现了骨蛋白提取的最优化。通过粉碎等机械方式获得的有效蛋白质成分极低，而本发明的方法提取效率高，蛋白质在提取过程中损失少，为其作为防治骨关节疾病保健品和药物的原料，推广相关产品市场奠定了有效的保障。

试验例3

利用人类骨髓间充质干细胞（如图1所示）在含10%小牛血清（FBS）的DMEN完全培养基（购于Stem Cell Technologies,加拿大）以5000/cm²密度接种扩增传代，然后加入袋鼠骨素后诱导分化为成骨细胞和软骨细胞。成骨细胞采用碱性磷酸酶染色，软骨细胞采用天狼猩红染色，染色后高倍显微镜下骨细胞图如图2、图3所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1. 一种袋鼠骨素的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

（3）每克去矿化骨碎片中加入8~10 ml蛋白质提取液，于4℃下封盖消化，然后离心收集上层液；该步骤再重复1~2次；

其中，所述蛋白质提取液包括PBS、5~10 mol/L 盐酸胍、0.01~0.2 mol/L Tris、20~30 mmol/L 脱氧胆酸、0.2% SDS、15~25 mmol/L 氟化钠、15~25 mmol/L 焦磷酸钠、1~3 mmol/L PMSF、2~4 mmol/L 抑肽酶、3~5 mmol/L 亮肽素、2~4 mmol/L 胃酶抑素A；

2. 根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法，其特征在于：

所述步骤（3）中，蛋白质提取液包括PBS、8 mol/L 盐酸胍、0.1 mol/L Tris、24 mmol/L 脱氧胆酸、0.2% SDS、20 mmol/L 氟化钠、20 mmol/L 焦磷酸钠、2 mmol/L PMSF、3.08 mmol/L 抑肽酶、4.2 mmol/L 亮肽素、2.91 mmol/L 胃酶抑素A。

3. 根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法，其特征在于：

所述步骤（4）之后还通过加入预冷丙酮浸提有机杂质，高速离心后出去上清液。

4. 根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法，其特征在于：

所述步骤（2）中的盐酸溶液浓度为1.2 mol/L，每克袋鼠骨碎片中加入6~8 ml。

5. 根据权利要求1所述的一种袋鼠骨素的提取方法，其特征在于：所述袋鼠骨取自东部灰大袋鼠（Macropus giganteus）。

6. 如权利要求1所述一种袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒，其特征在于：所述袋鼠骨素蛋白颗粒每克含有蛋白质9.5~10.7 mg。

7. 根据权利要求6所述的一种袋鼠骨素的提取方法获得的袋鼠骨素蛋白颗粒，其特征在于：所述袋鼠骨素蛋白颗粒中每克含有骨钙素4.8~6.13 mg，骨形成蛋白4.35×10^-3ng。