CN102102117A - 适用降血压肽工程菌的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，涉及发酵工程领域。以重量计培养基组成如下：葡萄糖0%-1%，麦胚蛋白酶解物1%-2%，酵母粉0%-1%，氯化钠0.5%，其余为蒸馏水。本发明的培养基原料麦胚廉价易得，制备麦胚蛋白酶解物过程中极大保留和利用了麦胚的营养成分，工艺简单方便，用此培养基培养大肠杆菌BL21-MF3A3的表达重组蛋白产率高于常规培养基。

Description

适用降血压肽工程菌的培养基

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，更具体涉及到制备一种适用于降血压肽工程菌高效表达的麦胚培养基。

背景技术

    降血压肽 (antihypertensive peptide，AHP)是一类能够降低人体血压的活性生物多肽的总称。它是血管紧张素转化酶 (angiotensin-converting enzyme，ACE)的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的（参见：殷晓峰．等人，中国药理学通报，19:971-975(2003)。)。由于降血压肽具有低毒副作用、降血压效果明显、来源广泛等特点，已成为目前研究的热点。

现阶段研究者主要致力于研究从各种天然蛋白质中获取各种降血压肽，分析获得新结构的降血压肽。由于从天然蛋白中提取降血压肽步骤繁多，后期处理困难，而化学合成成本太高，这都限制了降血压肽的研究和开发。近年来基因工程技术的发展为降血压肽的开发利用带来了机遇，但是有关技术还鲜有报导。

在江苏大学食品与生物工程学院近几年的研究中，利用工程菌(大肠杆菌BL21-MF3A3)发酵生产降血压肽取得了成功，获得了高活性的降血压肽CEI-12和CEI-7混合肽。但是由于常规LB培养基（见表二）所用的进口牛肉膏蛋白胨成本太高，故为了扩大生产，降低成本，进行工业化生产，需要对发酵培养基的国产化进行研究。

降血压肽一般含有较多的疏水性氨基酸，大肠杆菌BL21-MF3A3所要表达的降血压肽CEI-12和CEI-7疏水性氨基酸含量也很高，其中苯丙氨酸占21%左右，因此培养基中各种氨基酸的组成对工程菌的表达有很大的影响。

小麦是我国主要粮食作物之一，年产量在1亿吨以上。麦胚是小麦加工的廉价的副产品，长期以来没有得到有效地开发和利用。麦胚含有丰富的大肠杆菌培养所需要的营养物质，其蛋白质含量达30%左右，并且麦胚蛋白质中含有较多疏水性氨基酸，其中苯丙氨酸等疏水性氨基酸的含量与牛肉相当( 参见：Grewe E．等人，CerealChemistry，20：423-434 (1943)。)。因此研究利用麦胚蛋白水解物代替利用牛肉膏蛋白胨作为工程菌培养基中的氮源，对降低降血压肽生产成本，提高降血压肽表达效率以及有效的利用麦胚资源都有着重要的意义。

发明内容

本发明提供一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，以重量计其组成如下：葡萄糖0%-1%，麦胚蛋白酶解物1%-2%，酵母粉0%-1%，氯化钠0.5%，其余为蒸馏水。

本发明中所述的麦胚蛋白酶解物按照下述方法制备得到：

1、脱脂麦胚加水，搅拌混匀，其中所述脱脂麦胚与水的质量体积比为18%-25%；

2、超声处理时间为15-30min，超声功率为400-800W/100mL，脉冲超声处理的工作与间歇时间分别为2s和2s；

3、加入中温淀粉酶，在40-50℃下酶解4-8h，其中所述中温淀粉酶占脱脂麦胚总质量的2%-6%；

4、调pH至8.0，加入胰蛋白酶，在50℃下酶解2-3h，调pH至9.0，其中所述胰蛋白酶与脱脂麦胚的体积质量比为2%-6%；

5、加入碱性蛋白酶，45-55℃下酶解1-6h，其中所述碱性蛋白酶占脱脂麦胚总质量的1%-3%；调pH至6.5-7.5，100 ℃灭酶10min，离心取上清液，喷雾干燥得麦胚蛋白酶解物。

本发明的优点

本培养原料麦胚廉价易得，制备麦胚蛋白酶解物过程中极大保留和利用了麦胚的营养成分，工艺简单方便，用此培养基培养大肠杆菌BL21-MF3A3的表达重组蛋白产率高于常规培养基。

具体实施方式

本发明使用的脱脂麦胚购自河南漫天雪面粉厂，中温淀粉酶（活力4000u/mg）购自Novo公司，胰蛋白酶（活力2500u/mg）购自国药集团，碱性蛋白酶为诺维信食品级碱性蛋白酶Alcalase2.4L购自诺维信公司，其他试剂为国药分析纯。

本发明所涉及的大肠杆菌BL21-MF3A3，已经另行申请专利，在“一种多活性肽的串联DNA构建、表达及其应用”专利中有详述，该菌种于2010年8月19日在中国武汉的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为Escherichai coli BL21-MF3A3 CCTCC NO: M 2010204。

本发明实施例所使用的麦胚蛋白酶解物由如下方法制备：取25g脱脂麦胚，加水100mL搅拌混匀，超声处理30min（600W，2s/2s），加入1g的中温淀粉酶，在50℃下水解6h，调pH至8.0，加入1g的胰蛋白酶，在50℃下酶解2h，调pH至9.0，加入碱性蛋白酶液0.5mL，在50℃下酶解2h，调pH至7.0，100℃灭酶，离心取上清，喷雾干燥得得麦胚蛋白酶解物。

实施例1

以重量计100mL培养基含有：葡萄糖0g，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉1g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

实施例2

   以重量计100mL培养基含有：葡萄糖0.5g，麦胚蛋白酶解物1g，酵母粉0.5g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

实施例3

以重量计100mL培养基含有：葡萄糖0.5g，麦胚蛋白酶解物1.5g，酵母粉1g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

实施例4

   以重量计100mL培养基含有：葡萄糖0.5g，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉0g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

实施例5

   以重量计100mL培养基含有：葡萄糖1g，麦胚蛋白酶解物1g，酵母粉1g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

实施例6

   以重量计100mL培养基含有：葡萄糖1g，麦胚蛋白酶解物2g，酵母粉0.5g，氯化钠0.5g，其余为蒸馏水。

大肠杆菌的培养和蛋白含量测定

将上述降血压肽工程菌即大肠杆菌BL21-MF3A3按体积比为1%接种量接种于50 mL含卡那霉素（50μg/L）的麦胚培养基（其中不同培养基的组成如表一所示）中，37℃，200 r·min^-1恒温摇床培养至 OD600为2.0时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度 1 mmol·L ^– 1，28℃诱导 12h，5000 r·min^-1离心收集菌体，将菌体反复冻溶3次，在PBS（pH7.0）缓冲溶液进行超声破碎（300W，2s/2s，2min），8000 r·min^-1离心取沉淀，将沉淀溶于进行8 mL上柱缓冲溶液，进行活化的Ni-柱(Novagen，美国)纯化His标记的重组蛋白，纯化步骤均按Ni-柱纯化说明。纯化的重组蛋白采用考马斯亮蓝法测定。利用麦胚培养基培养表达的重组蛋白量明显高于LB培养基的，见表一和表二。

表一 麦胚培养基的成分（100mL）与表达的重组蛋白量

培养基	葡萄糖，g	麦胚蛋白酶解物，g	酵母粉，g	氯化钠，g	重组蛋白量，g/L
						实施例1	0	2	1	0.5	0.377
实施例2	0.5	1	0.5	0.5	0.420
						实施例3	0.5	1.5	1	0.5	0.317
实施例4	0.5	2	0	0.5	0.337
						实施例5	1	1	1	0.5	0.310
实施例6	1	2	0.5	0.5	0.390

表二 LB培养基的成分（100mL）与表达的重组蛋白量

培养基	牛肉膏蛋白胨，g	酵母粉，g	氯化钠，g	重组蛋白量，g/L
					LB培养基	1	0.5	0.5	0.245

综上所述，虽然用有关优选的实施方案具体说明和描述了本发明，但是对本领域普通技术人员来说，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做各种变化和修改，所附权利要求书视为概括了所实施的方案及其所有的等同方案，因此，本发明不限于这里的实施例，对于本发明做出的任何修改和变化都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，以重量计其组成如下：葡萄糖0%-1%，麦胚蛋白酶解物1%-2%，酵母粉0%-1%，氯化钠0.5%，其余为蒸馏水。

2.根据权利要求1所述的一种适用降血压肽工程菌的麦胚培养基，其特征在于其中所述的麦胚蛋白酶解物按照下述方法制备得到：

（1）脱脂麦胚加水，搅拌混匀，其中所述脱脂麦胚与水的质量体积比为18%-25%；

（2）超声处理时间为15-30min，超声功率为400-800W/100mL，脉冲超声处理的工作与间歇时间分别为2s和2s；

（3）加入中温淀粉酶，在40-50℃下酶解4-8h，其中所述中温淀粉酶占脱脂麦胚总质量的2%-6%；

（4）调pH至8.0，加入胰蛋白酶，在50℃下酶解2-3h，调pH至9.0，其中所述胰蛋白酶与脱脂麦胚的体积质量比为2%-6%；

（5）加入碱性蛋白酶，45-55℃下酶解1-6h，其中所述碱性蛋白酶占脱脂麦胚总质量的1%-3%；调pH至6.5-7.5，100 ℃灭酶10min，离心取上清液，喷雾干燥得麦胚蛋白酶解物。