CN102732591A

CN102732591A - 一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法

Info

Publication number: CN102732591A
Application number: CN2012102412613A
Authority: CN
Inventors: 王常青; 樊迎
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Linyi Shansong Biological Products Co., Ltd.
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN102732591B

Abstract

本发明提供了一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法，步骤包括：将大豆乳清废水进行絮凝处理除杂后，按每升乳清水加入0.5g～1.5g半胱氨酸，然后在pH2～3、温度40℃～55℃条件下，以每克蛋白加入1000-2500活力单位的酸性蛋白酶，水解5h～7h；之后按1000-2500U/g加入胃蛋白酶，在35～45℃、pH2～3条件下，水解3h～5h；水解液经灭酶、离心、过滤、浓缩与干燥得到大豆乳清多肽。动物试验证明，本发明大豆乳清多肽具很强的抗氧化和抗急性肝损伤作用。该多肽中，1000Da以下的小分子低聚肽占80%以上。人群试食口感好，没有副作用，可以作为普通营养和保健食品的原料。

Description

一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及大豆乳清多肽的制备，具体涉及生产豆类分离蛋白及豆制品产生的乳清废水的深加工，更具体地说是一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法。

背景技术

大豆乳清蛋白存在于加工大豆分离蛋白和豆制品过程中排放的废水中，生产1吨的分离蛋白会排放20～30m³的乳清废水。初步估算，每加工1吨的分离蛋白所排放的乳清废水中含有乳清蛋白为70kg左右，因此，深入开发应用豆类乳清，对于豆类综合利用和环境保护方面都具有积极意义。近年来已有利用大豆分离蛋白加工抗肿瘤多肽和抗疲劳大豆多肽的报道，如刘娜等在中国实验诊断学上发表的论文《大豆寡肽抗疲劳作用的实验研究》，戚颖欣等在食品科学杂志上发表的《大豆多肽对小鼠急性肝损伤保护作用的研究》，所用原料均为分离蛋白或多肽。目前尚未见到利用大豆类乳清水解多肽开发保肝和抗氧化食品的报道。

已有的关于酶法水解乳清蛋白制备多肽的研究，如专利CN101519426A用碱性蛋白酶水解乳清蛋白，得到具有较高生理活性的多肽片段,分子量分布在100～2800Da之间；专利CN101785521A采用蛋白酶U和蛋白酶A复合水解得到乳清水解多肽，产物抗原性低、苦味小。这些酶法水解乳清多肽的特点是，①在水解前均对乳清蛋白进行热处理使其变性，加大能源耗费;②这些方法中酶都是一次性直接大量加入的，这样容易破坏水解时底物与酶的平衡关系，有相当一部分酶在加入后根本没有机会参与反应而在罐内慢慢降低酶活甚至失效（温度、pH值及时间会使酶活部分丧失）；况且一次性投入大量的酶会造成前期反应过快，过早产生大量游离氨基酸而使得多肽得率有所降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法。该方法酶解时间短、能耗较低，且使得1000Da以下小分子乳清多肽得率高，游离氨基酸含量较低。

本发明提供的一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法，包括以下步骤：

1）、将大豆乳清水用常规方法进行絮凝沉淀，除去沉淀物，控制上清液的乳清蛋白的含量在4～5gL，每升上清液加入0.5g～1.5g半胱氨酸，在22-40℃保温静置6～12h；

2）、在pH2～3、温度40℃～55℃条件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500活力单位（U）的酸性蛋白酶，分2～3次加入，每次加酶后水解1～2.5小时；

3）、在pH2～3、35℃～45℃条件下，按每克乳清蛋白加入1000-2500U的胃蛋白酶，分2～3次加入，每次加酶后水解1～2小时；

4）、灭酶、离心、过滤、浓缩、干燥，得到大豆乳清多肽。

所述的酸性蛋白酶可以是3.350酸性蛋白酶或537酸性蛋白酶，优选3.350酸性蛋白酶。

所述的大豆可以是黑豆、黄豆或青豆。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1.在本发明水解乳清蛋白之前，加入半胱氨酸处理，目的是用半胱氨酸改变乳清蛋分子内部的二硫键，使蛋白质容易被进一步水解；此外，利用半胱氨酸具有的还原能力和特殊的理化性质，当其与乳清蛋白结合后，会使乳清蛋白的结构和功能发生改变，从而增强抗肝损伤和抗氧化活性。试验发现，与传统的乳清蛋白热处理相比，半胱氨酸处理能有效提高酶解效率，多肽得率能提高8%～17%，同时也能降低耗能，符合绿色节能的宗旨。

2.先用酸性蛋白酶进行一次水解，然后用胃蛋白酶进行二次水解，这种复合酶水解，可以得到更多的小分子小黑豆乳清多肽。与用单酶水解和其他酶的复合水解相比，1000Da以下小肽所占比例达到80%以上，且游离氨基酸含量少，抗氧化功能更强。

3.先分批加入酸性蛋白酶，然后分批加入胃蛋白酶所得的多肽与一次性加入蛋白酶水解相比，游离氨基酸含量明显降低。

4.体外抗氧化实验表明，该多肽具有明显的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和的作用，其总氧化性与Vc相近。动物喂养试验发现，该大豆乳清多肽不但具有保肝和预防化学性肝损伤的保健作用，而且还能起到延缓皮肤衰老、恢复皮肤弹性等美容效果。经人体试食发现，该大豆乳清多肽口感好，没有任何副作用。本发明制备的大豆乳清多肽既可以用于功能性食品和化妆品，也可以用于一般食品。

附图说明

图1小鼠肝组织切片H.E染色图，其中：A基础组，B模型组，C多肽组

具体实施方式

实施例1

将黑豆乳清水经过常规絮凝后，离心除去絮凝沉淀；除沉的乳清水冷藏待用。该乳清水中，乳清蛋白的含量为4.16g/L。

取500mL黑豆乳清水（即相当于取2.08g乳清蛋白），加入0.3g半胱氨酸，搅匀，22℃放置12h；然后将pH调至2.0，称取93mg3.350酸性蛋白酶（酶活力4.47万U/g），先将1/3的酸性蛋白酶加入乳清水，置于45℃水浴中进行恒温水解，调pH，保持pH2；水解2h后再加入1/3的酸性蛋白酶，再水解2h后加入最后1/3的酸性蛋白酶，继续水解2h；将水浴锅的温度调至37℃，保持pH2不变，称取1.26g的胃蛋白酶（酶活力为3300U/g），先加入0.42g的胃蛋白酶水解1h，再加入0.42g的胃蛋白酶水解2h，最后加入0.42g的胃蛋白酶水解2h；水解结束后，沸水浴中灭酶8min；水解液在4000r/min离心10min，过滤，滤液经3000Da超滤膜分离、收集超滤滤出液进行浓缩和喷雾干燥，得到大豆乳清多肽。

经分析，多肽得率为91.153%；Superdex G-25凝胶色谱分析计算得知，样品中小于1000Da的多肽含量在90%以上。该水解液采用邻苯三酚-分光光度法和硫酸亚铁-分光光度法等方法进行体外抗氧化试验，结果表明，此产品对对羟自由基(·OH)的清除率高达99.743%，对超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)的清除率达到56.056%

将该多肽按照9g/kg m_b·d和3g/kg m_b·d的剂量饲喂小鼠30天，结果发现黑豆乳清多肽能显著降低CCl₄急性肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的活力（p<0.05）以及肝脏中丙二醛（MDA）的含量（p<0.01）和甘油三酯(TG)的含量（p<0.01），且能明显升高肝脏中谷胱甘肽(GSH)的含量（p<0.01），其中以大剂量组的效果最佳，能起到保肝护肝的作用。数据见表1和表2。

表1黑豆乳清多肽对CCl₄肝损伤小鼠血清ALT、AST活力的影响

注：*表示与模型组比较差异显著，p<0.05；**表示与模型组比较差异极显著，p<0.01。

表2黑豆乳清多肽对CCl₄肝损伤小鼠肝脏TG、MDA和GSH含量的影响

从小鼠的肝脏切片可以观察到，基础组小鼠的肝细胞大小均匀、整齐，肝小叶轮廓清晰，细胞分界清，细胞核圆而清晰，胞质丰富，未见细胞变性和异常。模型组肝细胞严重损伤，小叶界限不清，细胞索紊乱，肝细胞广泛性水样变性，核膜皱缩，可见气球样变。多肽组的肝细胞坏死、气球样变、水样变性和胞浆凝聚等病变情况都较模型组有不同程度减轻，接近于基础组。可见，该小黑豆乳清多肽对急性肝损伤有明显的保护作用（见图1）。

将以上多肽浓缩成10mg/ml液体，给有肝硬化病变的12名志愿患者口服1个月，每人每天饮用30～50mL，反应口感好，没有出现任何副作用。1个月后检查肝硬化病情，均有不同程度的减轻。

皮肤抗老化试验：把该黑豆乳清多肽涂抹于经过脱毛的小鼠背部，之后对小鼠进行紫外照射（中波紫外线照射强度为160uW/cm²，长波紫外线照射强度为1.1mW/cm²）。照射频率为每天照射2次，每次60至90分钟，持续照射至累计照射剂量达长波强度为300J/cm²，中波强度为6.3J/cm²，照射14周。试验结束时，处死小鼠，取被照射部位的皮肤，测定其中的MDA（丙二醛）、HYP（羟脯氨酸）的含量和CAT（过氧化氢酶）的活力，结果表明坚持涂抹该多肽的小鼠皮肤与模型组相比，皮肤中MDA含量明显降低，HYP含量和CAT活力显著提高，详见表3。

表3黑豆乳清多肽对光老化小鼠皮肤HYP、MDA和CAT的影响

将该多肽涂抹在10位无皮肤病的健康女性志愿者妇上臂，连续涂抹1个月，不涂抹其它防护剂；试验结束后发现，涂抹多肽的部位比未涂抹的部位，红斑和色沉有一定程度减轻。

实施例2

将黄豆乳清水经过常规絮凝后，离心除去絮凝沉淀；除沉的乳清水冷藏待用。经分析得知乳清蛋白的含量为4.50mg/mL。

取冷藏待用的黄豆乳清水500mL（即相当于取2.25g乳清蛋白），加入0.45g半胱氨酸，搅匀，30℃放置8h；然后将pH调至2.5，称取112mg537酸性蛋白酶（酶活力为4.52万U/g），先将1/3的酸性蛋白酶加入乳清水中，置于40℃水浴中进行恒温水解，调PH，保持PH2.5；水解1h后再加入1/3的酸性蛋白酶，再水解2h后加入最后1/3的酸性蛋白酶，继续水解2h；将水浴锅的温度保持40℃不变，pH调至2，称取1.38g的胃蛋白酶（酶活力为3300U/g），先加入0.69g的胃蛋白酶水解1h，再加入0.69g的胃蛋白酶水解2h；,二次水解结束后，沸水浴中灭酶8min；水解液在4000r/min离心10min，过滤，滤液经3000Da超滤膜分离、收集超滤滤出液进行浓缩和喷雾干燥，得到大豆乳清多肽。

该样品多肽得率为83.44％，游离氨基酸含量为0.308mg/mL，Superdex G-25凝胶色谱分析计算得知，样品中小于1000Da的多肽含量在86左右。该水解液采用邻苯三酚-分光光度法和硫酸亚铁-分光光度法等方法进行体外抗氧化试验，结果表明，此产品对对羟自由基(·OH)的清除率达到87.645％，对超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)的清除率达到51.344％，说明该多肽具有一定的抗氧化能力。

体内抗肝损伤试验：将该黄豆乳清多肽按照9g/kgm_b·d的剂量加入到饲料中，饲喂小鼠30天，试验结束时，CCl₄经胃给药（5mL/kgm_b）建成急性肝损伤模型；试验结束后，处死动物，测定其血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的活力水平和肝脏丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）和谷胱甘肽（GSH）的含量。结果显示，该法所得的黄豆乳清多肽能显著降低肝脏中MDA的含量（p<0.01）和TG的含量（p<0.05）；ALT（p<0.01）和AST（p<0.05）的活力水平也有不同程度的降低，说明该多肽具有一定的抗肝损伤作用。

把该产品涂抹于紫外光老化小鼠背部皮肤，持续14周，试验结束时，处死小鼠，取被照射部位的皮肤，测定其中的MDA（丙二醛）、HYP（羟脯氨酸）的含量和CAT（过氧化氢酶）的活力，结果表明坚持涂抹该多肽的小鼠皮肤与模型组相比，皮肤中MDA含量降低极显著（p<0.01），HYP含量和CAT活力显著提高（p<0.05），说明该黄豆乳清多肽具有体内抗氧化的作用。

实施例3

将黑豆乳清水经过常规絮凝后，离心除去絮凝沉淀；除沉的乳清水冷藏待用。经分析得知乳清蛋白的含量为4.64mg/mL。分别用设半胱氨酸处理组和不用半胱氨酸处理组。

取冷藏的黑豆乳清水500mL（即相当于取2.32g乳清蛋白），加入0.75g半胱氨酸，搅匀，40℃放置6h；然后将pH调至3.0，称取126mg3.350酸性蛋白酶（酶活力为4.47万U/g），先将80mg的酸性蛋白酶加入乳清水中，置于42℃水浴锅中进行恒温水解，调pH，保持pH=3.0，水解2h后，再加入其余的酸性蛋白酶，再水解3h；3.350酸性蛋白酶水解结束后，将水浴锅的温度调至38℃，调节pH到2.5，称取1.41g的胃蛋白酶（酶活力为3300U/g），先将0.7g的胃蛋白酶加入乳清水中，水解1.5h后再加入剩余的胃蛋白酶，继续水解水解2.5h;水解结束沸水浴灭酶8min，水解液在4000r/min离心10min，过滤，滤液经3000Da超滤膜分离、收集超滤滤出液进行浓缩和喷雾干燥，得到大豆乳清多肽。

该样品的多肽得率在85.32%，小于1000Da的多肽含量占多肽的88.3%，游离氨基酸含量为0.156mg/mL。

再取同批冷藏待用的黑豆乳清水500mL（即相当于取2.32g乳清蛋白），不加入半胱氨酸,但是采用95℃热处理10min,之后的操作完全同上。该样品的多肽得率在71.2%，小于1000Da的多肽含量占多肽总量的78.12％，游离氨基酸含量为0.28mg/mL。

可以看出，加入半胱氨酸对于多肽得率有一定程度的提高，对于游离氨基酸的含量也有小幅度的降低；经体外抗氧化试验测定可知，用半胱氨酸处理的黑豆乳清多肽比不用半胱氨酸的乳清多肽清除自由基与总抗氧化能力均有大幅度提高，详见表4（表中各溶液浓度均为4mg/mL）。

表4几组溶液清除自由基与总抗氧化能力的比较

可以看出，乳清水原液的清除自由基和总抗氧化能力是很低的，当加入半胱氨酸水解后所得到的多肽的这两种能力明显上升，几乎与相同质量浓度的Vc溶液的值相当，远高于单独的多肽溶液和半胱氨酸溶液的值，说明半胱氨酸与多肽具有协同作用，使得水解得到的多肽具有比原本更强的抗氧化能力。

用半胱氨酸处理和不用半胱氨酸处理的两种多肽按照9g/kgm_b·d的剂量加入到饲料中，饲喂CCl₄肝损伤模型小鼠30天，发现加入半胱氨酸协助水解所得的多肽能显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力（p<0.01）以及肝脏中丙二醛的含量（p<0.01）和甘油三酯的含量（p<0.01），且能明显升高肝脏中谷胱甘肽的含量（p<0.05）。不加半胱氨酸的多肽组动物与模型组相比，在谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力提高方面有一定的效果（p<0.05），其他检测指标均组间差异不显著，说明经半胱氨酸处理的黑豆乳清，其水解所得多肽的抗化学性肝损伤作用较强。

把经半胱氨酸处理和不经半胱氨酸处理的这两种多肽分别涂抹于紫外光老化小鼠背部皮肤，持续14周，试验结束时，处死小鼠，取被照射部位的皮肤，测定其中的MDA（丙二醛）、HYP（羟脯氨酸）的含量和CAT（过氧化氢酶）的活力，结果表明坚持涂抹经半胱氨酸处理的多肽的小鼠皮肤与模型组相比，皮肤中MDA含量降低极显著（p<0.01），HYP含量和CAT活力显著提高（p<0.01）；涂抹未经半胱氨酸处理的多肽的小鼠皮肤与模型组相比，皮肤中MDA含量降低HYP含量升高均不明显，CAT活力升高幅度较大，但也无统计学上的差异；说明经半胱氨酸处理的黑豆乳清，其体内抗氧化能力较未经半管氨酸处理所得的多肽有明显提高。

Claims

1.一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、将大豆乳清水用常规方法进行絮凝沉淀，除去沉淀物，控制上清液的乳清蛋白的含量在4～5g/L，每升上清液加入0.5g～1.5g半胱氨酸，在22-40℃保温静置6～12h；

4）、灭酶、离心、过滤、浓缩、干燥，得到大豆乳清多肽。

2.如权利要求1所述的一种具有保肝和抗氧化作用的大豆乳清多肽的制备方法，其特征在于，所述的酸性蛋白酶是3.350酸性蛋白酶或537酸性蛋白酶。