CN1526299A - 一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物蛋白的开发利用领域，以脱脂的小麦胚芽为原料，经过蛋白质提取和酶法水解，得到的包含多种强ACE抑制活性肽的水解物。本发明得到的一种小麦胚芽蛋白水解物，为一种多肽类化合物的混合物，混合物中包含有Ala－Met－Tyr三肽和Val－Trp二肽等多种肽类化合物。该小麦胚芽蛋白水解物通过对血管紧张素I转化酶(ACE)的抑制作用来降低高血压患者的血压，是一种安全有效的降血压健康制品原料，且该水解物同时具有提高免疫力和抗氧化作用。

Description

一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法与用途
技术领域：
本发明涉及植物蛋白的开发利用领域，特指一种含有降血压活性肽的小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法与用途。
技术背景：
大量的医学研究表明，血管紧张素I转化酶(Angiotension-I ConvertingEnzyme，ACE)是引起人体血压升高的重要物质基础。
已有的研究表明，以食物蛋白为原料通过酶解技术生产的蛋白水解物中含有的一些小的多肽类物质，具有显著的降血压功能，是很好的ACE抑制剂(下称ACEI)，无副作用，为取代人工合成的ACEI提供了一条新的途径。
国外已经发表或公开的利用食物蛋白制备具有降血压功能ACEI的原料包括：脱水鲣鱼、牛酪蛋白、脱水鲣鱼、磷虾、金枪鱼、沙丁鱼、玉米、大豆、酒糟等。在我国公开和授权的专利包括：“血管紧张素I转化酶抑制物质”(公开号CN 1351174 A)，以裙带菜为原料，公开了裙带菜ACE抑制物质及其降压效果的动物实验，但未涉及肽的结构；“一种海参酶解液系列产品及其加工方法”(专利号99113247.5)，公开了通过蛋白酶水解海参，得到的一种含2～10肽的活性肽混合物，据称有降压作用，但未提及对ACE的拟制作用和肽的结构；“降压奶粉”(公开号CN 1351174 A)，涉及多肽的降压作用，但没有提及对ACE的抑制作用和肽的结构。这些研究表明了食品蛋白质降血压肽来源的丰富性和多样性。
我国是一个农业大国，盛产小麦，产量位居世界第三，小麦胚芽是小麦制粉的副产品，小麦胚芽中的油脂有很高的营养价值，脱脂麦胚又是小麦胚芽油生产的副产品，脱脂麦胚中含有34％左右的蛋白，小麦胚芽蛋白是优质蛋白，本身就含有丰富的谷胱甘肽，但国内外还没有选择小麦胚芽为原料制备具有降血压功能的ACE抑制物的相关专利技术公开。
发明内容：
本发明的目的是提供一种以脱脂的小麦胚芽为原料，经过蛋白质提取和酶法水解，得到的包含多种强ACE抑制活性肽的水解物。ACE抑制活性肽是一些由特定的氨基酸按一定的顺序连接而成的特殊的肽类物质。
本发明得到的一种小麦胚芽蛋白水解物，为一种多肽类化合物的混合物，混合物中包含有Ala-Met-Tyr三肽和Val-Trp二肽等多种肽类化合物。该小麦胚芽蛋白水解物通过对血管紧张素I转化酶(ACE)的抑制作用来降低高血压患者的血压，是一种安全有效的降血压健康制品原料。该水解物同时具有提高免疫力和抗氧化作用。
本发明的另一目的是提供一种上述小麦胚芽蛋白水解物的制备方法。
本发明上述目的是通过以下技术手段实现的。
将脱脂小麦胚芽用粉碎机粉碎后过筛，称取一定量的小麦胚芽粉加入蒸馏水溶解，调PH值至碱性，搅拌，进行蛋白质提取；随后离心，取上清液，调PH值至蛋白质等电点，待蛋白质沉淀后，离心，取沉淀物；然后用蒸馏水溶解并调PH值至7，通过脱盐、干燥，得到小麦胚芽蛋白质粉。
称取一定量上述制备而得的小麦胚芽蛋白，加蒸馏水溶解，调PH值至酶作用最适PH值，于恒温水浴锅中加热至酶作用温度，加入一定量的蛋白酶，保温，进行酶解反应，酶解完成后，加热100℃煮沸15min，终止酶解过程。对酶解物进行离心除去沉淀，用上清液，干燥成粉剂，得到活性肽的水解物，进行ACE抑制活性检测。所使用的蛋白酶包括：胰蛋白酶、木瓜蛋酶、Umanizyme、Neutrase、碱性蛋白酶、Flavorzyme、中性蛋白酶等内切蛋白酶，以及由内切蛋白酶构成的复合酶。
对上述得到的活性肽水解物加水溶解，进行超滤，随后调至PH值3～4，加入一定比例的活性碳，搅拌，真空过滤，完成脱色。脱色后的小麦胚芽蛋白水解物可以直接配制成口服液；也可以经过浓缩和干燥，然后直接服用，或与赋形剂混合，制成粉剂、片剂、胶囊等，另外还可以作为食品添加剂，添加于其它食品中。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步阐述：
实施例1
将脱脂小麦胚芽(蛋白质含量34.23％)用粉碎机粉碎后过100目筛，称取50g小麦胚芽粉加入500mL蒸馏水，称5g NaCl用少量水溶解加入上述溶液中，调PH值至9.0，用磁力搅拌器搅拌30min，再于5000r/min离心10min，取上清液，调PH值至4.0，待大片白色沉淀完全后，二次离心10min，取沉淀物，用蒸馏水溶解并调PH值至7，脱盐，干燥，得到用于蛋白酶处理的小麦胚芽蛋白质粉。
称取上述5g的小麦胚芽蛋白质粉，加入125ml蒸馏水溶解，按照24AU/kg的比例加入蛋白酶，用氢氧化钠和盐酸调PH值至酶作用最适值(参见表1)，保持一固定温度(参见表1)下水解7h。水解过程中，不断调整PH值使其值保持在恒定值。水解结束后，加热沸腾15min，终止酶解，然后将酶解物进行离心，除去沉淀物，取上清液，干燥成粉剂，测定其ACE抑制活性。
对降压肽的体外活性测试是利用ACE与三肽Hip-His-Leu(马尿酰-组氨酰-亮氨酸，简称HHL)反应生成的马尿酸(Hip)和二肽His-Leu来定量的，以马尿酸的生成量来定量。
ACE抑制活性的测定用下述的高效毛细管电泳法。
取20mg的上述蛋白质酶解物干粉，溶于10mL的PH值8.3的硼酸缓冲液中，吸取20μL，加入5μL ACE酶液(250mU/mL，来自Sigma公司)于37℃保温5min，随后加入50μL 6.5mM的HHL(来自Sigma公司)，在37℃恒温水浴中保温30min，然后加入85μl 1N的HCl中止反应，用毛细管电泳自动进样分析。电泳条件：温度25℃，进样时间3s，分离电压8.3kV，检测波长228nm。
1单位ACE酶活定义为在37℃、1min内催化HHL形成1μmol马尿酸的酶量。
Figure A0315829200051
       表1实施例1中的蛋白酶酶解条件和对ACE活性的抑制率
  酶类   作用条件  对ACE活性的抑制率(％)
  胰蛋白酶   PH值8.0/50℃  59.26
  Umanizyme   PH值7.0/50℃  80.10
  木瓜蛋酶   PH值6.0/60℃  21.36
  中性蛋白酶   PH值7.0/60℃  30.31
  Flavorzyme   PH值6.0/50℃  46.71
  Neutrase   PH值7.0/45℃  33.54
  胃蛋白酶   PH值1.8/37℃  37.86
碱性蛋白酶+胰蛋白酶   PH值10.0/50℃→PH值9.0/45℃ 75.13％
胰蛋白酶+Flavorzyme   PH值8.0/45℃→PH值6.5/50℃ 81.00％
实施例2
称取2g实施例1制备的小麦胚芽蛋白质粉，加入90ml蒸馏水溶解，加入20mg的胰蛋白酶，调PH值至8，加热至50℃，保温水解6h。水解结束后，加热沸腾15min，然后以10000r/min离心10min，取上清液。
随后，通过超滤(截留分子量为5000Da)，随后调至PH值3～4，加入一定比例的活性碳，搅拌，真空过滤，完成脱色。进一步通过D61大孔强酸性阳离子交换、SePH值adex G-15柱层析、RP-HPLC进行逐级纯化，得到ACE抑制活性高的两种单一组分，通过LC/MS进行结构鉴定。结果表明，该两种组分分别为三肽Ala-Met-Tyr和二肽Val-Trp，其IC50为0.059mg/mL和0.063mg/mL，IC50指对ACE活性抑制50％时所需要抑制剂的量。
实施例3
称取500g实施例1制备的小麦胚芽蛋白质粉，加入6000ml蒸馏水溶解，按1.5％的比例加入胰蛋白酶，调PH值至9，加热至50℃，保温水解5h，加热钝化酶；再按同样的比例加入碱性蛋白酶，调PH值至10，加热至45℃，保温水解6h，加热钝化酶。水解结束后，加热沸腾15min，然后以10000r/min离心10min，取上清液。对上清液超滤，取滤液，加入0.2％活性碳，于磁力搅拌器上搅拌10min，真空过滤，完成脱色。滤液以5000r/min离心10min除去沉淀，得到上清液，经冷冻干燥，配制成口服液、片剂、针剂、胶囊，进行动物实验。
实验用老鼠属自发性高血压雄性大鼠(SHR)，周龄为8周，通过口服和注射方式给药，每组老鼠3只，给药后测血压取平均值。口服的剂量、注射剂量和部分降压结果示于表2和表3。
                        表2 实施例3结果(口服给药)
制剂    血压(mmHg)
   0小时  2小时 6小时 12小时
  对照组(水)    190  188(-2) 196(+6) 187(-3)
本实施例的降压肽     低剂量(2.5g/kg)    194  178(-16) 160(-34) 190(-4)
    中剂量(5g/kg)    191  171(-20) 143(-48) 190(-1)
    高剂量(7.5g/kg)    190  127(-63) 148(-42) 188(-2)
  Catpopril(5mg/kg)    171  127(-44) 139(-32) 169(-2)
*括号中数值为血压升降数量
                 表3 实施例3结果(注射给药，剂量5mg/kg)
时间(小时)   0 1   2   4   8   12   14
血压(mmHg)   188 140   124   130   133   156   168
血压降低(mmHg)   - -48   -64   -58   -55   -32   -20
本发明的实施例证明，根据本发明提供的方法得到的小麦胚芽蛋白水解物有显著的降压效果，可用于制备高效安全的高血压患者降血压的保健食品或药物。

Claims (5)

1、一种小麦胚芽蛋白水解物，其特征在于为一种多肽类化合物的混合物。
2、根据权利要求1所述的一种小麦胚芽蛋白水解物，其特征在于包含三肽Ala-Met-Tyr和二肽Val-Trp等多种肽类化合物。
3、制备权利要求1所述的一种小麦胚芽蛋白水解物的方法，其特征在于先提取经过脱脂的小麦胚芽中的蛋白质，再利用酶法水解小麦胚芽蛋白质，获得含有活性多肽的蛋白水解物。
4、根据权利要求3所述的一种小麦胚芽蛋白水解物的制备方法，其特征在于酶法水解所使用的蛋白酶为来源于杆菌的内切蛋白酶。
5、权利要求1所述的一种小麦胚芽蛋白水解物的用途，其特征在于通过对血管紧张素I转化酶的抑制作用来降低高血压患者的血压，且同时具有提高免疫力和抗氧化作用。
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