KR0133853B1 - L-트레오닌의 제조방법 - Google Patents

L-트레오닌의 제조방법

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KR0133853B1 KR1019890015728A KR890015728A KR0133853B1 KR 0133853 B1 KR0133853 B1 KR 0133853B1 KR 1019890015728 A KR1019890015728 A KR 1019890015728A KR 890015728 A KR890015728 A KR 890015728A KR 0133853 B1 KR0133853 B1 KR 0133853B1
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Abstract

내용없음

Description

L-트레오닌의 제조방법
본 발명은 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하고, 시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체에 대한 내성 및 L-트레오닌 생산능을 갖는 미생물을 사용하는 L-트레오닌의 제조방법에 관한 것이다.
L-트레오닌은 아미노산 제제와 같은 의약품으로서 유용할 뿐만아니라, 동물 사료용 첨가제로서 유용한 아미노산이다.
이제까지는 예를 들면, 에스케리키아 속에 속하고, 보렐리딘 민감성인 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허공고 제 6752/76호), 에스케리키아 속에 속하고, 디아미노피델산 및 메티오닌을 요구하며 그의 트레오닌 생합성계가 트레오닌의 피이드백 억제를 받지않는 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허공고 제10037/81호), 세라티아(Serratia)속에 속하며, 트레오닌 데히드로게나제가 결손되고, 트레오닌 대사 길항근에 내성인 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허공고 제48195/77호), 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하고, α-아미노-β-히드록시발레드산 및 s-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성 및 메티오닌 요구성을 갖는 미생물을 사용하는 제조방법(일본국 특허공개 제19087/72호), 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하고, α-아미노-β-히드록시발레르산 및 s-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성 및 루이신 요구성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허 공개 제31093/75호), 브레비박테리움 속에 속하고, α-아미노-β-히드록시발레르산 및 s-(2-아밀노에틸)-L-시스테인에 대한 내성 및 L-이소루이신 및 L-라이신 요구성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허공개 제224684/83호), 및 에스케리키아 속에 속하고 리팜피신, 라이신, 메티오닌, 아스파르트산 및 호모세린 중 적어도 하나에 대한 내성을 갖거나 또는 L-트레오닌 분해력이 감소된 미생물을 사용하는 방법(일본국 특허공개 제273487/88호) 등의 발효에 의한 L-트레오닌의 각종 제조방법이 공지되어 있다.
본 발명에 따르면 시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체에 대한 내성 및 L-트레오닌 생산능을 갖는 에스케리키아 속의 미생물을 L-트레오닌이 배양브로쓰에 측적될때까지 배지내에서 배양하고, 여기에서 L-트레오닌을 회수함으로써 L-트레오닌을 고수율로 제조할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 그것이 에스케리키아속에 속하고, 시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체에 대한 내성 및 L-트레오닌 생산능을 갖는한 어떤 미생물도 사용 할 수 있다.
상기 시스테인 또는 시스틴 유사체의 예는 S-메틸시스테인, S-에틸시스테인, 알릴글리신, 호모시스테인, 시스틴-히드록사메이트, 시스테인산 및 호모시스테인산이다.
시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체에 내성인 변이 주는 L-트레오닌-생산에스케리키아속 미생물에 시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체에 대한 내성을 통상적인 변이 기술에 의해 부여함으로써 수득할 수 있다.
바람직한 변이주의 예는 에스케리키아 콜리 H-7256, 에스케리키아 콜리 H-7263, 에스케리키아 콜리 H-7293 및 에스케리키아 콜리 H-7294이다.
에스케리키아 속에 속하는 L-트레오닌-생산 미생물은 부산물로 소량의 다른 아미노산만을 생산하므로 유리하다.
상기 변이주를 수득하기 위한 방법의 특정예를 하기에 기술 하겠다.
디아미노피멜산 및 메티오닌을 요구하며, α-아미노-β-히드록시발레르산 및 리팜피신에 대해 내성인 에스케리키아 콜리 H-4258(FERM BP-985)를 30℃에서 30분 동안 200μg/ml-N-메틸-N-니트로-N'-니트로소구아니딘(NTG)로 처리한다.
처리 세포를 1g/ℓ 시스틴-히드록사메이트를 함유하는 최소배지[5g/ℓ 글루코스, 1g/ℓ(NH4)2SO4, 2g/ℓ KH2PO4, 7g/ℓK2HPO4, 0.1g/ℓMgSO4·7H2O, 20mg/ℓFe2(SO4)3, 50mg/ℓ디아미노피델산, 50mg/ℓ 메티오닌 및 20g/ℓ한천, ph 7.2]에 스미어 하고, 30℃에서 2∼6일 동안 배양하여 여기에서 성장할 수 있는 시스틴-히드록사메이트-내성 변이체의 콜로니를 수득한다. 그런후, 50변이주를 취해 L-트레오닌 생산성을 시험한다.
H-4258균주의 L-트레오닌 생산성보다 더 높은 생산성을 갖는 변이체를 선택한다. 선택된 균주를 에스케리키아 콜리 H-7256으로 명명한다.
시스틴-히드록사메이트 대신에 알릴글리신, 시스테인 및 시스틴을 각각 사용한다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 각각 0.5g/ℓ알릴글리신, 5g/ℓ 시스테인 및 5g/ℓ시스틴에 대한 내성을 갖는 변이체를 제조하고 각각 에스케리키아콜리 H-7263, H-7293 및 H-7294로 명명한다.
이렇게 수득된 균주 H-7256, H-7263, H-7293 및 H-7294는 부다페스트 조약하에 1988년 11월 8일자로 일본국 통산 산업성 공업 기술원 미생물 공업기술 연구소에 FERM BP-2137, FERM BP-2138, FERM BP-2139 및 FERN BP-2140의 수탁번호로 기탁되었다.
표 1은 시스테인 또는 시스틴, 또는 그의 유사체를 함유하는 최소한천 플레이트에 30℃에서 24시간 동안 배양할때의 상기 모균주(H-4258 균주) 및 변이 균주의 성장을 나타낸다.
Figure kpo00001
Figure kpo00002
L-트레오닌은 상기 변이체를 탄소원, 질소원, 무기염, 성장인자 등을 함유하는 합성 또는 천연 배지에서 L-트레오닌이 배양 브로쓰에 축적될때까지 배양하고, 여기에서 L-트레오닌을 회수함으로써 수득할 수 있다.
탄소원으로는 글루코스, 프록토스, 당밀, 전분 가수분해물 및 조(crude)당의 가수분해물과 같은 탄화수소, 및 아세트산, 프로피온산, 포름산, 푸마르산 및 말산과 같은 유기산을 사용할 수 있다.
질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황상암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄과 같은 무기 또는 유기산의 암모늄염, 아민 및 기타 질소-함유 화합물, 펩톤, 육즙, 옥수수침지액, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 가수분해물, 각종 배양 세포 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기화합물로는,인산이수소칼륜, 인산수소이칼륨, 인산마그네슘, 황상마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 적절한 양으로 사용할 수 있다.
사용되는 균주가 영양분을 요구할 경우에는, 또한 성장에 필요한 화합물을 배지에 가할 필요가 있다. 몇몇 경우에는, 이러한 영양분이 다른 배지 성분으로 충분히 공급될 수 있으므로 특별히 보충할 필요는 없다.
배양은 호기조건하, 예를 들면 20∼40℃, 바람직하게는 28∼38℃에서 통기 및 교반하면서 교반 배양 또는 심부 배양으로 수행한다. 배지의 pH는 배양동안에 5∼9, 바람직하게는 중성 부근으로 유지한다. pH는 탄산칼슘, 무기또는 유기산, 알칼리성 용액, 암모니아, pH완충액등으로 조정한다.
일반적으로, 2∼7일동안 배양함으로써 L-트레오닌을 배양 브로쓰에 축적시킨다. 배양후, 세포와 같은 침전물을 여과, 원심분리등으로 배양액에서 제거하고, L-트레오닌을 이온 교환처리, 농축, 투석 등의 조합으로 생성브로쓰에서 회수할수 있다.
본 발명의 특정 구현예를 하기 실시예에 의해 설명한다.
[실시예 1]
에스케리키아 콜리 H-7256, 에스케리키아 콜리 H-7263, 에스케리키아 콜리 H-7293, 에스케리키아 콜리 H-7294 및 에스케리키아 콜리 H-4258을 종 균주로 사용한다. 각 균주를 20g/ℓ글루코스, 10g/ℓ펩톤, 10g/ℓ효모 추출액, 2.5g/ℓ NaCl 및 0.1g/ℓ디아미노피델산을 함유하는 종 배지내 30℃에서 16시간 동안 교반배양한다.
발효 배지의 조성은 70g/ℓ 글루코스, 14g/ℓ(NH4)2SO4, 2g/ℓKH2PO4, 1g/ℓ MgSO4·7H2O, 0.3g/ℓ디아미노피델산, 0.1g/ℓDL-메티오닌, 2g/ℓ옥수수침지액 및 30g/ℓCaCO3(pH7.4)이다.
배양액내 형성된 L-트레오닌의 양을 표 2에 제시한다.
Figure kpo00003
Figure kpo00004
H-7256균주를 사용하여 수득된 L-트레오닌-함유발효 브로쓰(20ml)를 원심분리(3000r.p.m., 10분)하여 세포 및 기타 불순물을 제거한다. 수득된 상층액을 강산 양이온 교환수지 디아이온 SKI 칼럼(H+-형, Mitsubishi Kasei Corporation 제품)을 통과시켜 여기에 L-트레오닌을 흡착시킨다. 칼럼을 물로 세척하고, 0.5N암모니아수로 용출시킨다. L-트레오닌-함유 분획을 수집 및 농축한후 에탄올을 가한다. 혼합물을 냉각하에 보존하여 2.5g의 L-트레오닌 결정(순도:98%이상)을 수득한다.
[실시예 2]
H-7256, H-7263, H-7293, H-7294 및 H-4258균주를 실시예 1과 동일한 방법으로 종 배양한다. 생성된 종 배양액(100ml)을 하기 조성의 발효배지1ℓ를 함유하는 2-ℓ발효기에 접종한다. 발효배지에 60%글루코스를 적절히 공급하고 배양 배지의 pH를 암모니아수를 사용하여 6.5로 유지하면서 30℃에서 80시간동안 교반 및 통기(700r.p.m.,1ℓ/분)배양한다.
발효 배지의 조성은 30g/ℓ글루코스, 12g/ℓ(NH4)2SO4, 3g/ℓKH2PO4, 0.2g/ℓMgSO4·7H2O, 6g/ℓ 디아미노피델산, 1g/ℓ DL-메티오닌 및 12g/ℓ옥수수 침지액이다.
배양액내에 형성된 L-트레오닌의 양을 표 3에 제시한다.
Figure kpo00005

Claims (7)

  1. 에스케리키아 속에 속하고 5g/l 시스테인, 5g/l 시스틴, 0.05g/l시스틴-히드록사메이트 또는 0.5g/l알릴글리신에 대한 내성과 L-트레오닌 생산능을 가진 미생물을 배지에서 배양하여 L-트레오닌을 배양 브로스에 축적시키는 단계, 및 그로부터 L-트레오닌을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 L-트레오닌의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜리 종에 속하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜리 H-7256(FERM BP-2137), 에스케리키아 콜리 H-7263(FERM BP-2138), 에스케리키아 콜리 H-7293(FERM BP-2139)또는 에스케리키아 콜리 H-7294(FERM BP-2140)인 방법.
  4. 에스케리키아 콜리 H-7256 (FERM BP-2137).
  5. 에스케리키아 콜리 H-7263 (FERM BP-2138).
  6. 에스케리키아 콜리 H-7293 (FERM BP-2139).
  7. 에스케리키아 콜리 H-7294 (FERM BP-2140).
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