KR830001260B1 - 발효에 의한 l-글루타민 제조방법 - Google Patents

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이세배
옥치영
최종수
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서울미원 주식회사
임철수
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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Abstract

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Description

발효에 의한 L-글루타민 제조방법
본 발명은 L-로이신 요구성을 갖고 있으며 알라닌에 의해서 생육이 촉진된는 L-글루다민 생산균주를 이용발효에 의한 L-글루타민을 제조함에 있어서, 로이신 발효액(알라닌도 미량축적됨)을 첨가시킨 영양배지에 배양함을 특징으로 하는 발효에 의해 L-글루타민을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기궤양치류제, 알콜중독치료제, 뇌기능개선제등 의약용으로 크게 각광을 받고 있는 물질이다.
종전 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법은 일본특허공보 소39-7391호에 글루타민 생산균주를 과잉의 질소가 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본특허공보 소51-15688호에 글루타민산 생산균주를 항생물질이나 계면활성제를 첨가한 배지에 배양하는 방법이, 또는 일본특허공보 소 49-81587호에 설파제 내성균주를 분리하여 배양하는 방법등이 알려져 있다.
그러나 질소과잉의 배지에서는 균주의 정상적인 생육이 불량하므로 다량의 금속염을 첨가시켜 질소과잉에 의한 균의 생육저해작용을 제거시켜야 할뿐 아니라 또한 축적된 글루타민산이나 글루타민이 부산물인 푸로린이나 알지닌 합성계로 전환되어 다량의 L-글루타민 축적이 어려웠다.
또 설파제내성균주를 분리하여 배양할때나 항생물질이나 계면활성제 첨가배양시는 사용균주나 그 균주의 생육조건, 그때그때마다 균주의 생육상태에 따라 약제의 처리시간, 처리농도등의 방법이 상이함으로 인한 공업적으로 문제점이 있는 방법이었다.
본 발명자들은 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움 NO 462를 친주로 변이처리하여 얻은, 로이신을 생육에 요구하며 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 새로운 균주 코리네박테리움 MWM-791012(KFCC-10032)를 이용 발효에 의한 방법으로 L-글루타민을 제조할때 로이신발효액을 첨가하면 배양액내에 고농도의 L-글루타민이 축적되는 것을 알게되어 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명을 보다 구체적으로 말하면, 본 발명은 L-로이신요구성이며 알라닌에 의하여 생육이 촉진되는 코리네박테리움속의 변이주 MWM-791012(KFCC-10032)를 이용하여 L-글루타민을 제조할때 별도로 배양한 L-로이신 배양액을 대액량비 1-2%되게 첨가발효시켜 발효종료액내에 L-글루타민의 축적을 현저히 증가시키는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명에 이용된 균주는 토양에서 분리한 글루타민산을 생산하는 코리네박테리움 NO-462를 친주로 통상의 변이처리 즉, 자외선조사 혹은 NTG(N-메칠-N'-메칠-N-니트로소구아니딘), DES(디에칠설페이트)등의 화학변이유기제를 처리하여 페니실린 농축법이나 리플리카방법등으로 선별된 균주중에 생육에 로이신을 요구하며 알라닌에 의해 생육이 촉진되는 균주 MWM-791012를 분리 이용했다.
본 발명에 이용된 L-로이신 발효액은 다음표 1과 같으며 로이신생산균주를 통상의 L-로이신발효법에 의해서 발효한 배양액을 사용했다.
[표 1]
[로이신 발효액의 제조방법]
코리네박테리움속의 로이신 생산균주를 다음의 배지조성을 갖는 종배지에 접종하여 30℃에서 18시간동안 진탕배양하여 종균배양액으로 한다.
글루코스 6%, 펩톤 1%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 콘스팁리커 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 비오틴 100r/
Figure kpo00001
, 요소 0.1%, pH7.0
종균배양액 1
Figure kpo00002
를 다음 조성을 가지는 10
Figure kpo00003
의 주발효배지를 사입한 30
Figure kpo00004
소형 발효조에 접종한다.
글루코스 10%, 유안 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.5g/
Figure kpo00005
, 황산철 20mg/
Figure kpo00006
, 황산망간 20mg/
Figure kpo00007
, 비오틴 50r/
Figure kpo00008
, 치아민염산염 3mg/
Figure kpo00009
, 대두박가수분해물 3%
이 배지를 교반 450rpm, 통기 1vvm, 온도 30℃, pH 6.8-7.0으로 조절하면서 28-34시간 배양한다. 배양도중에 500g/
Figure kpo00010
의 글루코스, 10g/
Figure kpo00011
의 콘스팁리커, 10g/
Figure kpo00012
의 황산암모늄을 함유하는 배지를 추가한다.
배양완료액 내에서의 L-로이신 축적량은 22.6mg/ml였으며, 배양액내의 아미노산의 종류와 그 함량은 다음표 2와 같다.
[표 2]
[로이신 배양액내의 아미노산종류와 그 함량]
Figure kpo00013
글루타민 발효의 배지는 탄소원으로써 포도당, 전분가수분해물, 폐당밀등을 이용할 수 있으며, 질소원으로써는 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄, 초산암모늄등이 이용가능하며 천연의 영양원으로써 콘스팁리커(C.S.L), 육즙, L-로이신발효액, 효모엑기스, 펩톤등의 사용이 가능하며, 무기염류로써는 황산마그네슘, 염화아연, 제1인산칼슘, 제2인산칼륨, 황산망간 등이 혼합첨가된 배지면 이용 가능하다. 글루타민 발효의 배양방법은 30℃내외의 온도에서 pH 5.5-7.5로 유지하면서 호기적 조건으로 배양한다. 이와 같은 조건으로 글루타민 발효를 행할때 각 농도별 L-로이신 배양액을 첨가하여 배양한 글루타민 발효액내의 글루타민 축적량은 다음표 3과 같다.
[표 3]
[글루타민 발효액에 L-로이신 배양액 첨가농도]
Figure kpo00014
주) 발효배지 : 후기실시예 1참조
발효방법 : 후기실시예 1과 동일한 방법
L-로이신 배양액의 첨가방법은 발효초기에 전량을 첨가하거나 혹은 적당량씩 나누어 몇번에 걸쳐 첨가하는 방법, 발효도중에 한꺼번에 첨가하는 방법등이 있다.
이와 같이 로이신 배양액을 첨가하므로써 근루타민의 배지내 축적이 증가하는 원인은 로이신 발효액중의 여러 아미노산 특히, 로이신과 알라닌은 균의 생육에 관여하여 균의 생육을 촉진시키는 작용을 하며 배지내 함유된 그외의 아미노산은 L-글루타민 생합성이외의 아미노산 합성계를 제어시켜 L-글루타민 합성계 활성효율을 최대로 하여주기 때문인 것으로 판단된다.
본 발명자들의 실험결과에 의하면 글루타민 발효배지중 로이신배양액 첨가농도는 1-2%가 가장 적당한 것으로 나타났다. 발효 배양액내에 축적된 글루타민의 회수는 상법에 따라 이온고환수지에 흡착, 용리시켜 얻은 용리액을 에탄올로 결정 분리하여 조결정을 얻었다.
이하 실시예에서 상세히 설명하는 바와 같다.
[실시예 1]
사용균주 : 코리네박테리움 글루타미컴 MWM-791012(KFCC-10032)
종배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30r/
Figure kpo00015
, PH7.0
발효배지 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(C.S.L) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산카리 0.2%, 제2인산카리 0.2%, 황산마그네슘 300mg/
Figure kpo00016
, 황산철 20mg/
Figure kpo00017
, 황산망간 20mg/
Figure kpo00018
, 황산아연 10mg/
Figure kpo00019
, 치아민염산염 2mg/
Figure kpo00020
, 요소 0.5%, 로이신배양액 2%, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가) PH7.2
배양방법 : 상기 종배지 50ml를 500ml 진탕후라스크에 분주하고 상법에 따라 가압 멸균한 후 MWM-791012 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종균배양액으로 하였다. 발효배지 20ml를 500ml 진탕후라스크에 사입하고 120℃에서 10분간 가압멸균한 후 미리 준비한 종균배양액 2ml 접종하여 60시간 배양하였다.
배양조건 : 온도 30℃ 진탕수 120rpm으로 배양한다.
L-글루타민의 축적량 : 배양종료액내 축적된 L-글루타민은 49.9mg/ml였다.
[실시예 2]
실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 2
Figure kpo00021
를 사입하여 멸균한 5
Figure kpo00022
소형 발효조에 종균배양액 200ml를 접종하여 650rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. pH조절은 암모니아수로 6.0-7.0으로 조절한다. 배양종료시 L-글루타민의 축적량은 54.2mg/ml였다. 발효종료액 1
Figure kpo00023
를 균체를 제거한후 상법에 따라 이온교환수지에 글루타민을 흡착분리 정제하여 48.0g의 L-글루타민 조결정을 얻었다.
[실시예 3]
실시예 2의 발효배지 조성중 포도당대신 폐당밀을 포도당으로 10%되게 환산하여 첨가한 발효배지 2
Figure kpo00024
를 5
Figure kpo00025
소형발효조에 사입한 후 120℃에서 15분간 멸균한다. 여기에 종균배양액 200ml를 접종하여 600rpm, 1.5vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다. pH조절은 암모니나수로 6.0-7.0으로 조절한다. 발효종료시 L-글루타민의 축적량은 50.6mg/ml였다.
[실시예 4]
실시예 2의 발효배지 조성중 폐당밀 대신 전분가수분해물을 포도당으로 환산하여 10%되게 첨가한다. 그의 배양방법은 실시예 2와 동일하게 행한다. 발효종료시 L-글루타민의 축적량은 51.3mg/ml였다.

Claims (1)

  1. L-로이신 요구성이며 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 코리네박테리움속의 변이주 MWM-791012(KFCC-10032)를 이용하여 L-글루타민을 제조함에 있어서, 별도로 배양한 L-로이신 배양액을 대액량비 1-2%되게 첨가하여 발효시켜 발효종료액내에 L-글루타민의 축적을 현저히 증가시키는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-글루타민 제조방법.
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