HU202590B

HU202590B - Process for producing l-treonine

Info

Publication number: HU202590B
Application number: HU895849A
Authority: HU
Inventors: Junichi Takano; Satoru Furukawa; Toshihide Nakanishi
Original assignee: Kiowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1991-03-28
Also published as: DE68912885T2; CA2002464C; HU895849D0; US5087566A; JP2578492B2; HUT53941A; EP0368284B1; CA2002464A1; EP0368284A2; KR0133853B1; KR900008047A; DE68912885D1; EP0368284A3; JPH02131589A

Description

A találmány tárgya eljárás L-treonin előállítására az Escherichia nemzetséghez tartozó és ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaira rezisztens és L-treonin termelésére képes mikroorganizmusok segítségével.

Az L-treonin olyan aminosav, amely nemcsak gyógyszerként használható, mint aminosav-készítmény, hanem állati takarmányhoz is használható adalékként

Ez ideig különböző eljárások ismeretesek L-treonin fermentációval való előállítására; például egy olyan eljárás, amely az Escherichia nemzetséghez tartozó és borrelidinre szenzitív mikroorganizmust alkalmaz (6752/76 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), az Escherichia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus diamino-pimelinsavat és metionint igényel, és amelynek treonin-bioszintézis rendszere rezisztens treonin visszacsatolásos inhibiciójára (10037/81 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Serratia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus tre. onin - dehidrogenáz hiányos és rezisztens treonin metabolizmus antagonistákra (48195/77 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Cory nebacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-p-hidroxi-valeriánsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és metionint igényel (19087/72 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Brevibacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-p-hidroxi-valeriánsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és leucint igényel (31093/75 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés), a Brevibacterium nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus rezisztens a-amino-p-hidroxi-valeriánsavra és S-(2-amino-etil)-L-ciszteinre és L-izoleucint és L-lizint igényel (224684/83 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés) és az Escherichia nemzetséghez tartozó olyan mikroorganizmust alkalmazó eljárás, amely mikroorganizmus a rifampicin, lizin, metionin, aszparaginsav és homoszerin közül legalább egyre rezisztens, vagy csökkent az L-treonint lebontó képessége (273487/88 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés).

A jelen találmány szerint L-treonin magas kitermeléssel termelhető az Escherichia coli fajhoz tartozó egyik olyan mikroorganizmus táptalajban való tenyésztésével, amely mikroorganizmus rezisztens ciszteinre vagy cisztinre vagy ezek analógjaira és képes L-treonin termelésére, amíg az L-treonin felhalmozódik a fermentlében, és onnan kinyerhető.

A jelen találmány szerinti eljárásban bármely mikroorganizmus felhasználható, amennyiben az Escherichia coli fajhoz tartozik, rezisztens ciszteinre vagy cisztinre vagy ezek analógjaira, és képes L-treonint termelni.

Cisztein és cisztin előbb említett analógjaira példaként S-metil-cisztein, S-etil-cisztein, allil-glicin, homocisztein, cisztin-hidroxamát, ciszteinsav és homociszteinsav említhető.

A ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaikra rezisztens mutáns törzs egy Escherichia coli fajhoz tartozó és L-treonint termelő mikroorganizmus szokásos mutációs technika segítségével ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaikra való rezisztenciával történő felruházásával nyerhető.

Az előnyös mutáns törzsekre példaként Escherichia coli H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia coli H-7293 és Escherichia coli H-7294 említhetők.

Az Escherichia coli fajhoz tartozó és L-treonint termelő mikroorganizmusok előnyösek abból a szempontból, hogy más aminosavakat melléktermékként csak csekély mennyiségben termelnek.

Az előbb említett mutáns törzsek előállítására szolgáló eljárás egy speciális példáját a leírás következő részében adjuk meg.

Escherichia coli Η-4258-at (FERM BP-985), amely diamino-pimelinsavat és metionint igényel és rezisztens a-amino-p-hidroxi-valeriánsavra és rifampicinre, 30 *C-on 30 percig kezelünk 200 gg/ml N-metil-N-nitro-N’-nitrozo-guamidinnel (NTG).

A kezelt sejteket 1 g/liter cisztein-hidroxamátot tartalmazó minimál táptalajra [5 g/liter glükóz, 1 g/liter amónium-szulfát, 2 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát, 7 g/liter dikálium-hidrogén-foszfát, 0,1 g/liter magnézium-szulfát-víz (1/7), 20 mg/liter vas(III)-szulfát, 50 mg/litcr diamino-pimelinsav, 50 mg/liter metionin és 20 g/liter agar, pH 721 leoltjuk, és 30 ’C-on 2-6 napig tenyésztjük ezen a táptalajon növekedésre képes cisztin-hidroxamát rezisztens mutánsok telepeinek nyerése céljából. Utána 50 mutáns törzset felszedünk, és L-treonin termelési vizsgálatnak vetjük alá.

Szelektáltunk egy olyan mutánst, amely a H-4258énál magasabb L-treonin-termelőképességgel rendelkezik. A szelektált törzset Escherichia coli H^:7256-nak neveztük.

A fentiekhez hasonló módon szelektáltunk 0,5 g/liter allil-glicinre, 5 g/liter ciszteinre, illetve 5 g/liter cisztinre rezisztens mutánsokat, azzal az eltéréssel, hogy cisztinhidroxamát helyett allil-glicint, ciszteint, illetőleg cisztint használtunk, és a mutánsok az Escherichia coli H-7263, H-7293, illetve H-7294 nevet kapták.

Az így nyert H-7256, H-7293 és H-7294 törzseket 1988. november 8-án letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japánnál a Budapesti Egyezménynek megfelelően a FERM BP-2137, FERM BP-2138, FERM BP-2139, illetőleg FERM BP-2140 számokon.

Az 1. táblázat az előbb említett szülő törzs (H-4258 törzs) és a mutáns törzsek növekedését szemlélteti, amikor a tenyésztést 24 óra hosszat 30 ’C-on ciszteint vagy

7. táblázat

Koncent- ráció (g/liter)	Törzs növekedése
H-7256 H-7263 H-7293 H-7294 H-4258
Adalék
nélkül 0	++	++	++	++ ++
Cisztin-hid-
roxamát 0,05	++	—		- _
Allil-glicin 0,05	-	++	-	- _
Cisztein 5	-	-	++	-
Cisztin 5	-	-	-	++

++: megfelelő növekedés nincs növekedés

HU 202 590 Β cisztint vagy analógjaikat tartalmazó minimál agar-lemez táptalajon végezzük.

Az L-treonin úgy állítható elő, hogy a fenti mutánsokat szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat, növekedési faktorokat és hasonlókat tartalmazó szintetikus vagy természetes táptalajban tenyésztjük, amíg L-treonin halmozódik fel a fermentlében, és utána ebből kinyerjük az L-treoninL

Szénforrásokként szénhidrátok, például glükóz, fruktóz, melaszok, keményítő hidrolizátum és nyerscukor-hidrolizátum, valamint szerves savak, például ecetsav, propionsav, hangyasav, fumársav és almasav használhatók.

Nitrogénforrásokként ammónia, szervetlen és szerves savak ammóniumsói, például ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónium-acetát és ammónium-foszfát, aminok és egyéb nitrogéntartalmú vegyületek, pepton, húskivonat, kukoricalekvár. kazein-hidrolizátum, szójadara hidrolizátum, különböző sejttenyészetek és ezek emésztett termékei stb. használhatók.

Szervetlen vegyületekként kálium-hidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(II)-szulfát, mangán-szulfát, réz(II)-szulfát, kalcium-karbonát stb. használhatók megfelelő mennyiségben.

Amennyiben a felhasznált törzs tápanyagokat is igényel, úgy a növekedéshez szükséges vegyületeket is kell adni a táptalajhoz. Bizonyos esetekben elegendő mennyiségű ilyen tápanyagokat biztosíthat más táptalajkomponens is, és így nincs szükség külön pótlásra.

A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, például rázatott tenyészetben vagy merített tenyészetben levegőztetés és keverés közben 20 ’C-tól 40 ’C-ig, előnyösen 28 ’C-tól 38 ’C-ig terjedő hőmérséklettartományban. A táptalaj pH-ját a tenyésztés során 5 és 9 között tartjuk, előnyösen semleges körüli pH-η. A pH-t kalcium-karbonát, szervetlen vagy szerves savak, lúgos oldatok, ammónia, pufferoldatok vagy hasonlók segítségével állítjuk be.

Az L-treonin általában 2-7 napig tartó tenyésztés alatt halmozódik fel a fermentlében. A tenyésztés befejeztével a kiválásokat, például sejteket szűréssel, centrifugálással stb. eltávolítjuk a tenyészetből, és az L-treonint a kapott fermentléből ioncserés kezelés, bepárlás, kisózás stb. kombinációjával nyerjük ki.

A találmány speciális megvalósítását a következő mintapéldákkal szemléltetjük.

1. példa

Oltó törzsként Escherichia coli H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia coli H-7293, Escherichia coli H-7294 és Escherichia coli H-4258 törzseket használunk. Az egyes törzseket 20 g/liter glükózt, 10 g/liter peptont 10 g/liter élesztőkivonatot, 2,5 g/liter nátrium-kloridot és 0,1 g/liter diamino-pimelinsavat tartalmazó oltó-táptalajban tenyésztjük 30 ’C-on 16 óra hosszat rázatva. Utána 2 ml így kapott oltótenyészetet inokulálunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 20 ml alább megadott összetételű fermentációs táptalajba, és 30 ’C-on 72 órát rázatva tenyésztjük.

A fermentációs táptalaj összetétele: 70 g/liter glükóz, 14 g/liter ammónium-szulfát 2 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát 1 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrat, 0,3 g/liter diamino-pimelinsav, 0,1 g/liter DL-metionin, g/liter kukoricalekvár és 30 g/liter kalcium-karbonát (pH = 7,4).

A tenyészetben keletkező L-treonin mennyiségét a 2. táblázatban láthatjuk.

2. táblázat

Törzs	Tulajdonság	L-treonin mennyisége (g/liter)
H-7256	Cisztin-hidroxamát-rezisztencia 22,3
H-7263	Allil-glicin-rezisztencia	21,2
H-7293	Cisztein-rezisztencia	20,1
H-7294	Cisztin-rezisztencia	19,8
H-4258		17,2

A H-7256 törzs alkalmazásával kapott 200 ml L-treonin-tartalmú fermentlevet 10 percig percenkénti 3000 fordulattal centrifugáljuk a sejtek és egyéb szennyezések eltávolítása céljából. A kapott felülúszót az erősen savas Diaion SKI kationcserélő gyantával (hidrogénciklus, a Mitsubishi Kaséi Corporation terméke) töltött oszlopon átengedve felkötjük az L-treoninL Az oszlopot vízzel végzett mosás után 0,5 n vizes ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. Az L-treonint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, majd etanolt adunk a koncentrátumhoz. Az elegyet lehűtve állni hagyjuk. így

2,5 g kristályos L-treonint kapunk, amely 98%-os vagy nagyobb tisztaságú.

2. példa

A H-7256, H-7263, H-7293, H-7294 és H-4258 törzsekből az 1. példában leírthoz hasonló módon oltótenyészetet készítünk. A kapott oltótenyészetből 100 ml-t inokulálunk egy 2 literes fermentorban lévő 1 liter alább lefrt összetételű fermentációs táptalajba. A tenyésztést 30 ’C-on keveréssel és levegőztetéssel (700 fordulat/perc; 11 iter/perc) 80 óra hosszat folytatjuk, mialatt a fermentációs táptalajba pótlásként megfelelő mennyiségű 60%-os glükóz oldatot adunk, és a táptalaj pH-ját vizes ammónium-hidroxid oldattal 6,5 körül tartjuk.

A fermentációs táptalaj összetétele: 30 g/liter glükóz, 12 g/liter ammónium-szulfát 3 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát 0,2 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrát, 6 g/liter diamino-pimelinsav, 1 g/liter DL-metionin és 12 g/liter kukoricalekvár.

A tenyészetben keletkező L-treonin mennyiségét a 3. táblázatban láthatjuk.

3. táblázat

Törzs	Utreonin mennyisége (g/liter)
H-7256	63,5
H-7263	62,1
H-7293	55,8
Hr7294	56,0
H-4258	49,6

HU 202 590 Β

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás L-treonin előállítására, azzaljellemezve, hogy az Escherichia coli fajhoz tartozó és ciszteinre vagy cisztinre vagy analógjaikra rezisztens és L-treonin tér- 5 melésére képes mikroorganizmust alkalmas táptalajban tenyésztünk, míg L-treonin halmozódik fel a főmenüében, majd a felhalmozódott L-treonint kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az S-metil-cisztein, S-etil-cisztein, allil-glicin, ho- 10 mocisztein, cisztin-hidroxamát, ciszteinsav és homociszteinsav által alkotott csoportba tartozó ciszteinvagy cisztin-analógra rezisztens mikroorganizmust tenyésztünk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás L-treonin előállítására, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli H-7256 (FERM BP-2137), Escherichia coli H-7263 (FERM BP-2138), Escherichia coli H-7293 (FERM BP2139) vagy Escherichia coli H-7294 (FERM BP-2140) mikroorganizmust tenyésztünk.