KR960016870B1

KR960016870B1 - 발효에 의한 l-이소로이신의 제조방법

Info

Publication number: KR960016870B1
Application number: KR1019960045022A
Authority: KR
Inventors: 구니끼 기노; 가즈유끼 오까모또; 야수야 다께따; 요시유끼 구라쓰
Original assignee: 교와 학꼬 고오교오 가부시끼가이샤; 나까무라 간노수께
Priority date: 1992-02-25
Filing date: 1996-10-10
Publication date: 1996-12-23

Abstract

요약없음

Description

발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법

본 발명은 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법에 관한 것이다.

L-이소로이신은 아미노산 제제등의 약제로서 유용하며, 또한 동물먹이 첨가제로서 사용할 수 있는 아미노산이다.

에쉐리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물을 사용한 발호에 의해서 L-쓰레오닌을 제조하는 방법으로서, 보렐리딘 감수성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특공소 51-6752호), 성장을 위해 디아미노피멜린산과 메치오닌을 요구하며, 쓰레오닌의 생합성계가 쓰레오닌의 피드백 저해에 저항성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특공소 56-10037호), 리팜피신, 리신, 메치오닌, 아스파라긴산 및 호모세린중 적어도 하나에 내성을 갖거나 또는 L-쓰레오닌 분해능이 저하된 미생물을 사용하는 방법(일본 특개소 63-273487호, 미국 특허 No. 5017483)이 알려져 있다.

본 출원인은, L-세린 및/또는 에치오닌에 대한 내성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특개평 3-259088호, 유럽 특허공보 No. 445830), L-리신 존재하에서 L-페닐알라닌 및/또는 L-로이신에 대한 내성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특원평 3-224259호)에 관한 특허를 출원한 바 있다.

다른 한편, 에쉐리키아속에 속하는 미생물을 사용한 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법도 몇가지 알려져 있고, 돌연변이를 사용한 방법으로서, L-이소로이신 유사물에 대한 내성을 가지며, 또한 아르기닌 히드록사메이트 및/또는 에치오닌에 대한 내성을 갖는 미생물을 사용하는 방법만 본 출원인이 특허출원한 바 있다(일본 특원평 3-294420호).

또한, 재조합 DNA 기술에 의하여 쓰레오닌 디아미나제(deaminase) 또는 아세토히드록시간 신타아제(synthase) (즉, L-이소로이신 합성의 키(key) 효소)의 활성을 증가시킨 에쉐리키아속에 속하는 미생물을 사용하는 방법이 알려져 있다(일본 특개평 2-458호)

그러나, 상기 종래 기술은, 생성된 L-이소로이신의 수율이 낮으므로, 만족스럽지 못하다.

본 발명에 의하면, 에쉐리키아속에 속하고 퓨린 유사물에 대한 내성과 L-이소로이신의 생성능이 있는 미생물을 배지중에서 배양하여 배양액중에 L-이소로이신을 생성축적시켜 그로부터 L-이소로이신을 회수하는 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 사용되는 미생물로서는, 에쉐리키아속에 속하고, 퓨린 유사물에 대한 내성이 있고, L-이소로이신 생성능이 있는 것이면, 어떠한 미생물이라도 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물의 퓨린 유사물에 대한 내성은, 6-디메틸아미노퓨린, 6-메틸아미노퓨린, 6-머캅토퓨린, 8-아자아데닌, 8-아자디아미노퓨린등에 대한 내성을 말한다.

본 발명의 L-이소로이신 생성 미생물은 L-이소로이신 생성능이 있는 에쉬리키아속에 속하는 미생물을 통상의 변이 기술로 변이시키고, 퓨린 유사물 내성을 부여함으로써 얻을 수 있다.

또한, 야생 균주로부터 유도된 퓨린 유사물 내성 변이주에, 영양요구성 또는 이소로이신 대사 길항물질 내성등과 같은 L-이소로이신 생산성의 향상을 위한 돌연변이를 일으킴으로써 얻을 수도 있다. 적합한 미생물의 바람직한 예를들면, E, coli H-8460, H-8461, H-8624등이 있다.

본 발명의 미생물을 사용한 L-이소로이신의 제조는 상기 미생물을 통상의 방법으로 배양하여 행할 수 있다.

사용되는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기화합물, 사용된 균주에 필요한 미량의 다른 영양소를 적정히 함유하는 한, 합성 또는 자연배지 어느것이나 사용할 수 있다.

상기 탄소원으로선, 글루코스, 프락토스, 락토스, 당밀, 셀룰로스, 가수분해물, 당 가수분해 원액, 전분 가수분해물등의 탄수화물과 ; 피루브산, 초산, 푸마르산, 말레산, 젖산 등의 유기산 등을 사용할 수 있다.

사용된 미생물의자화성에 따라서, 글리세롤, 에탄올 등의 알콜류를 사용할 수도 있다.

질소원으로서는, 각종 무기 및 유기암모늄염, 즉, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 초산암모늄, 인삼암모늄 등과 아민류와 기타 함질소화합물, 펩톤, 육즙, 콘스팁액(corn steep liquor), 카제인 가수분해물, 대두막 가수분해물, 각종의 발효 균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.

상기 무기화합물로서는, 인산 2수소 칼륨, 인산수소 2칼륨, 인산 마그네슘, 황산, 마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은 호기성 조건하에서, 예를들어, 액침 셰이킹(shaking) 배양 또는 통기-교반 배양에 의하여 행한다. 배양온도는 20∼40℃, 바람직하게는 25∼38℃이다. 상기 배지의 pH는 5∼9의 범위, 바람직하게는 중성부근으로 유지한다. 이 배양중, 이 배지의 pH는, 탄산칼슘, 무기 및 유기산, 알칼리용액, 암모니아, pH 버퍼등을 사용하여 조정한다. 통상, 2∼7일간 배양후에, L-이소로이신이 배양액중에 축적된다.

배양종료후에, 원심분리등에 의하여 배양액으로부터 균체 등의 침전물을 제거하고 그 상청액으로부터 이온교환처리, 농축, 염석등의 기술을 병용하여 L-이소로이신을 회수할 수 있다.

하기에서, 본 발명을 실시예들을 참조해서 구체적으로 설명한다.

실시예 1

변이주(1)의 획득

L-쓰레오닌 생성 E. coli H-8311주(FERM BP-3520)을, 30℃에서 30분간 N-메틸=N'-니트로-N-니트로소구아니딘(0.2mg/ml)으로 통상의 돌연변이 처리를 행하였다. 다음은, 1.5g/l의 6-디메틸아미노퓨린을 함유한 최소배지(0.5% 글루코스, 0.2% NH₄Cl, 0.2%, KH₂PO₄, 0.01%, MgSO₄·7H₂O, 20mg/l의 FeSO₄·7H₂O, 50mg/l의 DL-메치오닌, 2% 아가, pH 7.2)에 상기 셀들을 도포했다.

30℃에서 2∼6일간 배양한 후, 배지상에 생육된 큰 콜로니들을 6-디메틸아미노퓨린 내성으로서 취출 및 분리하여 H-8460을 얻었다.

이 균주를, 부다페스트 조약에 의거 1992. 2. 21 일본 공업기술원 미생물 공업기술연구소(Fermentation Research Institnte, Agency·f Industrial Science and Technology)에 수탁번호 FERM BP-3756으로 기탁했다.

이와는 별도로 L-이소로이신 생산균 E. coli H-8285(FERM BP-3629 : 일본 특원평 3-294420)를, 상기와 동일방법으로 돌연변이 처리했다.

다음, 상기 셀들을 1.5g/l 6-디메틸아미노퓨린 함유한 상기와 동일한 조성의 최소 배지에 도포했다.

30℃에서 2∼6일간 배양한 후, 배지상에 생육된 큰 콜로니들을 6-디메틸아미노퓨린-내성주로서 취출 및 분리하여, H-8461을 얻었다. 이 균주를 부다페스트 조약에 의거 1992. 2. 21, 일본 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-3757로 기탁했다.

그의 친주 H-8285는 디아미노피멜린산 요구성 때문에, H-8461을 얻기 위한 상기 최소배지에 200mg/l의 디아미노피멜린산을 가했다.

상기에서 얻은 변이주의, 6-디메틸아미노퓨린에 대한 내성의 정도를 그들의 각 모균주들과 비교했다.

그 내성의 정도는 생육정도로 환산하여 나타냈다. 즉, 각 균주를 완전배지(1% 트립톤, 0.5% 효모즙, 1% NaCl, 200mg/l 디아미노피멜린산, pH 7.5)중에서 24시간 동안 사면배양했다. 다음, 상기 셀들을 멸균수 중에 현탁하고, 얻어진 각 현탁액을, 표 1에 나타낸 양의 6-디메틸아미노류린을 함유한 최소배지(0.5% 글루코스, 0.2% NH₄Cl, 0.2%, KH₂PO₄, 0.01%, MgSO₄·7H₂O, 20mg/l FeSO₄·7H₂O, 50mg/l의 DL-메치오닌, 200mg/l의 디아미노피멜린산, 2%, 아가, pH 7.2)상에 도포하고, 30℃에서 72시간 동안 배양을 행하였다.

그 결과들을 표 1에 나타냈다.

[표 1]

+ : 잘 생육함, ± : 약간 생육함, - : 생육않음.

실시예 2

L-이소로이신 생성시험

실시예 1에서 얻어진 변이주들에 대하여, L-이소로이신 발효생성 실험했다.

E. coli H-8285, E. coli H-8461를 2% 글루코드, 1% 펩톤, 1% 효모즙, 0.25% NaCl을 함유한 배지에 0.02% 디아미노피멜린산을 가하여 제조한 종배지(pH 7.4)중에서 30℃에서 16시간 동안 각각 진탕 배양했다. 다음 얻어진 종 배양액 100ml를 하기와 같은 발효배지 1l를 함유한 2l 자아 퍼멘터에 접종하고, 30℃에서 800rpm, 통기속도 1l/분으로 교반하면서 배양했다.

이 배양중에, 배양액의 pH 조정 및 질소원의 공급은 암모니아수로 하고 pH를 6.5±0.2로 유지했다. 글루코스를 또한 적의 공급했다. 45시간 동안 배양했다.

액체 크로마토그래피에 의하여 정량 분석했다.

그 결과를 표 2에 나타냈다.

[표 2]

발효배지조성 : 4% 글루코스, 0.5%(NH₄)SO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.01% MgSO₄·7H₂O, 0.5% 콘스팁액, 0.35g/l DL-메치오닌, 0.9g/l 디아미노 피멜린산, pH 7.4

상기 H-8461 균주를 배양하여 얻은 L-이소로이신 함유 발양액 1l를 3000rpm으로 10분간 원심분리하여, 균체와 다른 불순물을 제거했다. 얻어진 상청액을, 강산성 양이온 교환수지 Diaion SKIB(H⁺형 : 미쯔비시가세이사제)를 충전한 컬럼을 통과시킴으로써, L-이소로이신을 컬럼에 흡착시켰다. 상기 컬럼을 수세한 후, 0.5N 암모니아수로 용출시켜 L-이소로이신 분획들을 수집했다.

수집된 분획들을 농축하고, 이 농축물에 에탄올을 가했다. 냉각하 혼합물을 보존함으로써, L-이소로이신 결정(순도 : 98% 이상) 22.0g을 얻었다.

Claims

에쉐리키아속에 속하고, 퓨린 유사물에 대하여 내성이 있고, L-이소로이신의 생성능이 있는 미생물을 배지중에서 배양하여 배양액 중에 L-이소로이신을 축적시키고, 그로부터 L-이소로이신을 회수하는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 E. coli 종에 속하는 것이 특징인 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 미생물이 E. coli FERM BP-3757인 것이 특징인 발효에 의한 L-이소로이신의 제조방법.
E. coli H-8461(FERM BP-3757)의 생물학적으로 순수한 배양물.