KR0136719B1

KR0136719B1 - 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효법

Info

Publication number: KR0136719B1
Application number: KR1019970038177A
Authority: KR
Inventors: 히데오 구로누마; 하루후미 미와; 시게루 나카모리; 도시마사 이시이; 야스히코 요시하라
Original assignee: 도바 다다스; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1990-02-15
Filing date: 1997-08-11
Publication date: 1998-04-25
Also published as: KR0130196B1; PH31571A; FR2658205B1; ITMI910389A0; FR2658205A1; IT1244747B; ITMI910389A1; KR910015702A

Abstract

본 발명은 염기성 L-아미노산 생산박테리아와 산성 L-아미노산 생산박테리아를 혼합 배양하여 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 동시 발효시키는 방법에 관한 것이다.

Description

염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효법

본 발명은, 산성 L-아미노산을 생산하기 위한 조건하에서 염기성 L-아미노산 생산박테리아를 배양하거나, 염기성 L-아미노산 생산박테리아와 산성 L-아미노산 생산박테리아를 혼합배양함을 포함하는, 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산의 동시 발효법에 관한 것이다.

발효법을 이용한 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산의 동시 생산에 대해서는 본 발명 이전까지 공지된 바 없었다. 단지 본 발명 이전까지는 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산중의 어느 하나가 배지중에 함유된다고 알려져 왔다. 이런 경우, 배지중에서 2종 이상의 아미노산이 탐지되며, 목적하는 아미노산 이외의 것은 부산물로서 소량(수십 ㎎/㎗)이 존재한다.

다시 말해서, 발효에 의해 상업적으로 만족할만한 함유랑의 염기성 L-아미노산 및 산성 L-아미노산을 동시에 생산하는 방법은, 비록 이런 방법이 유리하다고 추측되긴 했어도, 본 발명 이전까지 공지된 바 없었다.

본 발명의 목적은, 발효에 의해 상업적으로 만족할만한 함유양으로 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 동시 발효시키는 방법을 제공하는데 있다.

발효에 의해 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 동시 생산하면, 배양중에 존재하는 이온성 물질의양을 가능한한 감축시켜 배양중의 삼투압의 증가를 방지함으로써 발효 생산성을 개선(아미노산 생성 속도를 개선)시키고, 배지 성분을 절감 및 절약시키며, 발효 브로쓰의 처리를 단순화시키고(아미노산 분리를 위한 조작), 발효 브로쓰로부터 아미노산을 분리 및 수득한 후 폐액에 대한 환경 보존 부담을 감소시키는 등의 잇점이 있다. 특히, 폐액의 환경 보존 부담 감소가 장점인데, 이것은 현재 환경보존에 대해 예리한 관심이 가해지고 있는 관점에서 묵과될 수 없는 것이다. 결과적으로, 본 발명에 따르면, 아미노산 생산비를 현저히 낮출수 있어 아미노산이 저렴한 방법으로 공급될 수 있다.

본 발명자는 상기한 목적을 위해 다양한 연구를 진행하여 산성 아미노산과 염기성 아미노산의 동시 발효법을 확립함으로써 본 발명을 성취하였다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 산성 L-아미노산 생산 조건하에서 염기성 L-아미노산 생산박테리아를 배양하거나 염기성 L-아미노산 생산박테리아와 산성 L-아미노산 생산박테리아를 혼합배양함을 포함하여, 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효시키는 방법에 관한 것이다.

이후에 본 발명이 상세히 기술된다.

본 발명에서 언급된 염기성 L-아미노산은 L-라이신(Lys), L-아르기닌(Arg), L-히스티딘(His) 및 L-오르니틴(Orn)을 포함하고, 산성 L-아미노산은 L-글루탐산(Glu) 및 L-아스파트산(Asp)을 나타낸다. 먼저, 산성 L-아미노산 생산을 위한 조건하에서 염기성 L-아미노산 생산박테리아를 배양하여 발효에 의해 염기성 L-아미노산과 산성 아미노산을 동시에 생산하는 본 발명의 첫 번째 측면이 다음에 기술된다. 발효 배지로서, 탄소원, 질소원, 무기염, 성장 인자 등을 함유하는 영양 배지 또는 합성 배지가 사용된다. 탄소원으로서, 탄수화물(예:글루코스, 프럭토즈, 슈크로즈, 당밀, 전분, 전분 가수분해물, 과즙 등), 알콜(예:에탄올, 메탄올, 프로판올 등) 및 유기산(아세트산 등)이 사용된다. 질소원으로서, 황산 암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 암모니아, 아민, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 여러 가지 발효 세포 및 이의 분해 산물이 사용될 수 있다. 영양 요구성을 나타내는 돌연변이가 사용될 때, 요구되는 물질은 이를 함유하는 정격 물질 또는 천연물질로 보충한다.

발효는 일반적으로 통기성 교반, 진탕 배양등과 같은 호기성 조건하에서 수행한다. 배양 시간은 2 내지 7일이다. 배양 브로쓰의 pH 값은 5 내지 9의 범위로 유지시킨다. pH를 조절하기 위해, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 가스, 암모니아수등이 사용된다.

발효 배지 및 발효 조건은 통상적으로 공지되어 있는 아미노산 발효에 맞춘다. 본 발명의 방법에서, 발효에 의한 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 생산에 필요한 조건은 추가로 조절해야만 한다. 이런 조건은 다음에 상세히 기술된다. 통상적으로 공지된 염기성 L-아미노산 생산박테리아는, 코리네 타입 박테리아, 예를 들어 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 박테리아와 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 박테리아를 다양한 돌연변이 처리하여 수득할 수 있다. 예를 들어 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 13869)을 돌연변이 발생제로서 니트로소구아니딘을 사용하여 돌연변이 처리함으로써 AEC(S-2-아미노에틸-L-시스테인)에 내성을 갖는 라이신-생산 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 21798)을 제조한다. 한편, 코리네 타입 박테리아에 속하는 산성 L-아미노산 생산박테리아를 이용하는 경우, 비록 이들 박테리아는 일반적으로 바이오틴 영양 요구성일지라도 충분한 양의 바이오틴(10㎍/ℓ 또는 그 이상)이 존재하는 배지중에서 증식은 하지만 산성 L-아미노산은 거의 함유되지 않는다. 산성 L-아미노산을 함유하기 위해서는, 미생물의 증식을 억제시켜야 하며 이를 위해 바이오틴이 부족한 배지를 사용하거나, 충분한 양의 바이오틴이 보충된 배지를 사용할 경우에는 배양 초기단계 또는 배양도중에 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트(PESP)등과 같은 계면활성제를 보충하거나 페니실린등과 같은 락탐 항생제를 보충해야한다. 참조로, 돌연변이에 의해 코리네 타입 박테리아에 속하는 산성 L-아미노산 생산 박테리아로부터 유도된 염기성 L-아미노산 생산박테리아는 여전히 바이오틴-영양요구성이지만, 상기 박테리아의 배양을 통한 발효로 염기성 L-아미노산을 생산하는 경우, 최초의 산성 L-아미노산의 배양을 통한 발효로 산성 L-아미노산을 생산하는 경우와는 달리, 충분한 양의 바이오틴이 배지중에 존재할 수 있으며 바이오틴을 낮은 농도로 제한할 필요는 없다.

본 발명자는, 산성 L-아미노산이 발효에 의해 생산될 수 있는 조건하에서, 최초의 산성 L-아미노산 생산박테리아를 이용한 전술한 염기성 L-아미노산 생산박테리아를 배양하였고 이때 전혀 예기치 않게도 염기성 L-아미노산 뿐만아니라 산성 L-아미노산이 동시에 함유될 수 있음을 발견하였다. 이 경우, 당연한 일로서, 탄소원에 근거한 염기성 L-아미노산의 수율은 감소하고, 산성 L-아미노산은 감소된 수율을 보충하는 양만큼 함유된다.

따라서, 염기성 L-아미노산 생산박테리아가 전술한 바와 같이 바이오틴 요구성 박테리아일 경우, 산성 L-아미노산을 생산하기 위한 조건은, 낮은 농도의 바이오틴이 함유된 배지가 사용되거나 또는 배양의 초기 단계 또는 배양도중에 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트(PESP)등과 같은 계면활성제 또는 페니실린등과 같은 락탐 항생제를 보충하는 것이다.

낮은 바이오틴 농도라는 것은 0.5 내지 10㎍/ℓ의 바이오틴 농도를 나타낸다. 바이오틴을 이와 같은 농도로 조정함으로써, 예를 들어, Lys 및 Glu가 제조될 수 있다. 배지중에 배양 초기 단계 또는 배양도중 보충될 수 있는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트(PESP)등과 같은 계면활성제 또는 페니실린등과 같은 락탐 항생제의 양은, 계면활성제의 경우 약 0.01 내지 0.5g/㎗이고 페니실린의 경우 약 0.1 내지 10U/㎖이다. 이로써, 예를 들어, Lys 및 Glu가 생산될 수 있다.

다음, 본 발명의 두 번째 측면, 즉, 염기성 L-아미노산 생산박테리아와 산성 L-아미노산 생산박테리아를 혼용하고 이들 박테리아를 혼합배양함을 포함하여, 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 동시에 발효시키는 방법이 다음에 기술된다. 염기성 L-아미노산 생산박테리아와 산성 L-아미노산 생산박테리아는 브레비박테리움속과 같은 코리테 타입 박테리아, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subilis) 등과 같은 바실러스속에 속하는 박테리아, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)등과 같은 에스케리키아 속에 속하는 박테리아라는 것은 널리 공지된 사실이다. 이들 아미노산 생산 박테리아가 광범위하게 사용된다. 사용되는 배지와 발효조건은, 본 발명의 첫 번째 측면에 대해 기술한 통상의 공지된 아미노산 발효에서 채택되는 것이다.

본 발명의 두 번째 측면에서 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산의 동시 발효조건은, 염기성 L-아미노산 생산박테리아를 사용하여 발효에 의해 염기성 L-아미노산을 함유하기 위한 조건과 산성 L-아미노산 생산박테리아를 사용하여 발효에 의해 산성 L-아미노산을 함유하기 위한 조건을 단순히 혼용하는 것일 수 있다. 이때, 발효를 위한 이들 두 조건은 공지된 아미노산을 생산하기 위한 조건으로 상기한 바와 같은 내용일 수 있어 전자와 후자 사이에는 커다란 차이가 없다. 유일한 차이점은, 혼합배양될 염기성 L-아미노산 또는 산성 L-아미노산 생산박테리아가 영양요구성이고 다른 것은 비-영양 요구성이라는 것이다. 이런 경우, 영양요구성 박테리아에게는 요구되는 영양소를 배지중에 보충해 주어야만 하나 비-영양요구성 박테리아에게는 요구되는 영양소를 보충해 줄 필요가 없다. 영양요구성 박테리아와 비-영양요구성 박테리아를 혼합하여 배양할 때, 두 박테리아를 배양하기 위한 조건의 혼합이란, 필요한 영양소를 배지중에 보충한다는 것을 의미한다. 하나의 박테리아로는 염기성 L-아미노산을 생산하고 다른 하나의 박테리아로는 산성 L-아미노산을 생산하기 위해, 비-영양요구성 박테리아와 영양요구성 박테리아가 혼합배양될 때, 비-영양요구성 박테리아에 의한 아미노산 생산은 요구되는 영양소가 배지중에 보충된다하더라도 이로인한 전혀 악영향을 받지 않는다.

본 발명의 방법(첫번째 및 두 번째 측면)에 따라, 상기한 바와 같은 동시 발효조건을 채택함으로써, 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산이 배지중에 상업적으로 함유될 수 있는 양, 즉 약 500㎎/㎗ 또는 그 이상의 양으로 동시에 함유될 수 있다.

발효 브로쓰로부터 생산 및 함유된 아미노산을 분리 및 수거하기 위해, 예를 들어 이온 교환 수지법과 같은 통상적인 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, 먼저 양이온 교환 수지를 통해 발효 브로쓰로부터 염기성 아미노산을 흡수 및 분리하고 음이온 교환 수지를 통해 산성 아미노산을 분리한다). 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 첨가물로 사용하기 위해서라면, 이들 아미노산들을 서로 분리시킬 필요가 없다. 전술한 바와 같이, 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산의 동시 발효법은 다음의 설명에서와 같이 여러모로 유익하다.

배지중의 이온성 물질의 양의 감소와 관련하여, Lys를 발효시키는 경우, 선행 기술에서는 단독 Lys 발효에서 형성된 Lys를 중화시키기 위해 0.2 내지 0.4M의 산성 이온이 요구된다. 본 발명의 Lys 및 Glu의 동시 발효법에 따르면, 요구되는 이온성 물질의 양은 0.1 내지 0.2M로 감소시킬 수 있다. 개선된 발효 생산성(아미노산 형성 속도의 향상)의 관점에서, 예를들어, 선행 기술에서 Lys의 단독 발효의 경우, 세포당 및 시간당 Lys의 형성 속도는 0.03 내지 0.04hr^-1이다. 그러나, 본 발명의 Lys 및 Glu의 동시 발효법에 따르면, Lys 및 Glu의 형성 속도는 전체적으로 약 두배에 달하는 0.06 내지 0.08hr^-1까지 개선된다. 배지 성분의 절약과 생략의 관점에서, 예를 들어, 선행 기술의 Lys발효의 경우, 2 내지 6g/㎗ 또는 그 미만이다. 발효 브로쓰의 단순 처리(아미노산 분리를 위한 조작)측면에서, 예를 들어, 선행 기술의 Lys발효의 경우, 탈염(desalting)단계가 요구되나, Lys 및 Glu를 동시 발효시키는 본 발명의 방법에서는 처리 단계중 탈염 단계가 필요없다.

폐액의 환경 보호적 측면에서의 부담 감소면에서, 예를 들어, 선행 기술의 Lys발효의 경우, 이의 제조단계로부터 소모된 폐액은 활성 슬러지 또는 이후의 탈질화 처리를 이용하여 반드시 제거해야할 질소 화합물을 함유하지만, Lys 및 Glu의 동시 발효를 위한 본 발명의 방법으로 폐액중의 질소 화합물을 거의 0까지 감소시킬 수 있다.

실시예

이후에 본 발명은 다음의 실시예들로 좀더 상세히 설명된다.

실시예 1(Lys-생산박테리아의 배양에 의한 Lys 및 Glu의 동시 생산)

140㎎/㎖의 조 당(당으로 계산할 때), 1㎎/㎖의 KH₂PO₄, 0.4㎎/㎖의 MgSO₄·7H₂O, 10㎎/㎖의 FeSO₄·7H₂O, 20㎍/㎖의 MnSO₄·4H₂O, 5㎎/㎖의 우레아, 5㎕/ℓ의 대두 단백질 산 가수분해물 AJI-EKI(등록 상표임), 50㎍/ℓ의 바이오틴 및 60㎍/ℓ의 티아민을 함유하는 수성 용액 배지를 제조하고 각각 20㎖의 배지를 500㎖용적의 진탕 플라스크에 담고 115℃에서 가열하여 10분간 멸균한다.

Lys를 생산하는 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 21798)을 배지상에 접종하고 왕복진탕기에서 31.5℃로 배양한다. 배양 동안, 400㎎/㎖의 농도를 갖는 수성 우레아 용액을 소량 보충하여 이의 pH를 6.5 내지 8.0으로 만든다. 발효액의 26배 희석액의 흡광도가 562㎛에서 0.30에 달하면, 4㎎/㎖의 PESP(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트)를 가하여 발효를 중지시킨다. 발효브로쓰중에 함유된 L-라이신 및 L-글루탐산을 액체 크로마토그래피를 사용하여 정량적으로 측정한다. 30㎎/㎖의 L-라이신 및 22㎎/㎖의 L-글루탐산이 함유되었다. 25㎎/㎖의 황산 암모늄이 보충된 동일한 배지 및 동일한 박테리아를 사용하여, 배양도중에 PESP를 가하지 않은 점을 제외하고는 동일한 방법으로 라이신 단독의 발효를 수행한다. 55시간내에 발효를 종료시키며, 이때 발효 브로쓰중에 53㎎/㎖의 L-리아신이 함유되었다.

L-라이신 및 L-글루탐산의 동시 발효의 경우, 이온성 물질의 양은 L-라이신 단독 발효의 경우의 0.28M에 비해 절반 정도인 0.13M이었다.

아미노산 형성 속도는 세포당 시간당 L-라이신 및 L-글루탐산 형성의 전체속도로서 0.066hr^-1인반면, L-라이신 단독 발효의 경우 L-라이신의 형성 속도는 0.035hr^-1이었다.

배지 성분을 비교해 볼 때, 후자의 L-라이신 단독 발효의 경우 최초 배지에서 황산 암모늄 및 개시 단계에서 및 보충을 위해 우레아-유래된 암모니아가 전체적으로 35㎎/㎖이 요구되었다. 그러나, L-라이신 및 L-글루탐산의 동시 발효의 경우, 황산암모늄은 전혀 요구되지 않았으며 최초 첨가 및 보충을 위해 전체적으로 단지 6㎎/㎖의 우레아-유래된 암모니아가 요구되었다.

생성된 발효 브로쓰는 이온 교환 수지를 사용하여 통상적인 방법으로 후처리한다. L-라이신 단독 발효의 경우, 이온 교환수지에 L-라이신 및/또는 L-글루탐산의 흡착이후에도 잔류하는, 수지를 통한 용출액중의 염농도는 5% 정도로 극단적으로 높았으며 이에 따라 용출물을 효과적으로 활용하기 위해서는 탈염이 필요하였다. 한편, L-라이신 및 L-글루탐산의 동시 발효의 경우, 염농도는 2% 미만으로 낮아서 탈염이 필요하지 않았다.

수지 세척액 등과 같은 폐액은 활성 오니법으로 처리한다. L-라이신 단독 발효의 폐액중 이에 함유된 BOD는 제거할 수 있으나, 다량의 질소 화합물이 잔류하며 이에 따라 별도로 탈질화 처리를 수행할 필요가 있었다.

그러나, L-라이신 및 L-글루탐산의 동시 발효 폐액에서, 활성 오니법에 의해 BOD를 제거한 후 수득한 액체중에서는 특별히 많은 양의 질소화합물이 발견되지 않았다.

실시예 2(Lys-생산 박테리아의 배양에 의한 Lys 및 Glu의 동시 생산)

15%의 글루코스, 0.1%의 제 1 인산칼륨, 0.04%의 황산 마그네슘 6 수화물, 2%의 황산 암모늄, 100㎍/ℓ의 바이오틴, 200㎍/ℓ의 비타민 B₁하이드로클로라이드, 각각 2ppm의 철이온 및 망간 이온 및 1%의 AJI-EKI(pH 7.0)를 별도로 소형의 유리재질 발효조에 각각 300㎖씩 충전시킨다. 멸균후에, 부용 사면 배지에서 30℃에서 24시간 동안 생육시킨 바 있는, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum:ATCC 21127)을 배지상에 접종한다. 그후, 31℃에서 배양을 시작한다. 약 10시간후에, 6U/㎖의 농도로 페니실린을 보충하고 18시간동안 추가 배양한다. 발효 말기에, 3.75g/㎗의 L-라이신과 2.05g/㎗의 L-글루탐산이 생산되며 배지중에 함유된다.

원심분리로 1ℓ의 발효 브로쓰로부터 세포를 제거하고 L-글루탐산과 L-라이신을 분리하며 이온 교환 수지를 사용하여 통상적인 방법으로 상등액으로부터 정제하여 28.1g의 L-라이신-HCl 결정 및 18.5g의 일나트륨 글루타메이트 결정을 수득하였다.

실시예 3(His-생산 박테리아의 배양에 의한 His 및 Glu의 동시 생산)

His-생산 박테리아인 브레비박테리움 플라붐(ATCC 21406)을 다음의 종균 배양 배지에 접종시키고 31℃에서 20시간 동안 호기성 회전 배양한다.

종균 배양 배지:

15%의 글루코스, 0.3g/㎗의 우레아, 50.1g/㎗의 KH₂PO₄, 0.04g/㎗의 MgSO₄·7H₂O, 각각 2ppm의 Fe 및 Mn 이온, 200㎍/ℓ의 바이오틴, 300㎍/ℓ의 티아민 하이드로 클로라이드(총 7%의 질소), 0.5g/㎗의 효모 추출물 및 0.5g/㎗의 육즙을 함유하는 pH 7.2의 수용액 배지.

한편, 다음 조성물을 갖는 각 300㎖의 주발효 배지를 1ℓ 용적의 소형 유리-재질 발효조에 나누어 충전시키고 멸균한다. 배지에 전술한 종균 배양 배지 15㎖를 접종한다. 분당 1/1용적의 공기를 통과시켜 31℃에서 회전 배양을 개시한다.

주 발효 배지:

10g/㎗의 글루코스, 0.5g/㎗의 황산 암모늄, 0.1g/㎗의 KH₂PO₄, 0.04g/㎗의 MgSO₄·7H₂O, 각각 2ppm의 Fe 및 Mn 이온, 100㎍/ℓ의 바이오틴, 200㎍/ℓ의 티아민 하이드로 클로라이드 및 2㎖/㎗의 대두 단백질 염산 가수분해물(총 7%의 질소)을 함유하는 pH 7.2의 수용액 배지.

31℃에서 배양하는 동안 pH가 감소하면, pH를 7.0 내지 7.5로 유지시키기 위해 암모니아 가스를 보충한다.

배양개시 10시간 경과후, 0.4g/㎗ 농도의 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트를 가하고 배양을 지속시킨다.

18시간 후, 0.8g/㎗의 L-히스티딘과 1.2g/㎗의 L-글루탐산이 발효액중에 함유된다. 원심분리하여 발효 브로쓰로부터 세포를 제거하고 통상적인 방법으로 1.9g의 L-히스티딘 결정과 2.8g의 L-글루탐산 결정을 수득하였다.

실시예 4(Glu-생산 박테리아 및 Lys-생산 박테리아의 혼합 배양에 의한 Glu 및 Lys의 동시 생산)

Glu-생산 박테리아인 코리네박테리움 글루타미쿰(NRRL B-12138)과 Lys-생산 박테리아 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 21799)를 각각의 사면 배지로부터 하나의 백금 루프로 긁어내어 각각을 다음의 조성을 갖는 50㎖의 종균 배양 수성 용액 배지상에 접종하고, 각각의 종균 배양 수성 용액을 제조하기 위해 31℃에서 18시간 동안 호기성 회전 배양한다.

종균 배양 배지의 조성:

글루코스 1.5%

암모늄 아세테이트 0.3%

우레아 0.1%

KH₂PO₄0.1%

MgSO₄·7H₂O0.04%

Fe++ 2ppm

Mn++ 2ppm

바이오틴 50㎍/ℓ

티아민 하이드로 클로라이드 200㎍/ℓ

대두 단백질 염산 3%

가수분해 농축물

(총 7%의 질소)

pH 7.5

한편, 다음의 조성을 갖는 각 300㎖의 주 발효 배지를 1ℓ 용적의 소형 유리-재질 발효조에 나누어 충전시키고 통상적인 방법으로 멸균한다. 배지상에 전술한 각각의 종균 배양 배지 15㎖를 동시에 접종한다. 분당 1/1 용적의 공기를 통과시켜 31℃에서 회전 배양을 실시한다.

주 발효 배지:

글루코스 2%

암모늄 아세테이트 0.5%

우레아 0.20%

KH₂PO₄0.1%

MgSO₄·7H₂O 0.04%

Fe++ 2ppm

Mn++ 2ppm

바이오틴 50㎍/ℓ

티아민 하이드로 클로라이드 60㎍/ℓ

대두 단백질 염산 3%

가수분해 농축물

(총 7%의 질소)

pH 7.5

아세트산과 암모늄 아세테이트(아세트산과 암모늄 아세테이트의 혼합비=1:0.25의몰비;혼합물중 아세트산의 농도는 60%)의 혼합물을 연속적으로 또는 간헐적으로 배지에 가하여 배지의 pH 7.2 내지 8.0 사이로 유지한다.

배양개시 10시간 경과후 0.4g/㎗의 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트를 주 발효 배지에 가하면서 31℃에서 72시간 동안 수행한다.

그 결과, 37g/ℓ의 L-글루탐산 및 54g/ℓ의 L-라이신이 함유되었음을 나타내었다.

실시예 5(Asp-생산 박테리아와 Arg-생산 박테리아의 혼합 배양에 의한 Asp 및 Arg의 동시 생산)

다음의 조성을 갖는 종균 배양 수성 용액 배지에 Asp-생산 박테리아인 코리네박테리움 글루타미쿰(NRRL BP-12138)과 Arg-생산 박테리아 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 21493)을 독립적으로 접종한 다음 호기성 회전 배양으로 30℃에서 18시간 배양한다.

종균 배양 배지의 조성:

3%의 글루코스, 0.1%의 KH₂PO₄, 0.04%의 MgSO₄·7H₂O, 2ppm의 Fe++, 2ppm의 Mn++, 3㎖/㎗의AJT-ETI, 50㎍/ℓ의 바이오틴, 300㎍/ℓ의 비타민 B 하이드로 클로라이드 및 0.3%의 우레아를 함유(pH 7.2).

한편, 다음의 조성을 갖는 각각 300㎖의 주 발효 배지를 1ℓ 용적의 소형 유리-재질 발효조에 충전시키고 멸균한다. 상기의 각 종균 배양 배지를 동시에 15v/v%로 접종한다. 분당 1/1 용적의 공기를 통과시켜 31℃, 1500r.p.m.에서 호기성 회전 배양을 개시한다.

주 발효 배지의 조성:

1.5%의 에틸 알콜, 0.5%의 황산암모늄, 0.1%의 KH₂PO₄, 0.04%의 MgSO₄·7H₂O, 2ppm의 Fe++, 2㎖/㎗의 AJT-ETI(등록상표임), 5㎍/ℓ의 바이오틴, 300㎍/ℓ의 비타민 B₁하이드로 클로라이드, pH 7.2.

배양도중 pH가 감소할 경우, pH를 7.0 내지 7.5 사이로 유지하기 위해 암모니아 가스를 보충한다. 가스 크로마토그래피로 소모량을 주시하면서, 에틸알콜이 약 0.1%까지 감소하면 이를 보충한다.

배양 48시간후, 1.30g/㎗의 L-아스파트산과 1.05g/㎗의 L-아르기닌이 발효 브로쓰에 함유되었다. 이온 교환 수지를 사용하는 통상적인 방법으로, 발효브로쓰로부터 2.18g의 L-아스파트산 결정 및 2.18g의 L-아르기닌 결정을 수득하였다.

실시예 6(Asp-생산 박테리아와 His-생산 박테리아의 혼합 배양에 의한 Asp 및 His의 동시 생산)

13g/㎗의 슈크로즈, 0.5g/㎗의 우레아, 0.1g/㎗의 KH₂PO₄, 0.04g/㎗의 MgSO₄·7H₂O, 각각 2ppm의 Fe 및 Mn 이온, 5㎍/ℓ의 바이오틴, 200㎍/ℓ의 티아민 하이드로 클로라이드 및 3㎖/㎗의 대두 단백질 염산 가수분해물 AJT-ETI(총 7%의 질소)를 함유하고 pH 7.2로 조절한 수성 용액 배지를 제조하고 각각 20㎖의 배지를 500㎖ 용적의 진탕 플라스크내에 나누어 채운다. 멸균후, 앞서 부용 사면 배지상에서 생육시킨 Arg-생산 박테리아 브레비박테리움 플라붐(FERM BP-2178)과 His-생산 박테리아인 브레비박테리움 플라붐(ATCC 21406)을 동일한 플라스크내에 접종하고 31℃에서 72시간 회전 배양시킨다. 배양 동안 40g/㎗의 농도를 갖는 수성 우레아 용액을 소량씩 보충하여 pH를 6.5 내지 8.0 사이로 유지한다. 발효브로쓰중에, 0.95g/㎗의 L-아스파트산 결정과 1.6g의 L-히스티딘 결정을 수득하였다.

실시예 7(Glu-생산 박테리아 및 Lys-생산 박테리아의 혼합 배양에 의한 Glu 및 Lys의 동시 생산)

50㎎/㎖의 글루코스, 2㎎/㎖의 우레아, 1㎎/㎖의 KH₂PO₄, 0.4㎎/㎖의 MgSO₄·7H₂O, 10㎍/ℓ의 FeSO₄·7H₂O, 8㎍/ℓ의 MnSO₄·4H₂O, 5㎍/ℓ의 대두 단백질 산 가수분해물 AJT-ETI, 10.0㎍/㎗의 티아민 하이드로 클로라이드 및 0.25㎍/㎗의 바이오틴을 함유하는 수성 용액 배지를 제조하고 각각 20㎖의 배지를 500㎖ 용적의 진탕 플라스크내에 나누어 채우고,115℃에서 10분간 멸균한다. 이 배지에 Glu-생산 박테리아 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 13869)와 Lys-생산 박테리아인 브레비박테리움 락토퍼멘툼(ATCC 21800)을 접종한다. 진탕동안, 배양은 31.5℃에서 수행한다. 배양 도중에, pH를 6.5 내지 8.0 사이로 유지시키기 위해 450㎎/㎖의 농도를 갖는 수성 우레아 용액을 소량씩 보충하여 한다. 30시간후 배양을 완료한다.

발효브로쓰중에 함유된 L-글루탐산과 L-라이신을 정량적으로 측정한다. 그 결과, 10.5㎎/㎖의 L-글루탐산과 15.3㎎/㎖의 L-라이신이 함유된 것으로 나타났다.

본 발명의 동시 발효법으로 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산을 동시 생산하면, 발효 생산성을 개선시키고, 배지 성분을 절감시키며, 발효 브로쓰 처리를 단순화시키고, 발효 브로쓰로부터 아미노산 분리 및 분리후 폐액 처리에 있어 환경보호 부담을 줄이는 잇점이 있다.

Claims

1. 0.5 내지 10㎍/ℓ의 바이오틴을 함유하는 바이오틴-결핍 배지, 또는 2. 배양 초기 단계 또는 배양중에 혼입되는 계면활성제 또는 락탐형 항생제 및 10㎍/ℓ이상의 바이오틴을 함유하는 배지를 사용하는 산성 L-아미노산 생산 조건하에서, 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 바이오틴-영양요구성인 염기성 L-아미노산 생산 박테리아 및 브레비박테리움 속, 코리네박테리움 속, 바실러스(Bacillus)속 또는 에스케리키아(Escherichia)속에 속하는 산성 L-아미노산생산 박테리아를 혼합 배양함을 특징으로 하는, 염기성 L-아미노산과 산성 L-아미노산의 동시 발효법.