CN101955901B - 一种谷氨酸棒杆菌及利用该菌制备l-鸟氨酸及其盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵工程领域，公开了一种谷氨酸棒杆菌及利用该菌制备L-鸟氨酸及其盐的方法。该菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006，保藏号：CGMCCNo.3663。将该菌在含有碳源、氮源、无机盐的培养基上28～30℃下培养，生成L-鸟氨酸发酵液，发酵液经1万-15万道尔顿陶瓷膜除去菌体后，经阳离子交换树脂分离得到L-鸟氨酸溶液，经脱色后盐酸乙醇法结晶得到L-鸟氨酸盐酸盐。本发明菌体培养简单，有利于工业化的大规模生产。利用该菌生产L-鸟氨酸可使得L-鸟氨酸的累积达到35-45g/L。

Description

一种谷氨酸棒杆菌及利用该菌制备L-鸟氨酸及其盐的方法

技术领域

本发明属于发酵工程领域，涉及一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌及利用该菌制备L-鸟氨酸及其盐的方法。

背景技术

L-鸟氨酸是生物体内普遍存在的氨基酸之一，它是杰费于1877年在喂养安息香酸的鸟尿的水解液中发现的。L-鸟氨酸是活细胞中重要的代谢化合物，是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，它主要参与生物体内的尿素循环，用于生物体内瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，对于体内氨态氮的排出有重要作用。近年来，国内外对L-鸟氨酸产品的开发逐渐升温，市场前景日益广阔。

L-鸟氨酸盐酸盐是活细胞中重要的代谢化合物，对于生物体内氨态氮的排出有重要调节作用，鸟氨酸和精氨酸一起亦可增加合成代谢的荷尔蒙。此外，L-鸟氨酸与α-酮戊二酸结合构成营养补剂复合鸟氨酸胶囊(OKG)，可修复肌肉损伤；L-鸟氨酸和L-门冬氨酸的复方制剂可用于治疗因急慢性肝病所致的高血氨症。以L-鸟氨酸为原料制备的依氟鸟氨酸，能抑制多胺合成，延缓肿瘤细胞生长，是颇具前景的新型抗癌药物。L-鸟氨酸除在医药上作为试剂与注射液外，通常还用于配制保肝、强身、解毒的营养剂以及生产消除疲劳的发泡饮料。

目前，L-鸟氨酸的制备方法主要有化学合成法、水解精氨酸法、微生物发酵法等。

George等用丙烯醛、氰化氢、氨气、二氧化碳为原料，经过多步化合和分解反应得到L-鸟氨酸。该方法以简单的有机物质为起始原料，经过多步化学反应合成产品。此法的不足之处在于：原料氰化氢是剧毒致癌物质，会给生产带来很大的安全隐患；反应步骤多，每步反应不彻底，收率不高；反应会得到D-鸟氨酸和L-鸟氨酸共存的外消旋化合物，产物的手性拆分给分离纯化工艺增加了难度和成本。

精氨酸广泛存在于蛋白质中，可以从天然蛋白的水解液中获得精氨酸，另外发酵法生产精氨酸工艺已比较成熟。因此以精氨酸为初始原料生产L-鸟氨酸在国内外都有广泛的研究。如近几年发表的专利KR95-09319是固定化酶，由L-精氨酸转化为理论值的97％，温度25-40℃，pH7-8，酶活可保持6天。又如美国专利US5405761是1995年M.Kyriukos等用从牛肝中提取的酶制备多种L-鸟氨酸盐。但是，水解精氨酸法制备L-鸟氨酸的弱点在于其经济效益要受制于精氨酸和鸟氨酸之间的市场差价，并且L-精氨酸转化率为理论值的90％-97％，提取率85％，据此计算生产1吨L-鸟氨酸盐酸盐至少需要1.6-1.7吨的L-精氨酸，因此，此法难以大规模生产，也限制了L-鸟氨酸的应用。

采用微生物发酵法制备L-鸟氨酸为近年来主要采用的制备工艺之一，该法拓宽了L-鸟氨酸的来源，推动了L-鸟氨酸的研究和应用。微生物发酵法生产L-鸟氨酸不仅可以降低L-鸟氨酸生产成本，而且L-鸟氨酸质量提高，性质稳定。目前，用于生产L-鸟氨酸的微生物有很多，如：①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的瓜氨酸缺陷(Cit^-)或精氨酸缺陷(Arg^-)突变株；②乳酸发酵短杆菌、川崎短杆菌(Brevibacteriumkawasaki)、柠檬酸节杆菌(Arthrobacter citreus)等的Arg^-突变株^[21]；③大肠杆菌、枯草杆菌、产气气杆菌、帕特介里变形杆菌(Proteus retigeri)的Arg^-突变株；④解烃棒杆菌(C.hydrocarbodastue)和一种石蜡节杆菌(A.pataffineus)的Arg^-突变株；⑤洁白链霉菌(Steptomyces virginiae)的Lys^-和硫胺素^-双重缺陷突变株。

发明内容

本发明目的在于提供一种高产L-鸟氨酸的谷氨酸棒杆菌。

本发明另一个目的是提供利用该菌制备L-鸟氨酸及其盐的方法。

本发明目的可以通过以下技术方案实现：

本发明中的选育并保臧的微生物菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)1006，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.3663，以此菌作为生产菌株。

本发明中谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006(保藏号：CGMCCNo.3663)的理化性质、培养特点、分类鉴定依据及遗传稳定性：

L-鸟氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌1006(Corynebacterium glutamicum 1006)为L-Arg^-和D-Arg^r缺陷型菌株，该菌无运动能力，不形成芽孢，革兰氏染色呈阳性。在显微镜下观察，该菌呈短棒状，两端稍钝圆，微弯，细胞呈单个、成对、八字形排列或栅状排列。在完全培养基平板上形成圆形菌落，淡黄色，直径1-2mm，菌落中央隆起，表面光滑、湿润，边缘整齐，不产生水溶性色素，易被牙签挑起，在基本培养基上无法生长。其最适生长温度为30-32℃，pH6.5-7.5时生长良好。

生理生化性质见表1：

表1菌株1006的生理生化性能

遗传标记：

采用生长谱法：(1)取新鲜活化斜面菌种一满环于5mL无菌离心管中，制成菌悬液。(2)将菌悬液3500r/min离心10min，弃去上清液，打匀管底菌团，用无菌生理盐水洗涤菌体3次，最后加5mL生理盐水制备菌悬液。(3)取0.1mL菌悬液于固体基本培养基平板上，涂布均匀。将平板划为两个区域，每个区平板表面分别贴上浸有L-精氨酸的滤纸片，倒置于恒温培养箱30℃培养24小时，若菌体只能在精氨酸滤纸片区域生长，则证明该菌株具有精氨酸缺限标记。

菌株培养：

本发明使用的培养基含有碳源、氮源、无机盐等营养因子。碳源以葡萄糖较为合适；氮源包括有机氮源如：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米浆、酵母水解液等，无机氮源包括如：(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、NH₄Cl等，以上氮源可以混合使用；无机盐指MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，K₂HPO₄·3H₂O，NaH₂PO₄·2H₂O，CaCO₃，FeSO₄·7H₂O，MnSO₄·H₂O，ZnSO₄·7H₂O。

利用谷氨酸棒杆菌CGMCC No.3663制备L-鸟氨酸及其盐的方法，该方法是将所述谷氨酸棒杆菌在含有碳源、氮源、无机盐的培养基上28～30℃下培养，生成L-鸟氨酸发酵液，发酵液经1万-15万道尔顿陶瓷膜除去菌体后，经阳离子交换树脂分离得到L-鸟氨酸溶液，经脱色后盐酸乙醇法结晶得到L-鸟氨酸盐酸盐。(由于L-鸟氨酸在水中的溶解度非常大，一般情况很难提取出来，通过成盐的方式，降低其溶解度，才能形成结晶，进行分离。)

本发明采用的L-鸟氨酸及其盐分离纯化是采用离子交换法。发酵液经陶瓷膜除去菌体后，清液进行离子交换树脂处理(离子交换树脂优选为JK006阳离子交换树脂)，对收集液进行减压浓缩、活性炭脱色，接下来使用浓盐酸调节pH值，用低级醇类如无水乙醇进行沉淀，得到L-鸟氨酸盐酸盐。

本发明的优点：

本发明中谷氨酸棒杆菌1006是L-Arg^-和D-Arg^r缺陷型突变菌株，利用微生物发酵法生产L-鸟氨酸，可使得L-鸟氨酸的累积达到35-45g/L。同时，本发明L-鸟氨酸盐酸盐的制备方法，发酵过程简单，操作方便，培养条件十分粗放，产品符合标准规定，完全可以替代化学合成及精氨酸水解所得的产品，并且生产成本低。

附图说明

图1是本发明菌株1006精氨酸缺陷标记的验证。

图2是实施例1的发酵液稀释100倍后的高效液相图谱。

图3是实施例2的发酵液稀释100倍后的高效液相图谱。

根据峰面积大小，代入回归方程Y＝8163927.714*X-284939.2，Y为峰面积，X为鸟氨酸的浓度(mg/mL)。

菌株保藏信息：

本发明采用的菌株命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号：CGMCC No.3663。保藏日期为2010年3月12日。

具体实施方式

以下实施例将进一步对本发明进行说明。

鸟氨酸的含量测定采用高效液相色谱结合蒸发光散射系统(HPLC-ELSD)测定。

色谱条件为Prevail C₁₈柱，0.06％HFBA溶液一乙腈(88∶12)为流动相，柱温30℃，流速为0.8mL/min，ELSD漂移管温度110℃，气体流量2.8L/min。L-鸟氨酸在0.1-0.6mg/mL范围内，线性回归比非常显著(R²＝0.9998)，平均回收率达到98.94％。该法简便、快速、准确性高、重复性好，适合于L-鸟氨酸的定量分析。

实施例1

斜面培养基：葡萄糖1g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂20g，加水至1000ml，pH 7.0-7.2，121℃0.1Mpa灭菌20min。

摇瓶培养基：葡萄糖25g，酵母膏10g，(NH₄)₂SO₄15g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5g，CaCO₃10g，加水至1000ml，pH7.6-7.8，121℃0.1Mpa灭菌10min。

发酵培养基：葡萄糖60g，酵母膏30g，(NH₄)₂SO₄50g，MgSO₄·7H₂O 2.50g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.50g，CaCO₃10g，FeSO₄·7H₂O 36.6mg/L，MnSO₄·H₂O 22.38mg，ZnSO₄·7H₂O 17.8mg，Biotin(生物素)0.05mg，V_B10.05mg，加水至1000ml，pH7.6-7.8，121℃0.1Mpa灭菌10min。

将保藏号为CGMCC No.3663的谷氨酸棒杆菌1006在斜面培养基上30℃静置培养18-20h，然后接一环生长良好的活化菌种至装有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，30℃培养11h，摇瓶转速200r/min，得到660nm的菌体OD值约为0.7-0.8，然后取1mL接种到含有发酵培养基30mL的500mL三角瓶中，28℃，200r/min振荡培养72h，最后测定发酵液中含L-鸟氨酸38.5g/L。

实施例2

将葡萄糖180g，酵母膏90g，(NH₄)₂SO₄150g，MgSO₄·7H₂O 7.5g，KH₂PO₄3g，K₂HPO₄·3H₂O 1.5g，Na₂HPO₄·2H₂O 1.5g，CaCO₃30g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄·H₂O0.067g，ZnSO₄·7H₂O 0.053g，Biotin 0.15mg，V_B1 0.15mg，调节pH为7.6-7.8，用水定容至3L，装入5L自动玻璃搅拌发酵罐，121℃蒸汽灭菌10min。

将活化后的保藏号为CGMCC No.3663的谷氨酸棒杆菌1006用种子培养基30℃培养11h得到种子液，将120mL的种子液，接入冷却后的5L发酵罐，28℃培养，(通风比1∶0.7vvm，搅拌转速为220r/min)，随着培养时间的增加，L-鸟氨酸不断增加，到72h，发酵液中含L-鸟氨酸为45g/L。

实施例3

同实施例2，过程控制pH值(陶瓷膜操作pH)在6.8±0.05，终了发酵液采用截留分子量为5万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜，操作压力差0.22MPa，温度58℃，通量为192L·m^-2·h^-1，有效的除去菌体；清液经JK006阳离子交换树脂吸附，0.5mol/L的氨水洗脱，纯水洗杂，收集液浓缩除氨，活性炭脱色；脱色液用浓盐酸调节pH为4.8，温度20℃，搅拌转速200r/min，用乙醇溶液结晶，结晶时间为6h，制得L-鸟氨酸盐酸盐结晶，收率为88.1％，纯度为98.7％。(收率的计算：提取分离前后，分别使用HPLC-ELSD检测含量，得到数据。纯度的测定：称取一定量的产品，溶解后，HPLC-ELSD测定含量，获得纯度数据。)

离子交换树脂选择依据：

选用5种不同型式的阳离子交换树脂(JK006，LH-8，FPC，DK110，WA-2)进行静态吸附实验。分别称取等量的树脂于各三角瓶中，加入25g/L的L-鸟氨酸发酵液各50mL，置于转速为100rpm、温度为20℃的摇床中吸附6小时，取样分析溶液中L-鸟氨酸的浓度，比较各种树脂对L-鸟氨酸吸附量的影响。

各种离子交换树脂对L-鸟氨酸的静态吸附量见表2。

表2各种树脂对L-鸟氨酸吸附量的比较(其他同实施例3)

本发明制备的L-鸟氨酸盐酸盐的理化性质如下表1，完全符合《中国药典》(2005版)要求。

表1：L-鸟氨酸盐酸盐成品检验结果

Claims (6)

1.一种谷氨酸棒杆菌，命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)1006，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.3663。

2.利用权利要求1所述谷氨酸棒杆菌制备L-鸟氨酸及其盐的方法，其特征在于将所述谷氨酸棒杆菌在含有碳源、氮源、无机盐的培养基上28～30℃下培养，生成L-鸟氨酸发酵液，发酵液经1万-15万道尔顿陶瓷膜除去菌体后，经阳离子交换树脂分离得到L-鸟氨酸溶液，经脱色后盐酸乙醇法结晶得到L-鸟氨酸盐酸盐。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养基的碳源为葡萄糖。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养基的氮源包括有机氮源和无机氮源，其中有机氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、玉米浆、酵母水解液，无机氮源包括(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、NH₄Cl，以上氮源可以混合使用。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养基的无机盐为MgSO₄·7H₂O，KH₂PO₄，K₂HPO₄·3H₂O，NaH₂PO₄·2H₂O，CaCO₃，FeSO₄·7H₂O，MnSO₄·H₂O，ZnSO₄·7H₂O中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用的离子交换树脂为JK006型阳离子交换树脂。

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