CN102286602A - 微生物酶法拆分dl-精氨酸制备d-精氨酸盐酸盐和l-鸟氨酸盐酸盐的方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法。本发明利用高效表达L-精氨酸酶的重组大肠杆菌的发酵菌体或其喷雾干燥制剂作为酶源，以DL-精氨酸为底物，经酶促反应拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸和L-鸟氨酸。生成液通过加入盐酸使L-鸟氨酸变成L-鸟氨酸单盐酸盐，再加入一定体积的乙醇使其析出，收集沉淀得L-鸟氨酸盐酸盐；上清中D-精氨酸的纯化方法是：经离子交换树脂吸附洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐；本专利提供了一种新的D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的绿色生产工艺路线。

Description

微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过微生物酶法拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法。

背景技术

D-精氨酸(D-arginine，D-Arg)作为一种非蛋白质氨基酸，是一种重要手性试剂和医药中间体。研究表明D-精氨酸具有抗高血压的功效，作为多肽的组成氨基酸，D-精氨酸的重要生理功能还表现在可抑制癌症扩散，治疗生长激素过多释放造成的紊乱、抑制DNA合成和抑制前列腺癌细胞增殖等方面。

目前D-精氨酸的制备方法主要有：

(1)化学法化学法是将DL-精氨酸先与光学活性拆分剂反应生成具有旋光性的氨基酸衍生物，再水解，调节pH至氨基酸等电点，即可析出晶体。化学拆分法通常工艺路线复杂，都要先转化成氨基酸衍生物，因此步骤多、收率低，且存在拆分剂的选择、回收等问题；

(2)生物转化法。生物转化法是以微生物细胞或从微生物中提取的酶作为生物催化剂，利用酶的立体选择性拆分得D-精氨酸和另一副产物，反应条件温和，转化体系中杂质较少、提取工艺简单，不产生有毒物质。已有报道的李加友等利用粪球链菌菌体内精氨酸脱亚胺酶对L-精氨酸的转移脱亚胺作用，获得D-精氨酸，同时获得附加产物L-瓜氨酸；刘均忠等采利用固定化精氨酸脱亚胺酶细胞的方法拆分DL-精氨酸，提高了酶的稳定性和重复使用批次；Makryaleas等用动物来源的精氨酸酶催化DL-精氨酸转化制备D-精氨酸与L-鸟氨酸，但是由于他采用的精氨酸酶活力较低，且受来源限制，不能规模制备，因此不具有产业化价值。

L-鸟氨酸(L-Ornithine)是生物体内普遍存在的氨基酸之一，1877年杰弗在喂养安息香酸的鸟类的尿液水解产物中发现了鸟氨酸，因此得名。鸟氨酸在生物体代谢中起到重要的作用。它是尿素形成过程中出现的氨基酸，是精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，主要参与产尿毒的鸟氨酸循环，对体内聚集的氨具有解毒作用，因此鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业，L-鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常与精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。近几年研究发现，L-鸟氨酸还可刺激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢，在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉，起到减肥保健的作用。此外，L-鸟氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促进细胞增殖，具有提高免疫功能、抗癌功能的作用。因此，L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的关注。而以L-鸟氨酸为原料制备的依氟鸟氨酸，能抑制多胺合成，延缓肿瘤细胞增长，是一种很有前景的新型抗癌药物。

目前，制备L-鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中

(1)提取法是从细菌的膜成分及多肽类抗生素物质中提取，但是该法提取制备鸟氨酸的成本太高，且提取工艺繁琐。

(2)化学法分为有机合成法和精氨酸水解法，此法大量使用有机溶剂，且得到的DL型混合物，回收率低，分离提纯困难。

(3)微生物发酵法主要是利用L-鸟氨酸是L-精氨酸合成途径中的中间产物之一，通过筛选精氨酸或瓜氨酸的营养缺陷性突变株来积累L-鸟氨酸。可用于鸟氨酸发酵生产的菌株主要是谷氨酸生产菌，通过谷氨酸的积累可以使代谢途径向合成精氨酸方向进行，这样利于鸟氨酸的积累。用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但是产量不高，且发酵生产周期较长，同时由于发酵液中的成分复杂，后续分离较为困难，给实际推广应用带来了很大困难

(4)酶法生产鸟氨酸就是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸，生成鸟氨酸和尿素，反应式如下：

L-精氨酸酶(EC3.5.3.1)，广泛存在于动物的肝脏、植物、酵母和细菌中。精氨酸酶可被Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等二价金属离子激活，而Hg⁺、Ag⁺、柠檬酸和硼酸等可使之失活。另外可被赖氨酸、鸟氨酸所抑制。酶法生产L-鸟氨酸专一性强，反应条件温和，避免采用氰化氢等有毒化学物质，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离。张鹏等利用粪肠球菌体内的精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸，最高产量大112g/L，转化率高达99.5％。

不过，精氨酸酶的来源不易。传统的酶法采用的精氨酸酶一般提取自动物的肝脏，或者来自某些微生物菌株体内，直接以微生物细胞作为转化体系来生产鸟氨酸。这些菌株的生长周期一般不少于24h，且由于其自身表达酶活水平有限，在转化体系中添加一定量的酶源细胞后，势必转化后的分离提取工艺相对繁琐。

发明内容

本发明的目的就是解决现有D-精氨酸和L-鸟氨酸制备技术中存在的上述问题，提供一种微生物酶法拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的绿色转化方法。

本发明提供的微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸和L-鸟氨酸的方法包括：以表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞或喷雾干燥固体酶制剂为酶源，以DL-精氨酸为底物，在30至45℃下，pH7至11，经酶法转化反应4至24h，产生D-精氨酸和L-鸟氨酸。

其中，酶促反应液中，底物DL-精氨酸的加入量为20至200g/L，酶源的添加量为500至2000U/L。底物DL-精氨酸的用量优选为100g；酶源的添加量优选为1000U，优选转化温度为37℃，优选转化pH10，优选转化时间24h。

所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，表达载体为pET21a(+)-Arg重组表达载体。

本发明自行构建了高效表达L-精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌株BL21-pET21a(+)-Arg，即从大鼠肝脏中提取总RNA，构建含有大鼠精氨酸酶1基因的大肠杆菌基因工程菌，该菌体细胞的精氨酸酶活力可达1000U/g；而采用喷雾干燥方法将酶源细胞制成固体酶制剂，稳定性好，能够长期储存，该酶制剂的酶活力高达15000U/g。

所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌体细胞的喷雾干燥固体酶制剂的制备工艺中，本发明采用正交设计法对喷雾工艺进行优化，考察进口温度、雾化速度、进料菌浓、保护剂含量对酶活力收率的影响。确定了喷雾条件：保护剂为脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶，进口温度为140-180℃，进料菌浓为100-200g/L，雾化速度0.2-0.6L/h。其中最佳条件为：保护剂为100g/L的脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶，进口温度160℃，进料菌浓为100g/L，雾化速度0.4L/h，在最佳条件下可得到收率最高为89.92％的酶粉。制得的喷干粉酶活达15000U/g。

本发明中L-鸟氨酸盐酸盐的纯化方法是，将酶促生成液经减压浓缩后，加入与浓缩液中L-鸟氨酸等物质的量的浓盐酸，使产生的L-鸟氨酸转变成L-鸟氨酸单盐酸盐，然后加入3-5倍体积无水乙醇，使L-鸟氨酸单盐酸盐结晶析出，收集沉淀，得L-鸟氨酸盐酸盐。

本发明在L-鸟氨酸盐酸盐的纯化过程中，对乙醇析出结晶后的上清液，采用201×4树脂去除其中残留的尿素，经0.1N盐酸洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐。

在本发明实施例中，采用高效液相色谱法来测定L-鸟氨酸的含量，具体方法如下：高效液相色谱采用Luna 5μSCX柱(250×4.6mm)对L-鸟氨酸含量进行测定，该液相条件为：示差折光检测器；以乙腈-水-冰醋酸-三乙胺(1∶3∶0.8％∶0.6％)为流动相；进样量10μL。

本发明的优点和有益效果：

本发明从底物DL-精氨酸出发，利用高效表达L-精氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌BL21-pET21a(+)-Arg的发酵菌体或喷雾干燥固体酶制剂为酶源，酶法拆分DL-精氨酸生产D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐，具有生产成本低、条件温和、周期短、酶量投入少、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、工艺步骤简单、操作安全等优点，有很好的产业化应用前景。

附图说明

图1是茚三酮显色法绘制的L-鸟氨酸标准曲线。

图2是D-精氨酸定量分析标准曲线。

图3是L-鸟氨酸定量分析标准曲线。

图4是L-精氨酸酶专一性分析；

a：以L-精氨酸作为底物的催化反应；

b：以D-精氨酸作为底物的催化反应；

c：以DL-精氨酸作为底物的催化反应。

图5是以发酵菌体或固体酶制剂为酶源考察L-精氨酸的转化率；

A：反应温度与L-精氨酸转化率的关系；B：pH与L-精氨酸转化率的关系；C：反应时间与L-精氨酸转化率的关系；D：底物DL-精氨酸与L-精氨酸转化率的关系；E：酶量与L-精氨酸转化率的关系。

图6是L-鸟氨酸单盐酸盐纯度分析。

图7是D-精氨酸盐酸盐的纯度分析。

具体实施方式

实施例1、基因工程菌大肠杆菌的构建及重组L-精氨酸酶的表达

根据NCBI数据库收录的大鼠的精氨酸酶基因序列，设计上游引物arg1：5’-GCGGGATCC ATG AGC TCC AAG CCA AAG CC-3’和下游引物arg2：5’-GCC GTCGAC TTATTT CGG TGG TTT A-3’。提取大鼠肝脏总RNA，反转录制备cDNA。以大鼠肝脏cDNA为模板，PCR扩增得到精氨酸酶基因。采用基因工程方法，构建重组表达质粒pET-21a(+)-Arg。将重组表达载体pET-21a(+)-Arg转化至E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌株Arg5。

将阳性重组菌株接种于4ml含有氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基中过夜培养，随后以1％转接量接入100mL含有氨苄青霉素100μg/mL的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养3h，然后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导液，特异性诱导精氨酸酶的表达。

所得培养液于4℃下6,000rpm离心10min，收集菌体，获得表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌，用50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 8.0)悬浮洗涤后再离心，收集菌体作为酶源细胞。

实施例2、重组L-精氨酸酶基因工程重组菌的发酵

将实施例1中的重组大肠杆菌接种于4mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养作为一级种子液；随后以1％转接量接入100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃，200rpm培养8h-12h作为二级种子液；二级种子液以1％接种量转接于100L发酵罐中，发酵培养基为新鲜的LB培养基，培养温度37℃，初始转速300rpm，初始pH7.2。定时取样，菌液OD600nm达到1.0-1.2时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导液诱导。下罐发酵液4℃下3,000rpm离心15min收集菌体细胞，得到表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞。

实施例3、喷雾干燥条件的考察及固体酶制剂的制备

将实施例2获得的菌悬液中，分别加入20g/L的糖类、多聚物、多元醇、蛋白质、表面活性剂、盐等作为考察对象，充分溶解后，在50℃水浴中预热30min，以空白样剩余酶活力为100％，比较相对剩余酶活。结果如表1所示，脱脂奶粉、谷氨酸钠和阿拉伯胶均具有良好的保护作用，其中，脱脂奶粉的保护效果最好，若考虑成本可优先选择谷氨酸钠或阿拉伯胶。

表1保护剂对温度稳定性的影响

将100-200g/L浓度的菌悬液加入一定量的脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶作为保护剂，按照四因素三水平正交设计实验，在不同的进口温度、雾化速度下进行喷雾，计算酶活力回收率，从而确定喷雾干燥处理条件，结果分别见表2、表3和表4。

表2脱脂奶粉作保护剂的正交设计实验

表3谷氨酸钠作保护剂的正交设计实验

表4阿拉伯胶作保护剂的正交设计实验

从结果可见，以脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶作保护剂，在进口温度为140-180℃，进料菌浓为100-200g/L，雾化速度0.2-0.6L/h的条件下对菌悬液进行喷雾干燥，酶活力回收率均能达到65％以上。同时通过正交设计实验结果分析，结合考虑实际操作的便捷和仪器的条件，优选的喷雾干燥条件为：保护剂为100g/L的脱脂奶粉、阿拉伯胶或牛肉浸膏，进口温度为160℃，雾化速度为0.4L/h，进料菌浓为100g/L。在该优选条件下进行验证实验，得到实际酶活力回收率最高达到89.92％。

实施例4、L-精氨酸酶活力的测定

(1)标准曲线的建立

用50mL混酸溶液(6M磷酸∶醋酸＝1∶3)溶解1.25g茚三酮配制0.25g/L的显色溶液，分别配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mM的L-鸟氨酸500μL，加入2mL茚三酮显色溶液，沸水浴1h后510nm测定吸光度，以L-鸟氨酸浓度为横坐标，510nm吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，结果如附图1。

(2)精氨酸酶活力的测定

催化体系：25mM Glycine-NaOH pH 9.5，1mM MnCl2，0-20mM的L-精氨酸，一系列梯度浓度的实施例2得到的湿菌体，37℃催化反应1h。

酶活力定义：在上述反应条件下，于37℃，1min催化形成1μmolL-鸟氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。

按实施例2制备的酶源细胞和实施例3制备的固体酶制剂，经测定，酶活分别可达1000U/g和15000U/g以上。

实施例5、HPLC法测定D/L-精氨酸、L-鸟氨酸的含量

高效液相色谱采用Luna 5μSCX柱(250×4.6mm)对D/L-精氨酸及L-鸟氨酸含量进行测定，该液相条件为：示差折光检测器；流动相为乙腈-水(1∶3)，含0.8％的冰醋酸和0.6％的三乙胺；流速为1.0mL/min；室温条件下分析；进样量为10μL。

精确配制系列浓度的D-精氨酸标准液，连续进样5次，计算峰面积并取平均值，以D-精氨酸浓度(X，mmol/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的D-精氨酸经适当稀释后以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量。如图2。

精确配置系列浓度的L-鸟氨酸标准液，分别取10μL进样，HPLC条件同上，连续进样5次，计算峰面积并取平均值，以L-鸟氨酸浓度(X，mg/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。

酶促反应所产生的L-鸟氨酸和精制后的L-鸟氨酸盐酸盐，经高效液相色谱检测后与标准曲线相比较即可进行精确定量。如图3。

实施例6、L-精氨酸酶专一性分析

分别配制浓度为100g/L的DL-精氨酸，L-精氨酸，D-精氨酸溶液，取15mL离心管，分别加入上述溶液5mL，再分别加入20U/mL的酶源1mL，加水4mL补足到总体积为10mL，涡旋混匀后于37℃水解24h，反应液用水适当稀释，混匀，离心后取上清液，采用上述的HPLC方法检测D-精氨酸和L-鸟氨酸的含量，以确定L-精氨酸酶的底物专一性。

结果如图4所示，a组中以L-精氨酸作为底物，催化反应后的反应液中几乎没有L-精氨酸，取而代之的是相对应的L-鸟氨酸峰，说在此条件下，L-精氨酸基本全部转化为L-鸟氨酸；b组中以D-精氨酸作为底物，催化反应后的反应液中D-精氨酸几乎没有损失，也没有L-鸟氨酸峰出现；c组中，以DL-精氨酸作为底物，催化反应后的反应液中几乎没有L-精氨酸色谱峰，取而代之的是L-鸟氨酸峰，同时D-精氨酸几乎没有损失。综上，证明该L-精氨酸酶具有很好的底物专一性，能有效地拆分DL-精氨酸。

实施例7、以发酵菌体或固体酶制剂为酶源，考察L-精氨酸的转化率

以上述实施例2中重组大肠杆菌的发酵菌体或实施例3中制备的喷雾干燥固体制剂作为酶源，分别在每升的转化体系中，加入酶量500-2000U；底物DL-精氨酸20-200g；转化温度30-45℃；转化p H值7-11；转化时间4-24h(以上各参数具体取值如图5中各点所示，此处略)。考察不同的转化条件对L-精氨酸转化率的影响，采用实施例5中的方法检测L-鸟氨酸的含量。

图5A：考察反应温度与L-精氨酸转化率的关系；底物DL-精氨酸用量为100g/L；转化pH值为10；转化时间12h；酶量1000U/L；

图5B：考察pH值与L-精氨酸转化率的关系；底物DL-精氨酸用量为100g/L；转化温度为37℃；转化时间12h；酶量1000U/L；

图5C：考察反应时间与L-精氨酸转化率的关系；底物DL-精氨酸用量为100g/L；转化温度为37℃；转化pH值为10；酶量1000U/L；

图5D：考察底物DL-精氨酸与L-精氨酸转化率的关系；转化温度为37℃；转化pH值为10；转化时间为24h；酶量1000U/L；

图5E：考察酶量与L-精氨酸转化率的关系；底物DL-精氨酸用量为100g/L；转化温度为37℃；转化pH值为10；转化时间为24h。

实施例8、以发酵菌体为酶源拆分DL-精氨酸生产L-鸟氨酸盐酸盐和D-精氨酸盐酸盐

根据实施例7确定的拆分条件，以上述实施例2中重组大肠杆菌的发酵菌体作为酶源，在1升转化体系中加入底物DL-精氨酸100g，酶1000U，反应温度37℃，pH10，转化时间24h，进行DL-精氨酸的拆分。最后酶促反应后的转化液中D-精氨酸含量为50g；产生的L-鸟氨酸产量为37.2g，底物DL-精氨酸中的L-精氨酸的摩尔转化率为98.1％。

转化液收集后，在75℃下旋转蒸发，浓缩至原来体积的1/5；根据浓缩液中L-鸟氨酸的含量，加入等物质的量的浓盐酸，搅拌；再加入3-5倍体积的无水乙醇，搅拌1h；采用真空泵抽滤样品，将析出物真空干燥，得到L-鸟氨酸盐酸盐；最后，称重，采用高效液相色谱法测定，其纯度可达95％以上(见图6)。

上述乙醇析出后的上清液，采用201×4离子交换树脂去除其中残留的尿素；经0.1N盐酸洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐；最后，称重，采用高效液相色谱法测定，其纯度可达98％以上(见图7)

实施例9、以固体酶制剂为酶源拆分DL-精氨酸生产L-鸟氨酸和D-精氨酸

根据实施例7确定的拆分条件，以上述实施例3中重组大肠杆菌的发酵菌体喷雾干燥固体酶制剂为酶源，在1L转化体系中加入底物DL-精氨酸100g，酶1000U，反应温度37℃，pH10，转化时间24h，进行DL-精氨酸的拆分。最后酶促反应后的转化液中D-精氨酸含量为50g；产生的L-鸟氨酸产量为37.4g，底物DL-精氨酸中的L-精氨酸的摩尔转化率为98.6％。

转化液收集后，在75℃下旋转蒸发，浓缩至原来体积的1/5；根据浓缩液中L-鸟氨酸的含量，加入等物质的量的浓盐酸，搅拌；再加入3-5倍体积的无水乙醇，搅拌1hr；采用真空泵抽滤样品，将析出物真空干燥，得到L-鸟氨酸盐酸盐；最后，称重，采用高效液相色谱法测定，其纯度可达96％以上。

上述乙醇析出后的上清液，采用201×4离子交换树脂去除其中残留的尿素；经0.1N盐酸洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐；最后，称重，采用高效液相色谱法测定，其纯度可达98％以上。

Claims (6)

1.一种微生物酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸盐酸盐和L-鸟氨酸盐酸盐的方法，其特征在于该方法包括：以表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的发酵菌体细胞或喷雾干燥固体酶制剂为酶源，以DL-精氨酸为底物，在30至45 ℃下，pH7至11，经酶法转化反应4至24 h，产生D-精氨酸和L-鸟氨酸；将酶促生成液经减压浓缩后，加入与浓缩液中L-鸟氨酸等物质的量的浓盐酸，使产生的L-鸟氨酸转变成L-鸟氨酸单盐酸盐，然后加入3-5倍体积无水乙醇，使L-鸟氨酸单盐酸盐结晶析出，收集沉淀，得L-鸟氨酸盐酸盐；对乙醇析出结晶后的上清液，采用201×4树脂去除其中残留的尿素，经0.1 N盐酸洗脱、减压浓缩干燥，获得D-精氨酸盐酸盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶促反应液中，底物DL-精氨酸的加入量为20至200 g/L，酶源的添加量为500至2000 U/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：酶促反应液中，底物DL-精氨酸的用量优选为100 g；酶源的添加量优选为1000 U，优选转化温度为37 ℃，优选转化pH10，优选转化时间24 h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，表达载体为pET21a(+)-Arg重组表达载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的表达L-精氨酸酶的基因工程重组菌体细胞的喷雾干燥固体酶制剂的制备条件为：保护剂为脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶，浓度范围为100-200 g/L，进口温度为140-180 ℃，雾化速度范围为0.2-0.6 L/h，进料菌浓范围为100-200 g/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：最佳喷雾干燥条件为100 g/L的脱脂奶粉、谷氨酸钠或阿拉伯胶作为保护剂，进口温度为160 ℃，雾化速度为0.4 L/h，进料菌浓为100 g/L。

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