JP3510331B2 - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法Info
- Publication number
- JP3510331B2 JP3510331B2 JP14968094A JP14968094A JP3510331B2 JP 3510331 B2 JP3510331 B2 JP 3510331B2 JP 14968094 A JP14968094 A JP 14968094A JP 14968094 A JP14968094 A JP 14968094A JP 3510331 B2 JP3510331 B2 JP 3510331B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- amino acid
- escherichia coli
- producing
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるＬ−アミノ
酸の製造法に関する。Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよび
Ｌ−イソロイシンなどの脂肪族アミノ酸はヒトおよび動
物にとって栄養上重要な役割を有するアミノ酸であり、
医薬品、食品および飼料添加物などに用いられている。
酸の製造法に関する。Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよび
Ｌ−イソロイシンなどの脂肪族アミノ酸はヒトおよび動
物にとって栄養上重要な役割を有するアミノ酸であり、
医薬品、食品および飼料添加物などに用いられている。
【０００２】
【従来の技術】直接発酵によるＬ−アミノ酸の製造法に
おいて、例えばＬ−バリンの製造法としては、セラチア
属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属などの
微生物を用いる方法が知られている。エシェリヒア属の
微生物を用いるＬ−バリンの製造法としては、β−ヒド
ロキシイソロイシン、β−２−チエニルアラニンまたは
１，２，４−トリアゾールアラニンに耐性を有する微生
物を用いる方法（特開昭５６−５１９８９）などが知ら
れている。
おいて、例えばＬ−バリンの製造法としては、セラチア
属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属などの
微生物を用いる方法が知られている。エシェリヒア属の
微生物を用いるＬ−バリンの製造法としては、β−ヒド
ロキシイソロイシン、β−２−チエニルアラニンまたは
１，２，４−トリアゾールアラニンに耐性を有する微生
物を用いる方法（特開昭５６−５１９８９）などが知ら
れている。
【０００３】Ｌ−ロイシンの製造法としては、セラチア
属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属などの
微生物を用いる方法が知られている。エシェリヒア属の
微生物を用いるＬ−ロイシンの製造法としては、β−２
−チエニルアラニンに耐性を有する微生物を用いる方法
（特開昭５６−７２６９５）などが知られている。
属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属などの
微生物を用いる方法が知られている。エシェリヒア属の
微生物を用いるＬ−ロイシンの製造法としては、β−２
−チエニルアラニンに耐性を有する微生物を用いる方法
（特開昭５６−７２６９５）などが知られている。
【０００４】Ｌ−イソロイシンの製造法としては、セラ
チア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属な
どの微生物を用いる方法、エシェリヒア属に属し、イソ
ロイシンのアナログに耐性を有する微生物を用いる方法
（特開平５−１３０８８２）が知られている。
チア属、コリネバクテリウム属、アースロバクター属な
どの微生物を用いる方法、エシェリヒア属に属し、イソ
ロイシンのアナログに耐性を有する微生物を用いる方法
（特開平５−１３０８８２）が知られている。
【０００５】脂肪族アミノ酸の製造法として、２−ケト
酪酸に耐性を有する微生物を用いる方法はこれまで知ら
れていない。
酪酸に耐性を有する微生物を用いる方法はこれまで知ら
れていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医薬
品、食品および飼料添加物などとして有用なＬ−アミノ
酸の工業的に効率のよい製造方法を提供することにあ
る。
品、食品および飼料添加物などとして有用なＬ−アミノ
酸の工業的に効率のよい製造方法を提供することにあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、エシェ
リヒア属に属し、２−ケト酪酸に耐性を有し、かつＬ−
アミノ酸生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物よりＬ−ア
ミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造
法を提供することができる。以下に本発明を詳細に説明
する。
リヒア属に属し、２−ケト酪酸に耐性を有し、かつＬ−
アミノ酸生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物よりＬ−ア
ミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造
法を提供することができる。以下に本発明を詳細に説明
する。
【０００８】本発明のＬ−アミノ酸としては、脂肪族ア
ミノ酸、好適にはＬ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−
イソロイシンなどをあげることができる。本発明に用い
られる微生物としては、エシェリヒア属に属し、２−ケ
ト酪酸に耐性を有し、かつＬ−アミノ酸生産能を有して
いればいずれの微生物でも用いることができる。本発明
のＬ−アミノ酸生産菌は、エシェリヒア属のＬ−アミノ
酸生産能を有する微生物を通常の変異手段により変異さ
せ、２−ケト酪酸耐性を付与することにより取得でき
る。また野生株から誘導した２−ケト酪酸に耐性を有す
る変異株に、Ｌ−アミノ酸生産性を向上させる変異を付
与することによっても得ることができる。好適な例とし
てはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｈ−９０６
９、Ｈ−９０７１およびＨ−９０７３をあげることがで
きる。
ミノ酸、好適にはＬ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−
イソロイシンなどをあげることができる。本発明に用い
られる微生物としては、エシェリヒア属に属し、２−ケ
ト酪酸に耐性を有し、かつＬ−アミノ酸生産能を有して
いればいずれの微生物でも用いることができる。本発明
のＬ−アミノ酸生産菌は、エシェリヒア属のＬ−アミノ
酸生産能を有する微生物を通常の変異手段により変異さ
せ、２−ケト酪酸耐性を付与することにより取得でき
る。また野生株から誘導した２−ケト酪酸に耐性を有す
る変異株に、Ｌ−アミノ酸生産性を向上させる変異を付
与することによっても得ることができる。好適な例とし
てはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｈ−９０６
９、Ｈ−９０７１およびＨ−９０７３をあげることがで
きる。
【０００９】本発明の微生物によるＬ−アミノ酸の生産
は、通常の細菌培養法にて実施可能である。使用培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必
要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合
成培地または天然培地いずれも使用可能である。炭素源
としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖
蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水
分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、
リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノール
などのアルコールなどが用いられる。
は、通常の細菌培養法にて実施可能である。使用培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必
要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合
成培地または天然培地いずれも使用可能である。炭素源
としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖
蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水
分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、
リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノール
などのアルコールなどが用いられる。
【００１０】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウ
ム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウ
ム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種
発酵菌体およびその消化物などが用いられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられ
る。
【００１１】培養は、振盪培養または通気撹拌培養など
の好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃
で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨ
はｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持す
る。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有
機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などに
よって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中に
Ｌ−アミノ酸が生成蓄積する。
の好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃
で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨ
はｐＨ５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持す
る。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有
機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などに
よって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中に
Ｌ−アミノ酸が生成蓄積する。
【００１２】培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収する
ことができる。以下に本発明の実施例を示す。
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からＬ−アミノ酸を回収する
ことができる。以下に本発明の実施例を示す。
【００１３】
【実施例】実施例１
エシェリヒア・コリＨ−９０６８株（メチオニンおよび
ジアミノピメリン酸の要求性を有するエシェリヒア・コ
リＡＴＣＣ２１５３０株から自然復帰変異により誘導さ
れたメチオニンおよびジアミノピメリン酸の非要求株）
を常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンによる変異処理（０．５mg／ml、３３
℃、３０分間）を施した後、２−ケト酪酸２ナトリウム
塩（１０ｇ／ｌ）を含む最少寒天平板培地（グルコース
０．５％、塩化アンモニウム ０．２％、リン酸一カ
リウム ０．３％、リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸
マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ２０mg／
ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２）に塗布した。３３℃で２
〜５日間培養し、生育してくる大きなコロニーを２−ケ
ト酪酸耐性株として釣菌分離した。得られたコロニーか
ら約２０％の頻度で、親株よりＬ−バリン生産性の向上
した株が得られた。このような変異株の中から最もＬ−
バリン生産量が多い菌株をエシェリヒア・コリＨ−９０
６９株と命名した。Ｈ−９０６９株はブダペスト条約に
基づいて平成６年６月２１日付けでFERM BP-４７０５と
して工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。
ジアミノピメリン酸の要求性を有するエシェリヒア・コ
リＡＴＣＣ２１５３０株から自然復帰変異により誘導さ
れたメチオニンおよびジアミノピメリン酸の非要求株）
を常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンによる変異処理（０．５mg／ml、３３
℃、３０分間）を施した後、２−ケト酪酸２ナトリウム
塩（１０ｇ／ｌ）を含む最少寒天平板培地（グルコース
０．５％、塩化アンモニウム ０．２％、リン酸一カ
リウム ０．３％、リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸
マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ２０mg／
ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２）に塗布した。３３℃で２
〜５日間培養し、生育してくる大きなコロニーを２−ケ
ト酪酸耐性株として釣菌分離した。得られたコロニーか
ら約２０％の頻度で、親株よりＬ−バリン生産性の向上
した株が得られた。このような変異株の中から最もＬ−
バリン生産量が多い菌株をエシェリヒア・コリＨ−９０
６９株と命名した。Ｈ−９０６９株はブダペスト条約に
基づいて平成６年６月２１日付けでFERM BP-４７０５と
して工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。
【００１４】実施例２ ２−ケト酪酸に耐性を有するＬ
−ロイシン生産変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−９０６８株の代わりにエシェリ
ヒア・コリＨ−９０７０株（Ｈ−９０６８株から変異誘
導された４−アザロイシン耐性株）を用いる以外は実施
例１と同様に実施し、２−ケト酪酸２ナトリウム塩（１
０ｇ／ｌ）を含む最少寒天平板培地上に生育してくる大
きなコロニーを２−ケト酪酸耐性株として釣菌分離し
た。得られたコロニーから約２０％の頻度で、親株より
Ｌ−ロイシン生産性の向上した株が得られた。このよう
な変異株の中から最もＬ−ロイシン生産量の多い菌株を
エシェリヒア・コリＨ−９０７１株と命名した。親株と
して用いたＨ−９０７０株およびその２−ケト酪酸耐性
株Ｈ−９０７１株はブダペスト条約に基づいて平成６年
６月２１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に
各々、FERM BP-４７０４およびFERM BP-４７０３として
寄託されている。
−ロイシン生産変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−９０６８株の代わりにエシェリ
ヒア・コリＨ−９０７０株（Ｈ−９０６８株から変異誘
導された４−アザロイシン耐性株）を用いる以外は実施
例１と同様に実施し、２−ケト酪酸２ナトリウム塩（１
０ｇ／ｌ）を含む最少寒天平板培地上に生育してくる大
きなコロニーを２−ケト酪酸耐性株として釣菌分離し
た。得られたコロニーから約２０％の頻度で、親株より
Ｌ−ロイシン生産性の向上した株が得られた。このよう
な変異株の中から最もＬ−ロイシン生産量の多い菌株を
エシェリヒア・コリＨ−９０７１株と命名した。親株と
して用いたＨ−９０７０株およびその２−ケト酪酸耐性
株Ｈ−９０７１株はブダペスト条約に基づいて平成６年
６月２１日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に
各々、FERM BP-４７０４およびFERM BP-４７０３として
寄託されている。
【００１５】実施例３ ２−ケト酪酸に耐性を有するＬ
−イソロイシン生産変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−９０６８株の代わりにエシェリ
ヒア・コリＨ−８６８３株（FERM BP-４０５２：メチオ
ニン要求性、リファンピシン耐性、α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸耐性、チオイソロイシン耐性、アルギニ
ンハイドロキサメート耐性、DL−エチオニン耐性、Ｓ−
（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性およびＤ−
セリン耐性）を用い、２−ケト酪酸２ナトリウム塩添加
濃度を５ｇ／ｌに変更し、ＤＬ−メチオニン 0.1 ｇ／
ｌを最少寒天平板培地に添加する以外は実施例１と同様
に実施し、生育してくる大きなコロニーを２−ケト酪酸
耐性株として釣菌分離した。得られたコロニーから約５
％の頻度で、親株よりＬ−イソロイシン生産性の向上し
た株が得られた。このような変異株の中から最もＬ−イ
ソロイシン生産量の多い菌株をエシェリヒア・コリＨ−
９０７３株と命名した。Ｈ−９０７３株はブダペスト条
約に基づいて平成６年６月２１日付けでFERMBP-４７０
７として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。
−イソロイシン生産変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−９０６８株の代わりにエシェリ
ヒア・コリＨ−８６８３株（FERM BP-４０５２：メチオ
ニン要求性、リファンピシン耐性、α−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸耐性、チオイソロイシン耐性、アルギニ
ンハイドロキサメート耐性、DL−エチオニン耐性、Ｓ−
（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性およびＤ−
セリン耐性）を用い、２−ケト酪酸２ナトリウム塩添加
濃度を５ｇ／ｌに変更し、ＤＬ−メチオニン 0.1 ｇ／
ｌを最少寒天平板培地に添加する以外は実施例１と同様
に実施し、生育してくる大きなコロニーを２−ケト酪酸
耐性株として釣菌分離した。得られたコロニーから約５
％の頻度で、親株よりＬ−イソロイシン生産性の向上し
た株が得られた。このような変異株の中から最もＬ−イ
ソロイシン生産量の多い菌株をエシェリヒア・コリＨ−
９０７３株と命名した。Ｈ−９０７３株はブダペスト条
約に基づいて平成６年６月２１日付けでFERMBP-４７０
７として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され
ている。
【００１６】実施例４ ２−ケト酪酸に対する耐性度の
比較試験 実施例１〜３で取得された変異株Ｈ−９０６９、Ｈ−９
０７１およびＨ−９０７３の２−ケト酪酸に対する耐性
度をそれぞれの親株と比較した。第１表に示した量の２
−ケト酪酸２ナトリウム塩とＤＬ−メチオニン ０．１
g／l を含む最少寒天平板培地上に、天然培地（トリプ
トン １％、酵母エキス ０．５％、NaCl１％、ｐＨ７．
２）上で２４時間培養した菌体を滅菌水に懸濁して１×
１０3cells／cm2になるように塗布し、３３℃、７２時
間培養後の生育の度合いで耐性度を示した（第１表）。
Ｈ−９０６９株、Ｈ−９０７１株、Ｈ−９０７３株の２
−ケト酪酸に対する耐性度は、それぞれの親株よりも向
上していた。
比較試験 実施例１〜３で取得された変異株Ｈ−９０６９、Ｈ−９
０７１およびＨ−９０７３の２−ケト酪酸に対する耐性
度をそれぞれの親株と比較した。第１表に示した量の２
−ケト酪酸２ナトリウム塩とＤＬ−メチオニン ０．１
g／l を含む最少寒天平板培地上に、天然培地（トリプ
トン １％、酵母エキス ０．５％、NaCl１％、ｐＨ７．
２）上で２４時間培養した菌体を滅菌水に懸濁して１×
１０3cells／cm2になるように塗布し、３３℃、７２時
間培養後の生育の度合いで耐性度を示した（第１表）。
Ｈ−９０６９株、Ｈ−９０７１株、Ｈ−９０７３株の２
−ケト酪酸に対する耐性度は、それぞれの親株よりも向
上していた。
【００１７】
【表１】
【００１８】実施例５ Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよ
びＬ−イソロイシンの発酵生産試験 実施例１〜３で取得した各変異株を用いＬ−バリン、Ｌ
−ロイシンおよびＬ−イソロイシンの発酵生産試験を行
った。エシェリヒア・コリＨ−９０６８株、エシェリヒ
ア・コリＨ−９０６９株、エシェリヒア・コリＨ−８６
８３株、エシェリヒア・コリＨ−９０７０株、エシェリ
ヒア・コリＨ−９０７１株およびエシェリヒア・コリＨ
−９０７３株をそれぞれ２０mlの種培地（グルコース
２％、ペプトン １％、酵母エキス １％、ＮａＣｌ
０．２５％、ｐＨ７．０）を含む３００ml容三角フラス
コに接種して、３０℃、１６時間振盪培養した。得られ
た種培養液２mlを、それぞれ２５０mlの生産培地（グル
コース ６％、コーンスチープリカー ０．２％、硫酸ア
ンモニウム １．６％、リン酸一カリウム ０．１％、DL
−メチオニン １００mg／ｌ、リン酸マグネシウム ４
％、炭酸カルシウム１％、ｐＨ７．０）を含む２Ｌ容三
角フラスコに接種して、３０℃、７２時間振盪培養し
た。培養終了液中のＬ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
−イソロイシンの蓄積量は、高速液体クロマトグラフィ
ー法により定量した。
びＬ−イソロイシンの発酵生産試験 実施例１〜３で取得した各変異株を用いＬ−バリン、Ｌ
−ロイシンおよびＬ−イソロイシンの発酵生産試験を行
った。エシェリヒア・コリＨ−９０６８株、エシェリヒ
ア・コリＨ−９０６９株、エシェリヒア・コリＨ−８６
８３株、エシェリヒア・コリＨ−９０７０株、エシェリ
ヒア・コリＨ−９０７１株およびエシェリヒア・コリＨ
−９０７３株をそれぞれ２０mlの種培地（グルコース
２％、ペプトン １％、酵母エキス １％、ＮａＣｌ
０．２５％、ｐＨ７．０）を含む３００ml容三角フラス
コに接種して、３０℃、１６時間振盪培養した。得られ
た種培養液２mlを、それぞれ２５０mlの生産培地（グル
コース ６％、コーンスチープリカー ０．２％、硫酸ア
ンモニウム １．６％、リン酸一カリウム ０．１％、DL
−メチオニン １００mg／ｌ、リン酸マグネシウム ４
％、炭酸カルシウム１％、ｐＨ７．０）を含む２Ｌ容三
角フラスコに接種して、３０℃、７２時間振盪培養し
た。培養終了液中のＬ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
−イソロイシンの蓄積量は、高速液体クロマトグラフィ
ー法により定量した。
【００１９】結果を第２表に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】上記Ｌ−アミノ酸を含有する培養液をそれ
ぞれ１Ｌ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、菌
体その他の不純物を除去した。得られた上澄液をそれぞ
れ強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン（Ｈ+型）のカ
ラムに通し、Ｌ−アミノ酸を吸着させ、水洗後０．５規
定のアンモニア水で溶出して、Ｌ−アミノ酸画分を集め
た。集めた画分を濃縮し、エタノールを加えて冷却下で
保存することにより、Ｈ−９０６９株を用いて得た上記
Ｌ−バリン含有培養液１Ｌより純度９８％以上のＬ−バ
リン結晶を６．８ｇ、Ｈ−９０７１株を用いて得た上記
Ｌ−ロイシン含有培養液１Ｌから、純度９８％以上のＬ
−ロイシン結晶を３．８ｇ、Ｈ−９０７３株を用いて得
た上記Ｌ−イソロイシン含有培養液１Ｌから、純度９８
％以上のＬ−イソロイシン結晶を１２．６ｇ取得した。
ぞれ１Ｌ、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、菌
体その他の不純物を除去した。得られた上澄液をそれぞ
れ強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン（Ｈ+型）のカ
ラムに通し、Ｌ−アミノ酸を吸着させ、水洗後０．５規
定のアンモニア水で溶出して、Ｌ−アミノ酸画分を集め
た。集めた画分を濃縮し、エタノールを加えて冷却下で
保存することにより、Ｈ−９０６９株を用いて得た上記
Ｌ−バリン含有培養液１Ｌより純度９８％以上のＬ−バ
リン結晶を６．８ｇ、Ｈ−９０７１株を用いて得た上記
Ｌ−ロイシン含有培養液１Ｌから、純度９８％以上のＬ
−ロイシン結晶を３．８ｇ、Ｈ−９０７３株を用いて得
た上記Ｌ−イソロイシン含有培養液１Ｌから、純度９８
％以上のＬ−イソロイシン結晶を１２．６ｇ取得した。
【００２２】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−アミノ酸を工業的に
効率よく製造できる。
効率よく製造できる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 13/08
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 特開 平６−133787（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−10037（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−209593（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−28398（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−51989（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−31093（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−72695（ＪＰ，Ａ)
特開 昭53−69881（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−304969（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−130882（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−88991（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−94692（ＪＰ，Ａ)
特開 昭56−85289（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−111693（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−202695（ＪＰ，Ａ)
アミノ酸・核酸集談会，アミノ酸醗
酵，共立出版株式会社，1973年 ４月
５日，（下）各論，ｐ．178
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．,
1983，190（３），ｐ．452−８
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 1/00 - 41/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 エシェリヒア・コリに属し、５ｇ／ｌの
２−ケト酪酸に耐性を有し、かつＬ−バリン、Ｌ−ロイ
シンおよびＬ−イソロイシンから選ばれる脂肪族アミノ
酸生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該
脂肪族アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物より該脂肪族
アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−バリン、Ｌ−
ロイシンおよびＬ−イソロイシンから選ばれる脂肪族ア
ミノ酸の製造法。 - 【請求項２】 該微生物が、エシェリヒア・コリＨ−９
０６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０５）株、エシェリヒア
・コリＨ−９０７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０３）株、
またはエシェリヒア・コリＨ−９０７３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４７０７）株から選ばれる微生物である請求項１記
載の製造法。 - 【請求項３】 エシェリヒア・コリＨ−９０６９（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４７０５）株、エシェリヒア・コリＨ−９
０７１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０３）株、またはエシェ
リヒア・コリＨ−９０７３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０
７）株から選ばれる微生物。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14968094A JP3510331B2 (ja) | 1994-06-30 | 1994-06-30 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| CA002152227A CA2152227C (en) | 1994-06-30 | 1995-06-20 | Process for producing l-amino acid |
| US08/496,098 US5629180A (en) | 1994-06-30 | 1995-06-28 | Process for producing L-amino acid |
| AT95110186T ATE242332T1 (de) | 1994-06-30 | 1995-06-29 | Verfahren zur herstellung einer l-aminosäure |
| DE69530959T DE69530959T2 (de) | 1994-06-30 | 1995-06-29 | Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure |
| EP95110186A EP0694614B1 (en) | 1994-06-30 | 1995-06-29 | Process for producing L-amino acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14968094A JP3510331B2 (ja) | 1994-06-30 | 1994-06-30 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH089982A JPH089982A (ja) | 1996-01-16 |
| JP3510331B2 true JP3510331B2 (ja) | 2004-03-29 |
Family
ID=15480481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14968094A Expired - Lifetime JP3510331B2 (ja) | 1994-06-30 | 1994-06-30 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5629180A (ja) |
| EP (1) | EP0694614B1 (ja) |
| JP (1) | JP3510331B2 (ja) |
| AT (1) | ATE242332T1 (ja) |
| CA (1) | CA2152227C (ja) |
| DE (1) | DE69530959T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2152885C (en) * | 1994-06-30 | 2007-05-01 | Tetsuo Nakano | Process for producing l-leucine |
| RU2148642C1 (ru) * | 1998-12-23 | 2000-05-10 | ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты |
| KR100869687B1 (ko) * | 2000-03-24 | 2008-11-21 | 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 | 발효법에 의한 ｌ-아미노산의 제조방법 |
| US9187774B2 (en) * | 2010-02-26 | 2015-11-17 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for the production of L-homoalanine |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5651989A (en) * | 1979-10-01 | 1981-05-09 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-valine by fermentation method |
| JPS5672695A (en) * | 1979-11-15 | 1981-06-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-leucine |
| JPS5685289A (en) * | 1979-12-13 | 1981-07-11 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-valine by fermentation |
| JP2995816B2 (ja) * | 1990-07-30 | 1999-12-27 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ―リジンの製造法 |
| JP2876743B2 (ja) * | 1990-08-10 | 1999-03-31 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
| JP3036930B2 (ja) * | 1991-11-11 | 2000-04-24 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| JP3151073B2 (ja) * | 1992-02-25 | 2001-04-03 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
-
1994
- 1994-06-30 JP JP14968094A patent/JP3510331B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-20 CA CA002152227A patent/CA2152227C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-28 US US08/496,098 patent/US5629180A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 DE DE69530959T patent/DE69530959T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 EP EP95110186A patent/EP0694614B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 AT AT95110186T patent/ATE242332T1/de not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８３，１９０（３），ｐ．４５２−８ |
| アミノ酸・核酸集談会，アミノ酸醗酵，共立出版株式会社，１９７３年 ４月 ５日，（下）各論，ｐ．１７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0694614A1 (en) | 1996-01-31 |
| US5629180A (en) | 1997-05-13 |
| DE69530959T2 (de) | 2004-05-13 |
| CA2152227C (en) | 2008-02-19 |
| JPH089982A (ja) | 1996-01-16 |
| ATE242332T1 (de) | 2003-06-15 |
| DE69530959D1 (de) | 2003-07-10 |
| CA2152227A1 (en) | 1995-12-31 |
| EP0694614B1 (en) | 2003-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3151073B2 (ja) | 発酵法によるアミノ酸の製造法 | |
| JP3698758B2 (ja) | 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法 | |
| JP3036930B2 (ja) | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JP4245746B2 (ja) | 発酵法によるアミノ酸の製造法 | |
| JP3006926B2 (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| CA1303536C (en) | Process for producing l-threonine by fermentation | |
| JP3966583B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| JP3717970B2 (ja) | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JP3131311B2 (ja) | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 | |
| US5744331A (en) | Process for producing L-leucine | |
| JP3510331B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| JP2971089B2 (ja) | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 | |
| JP2877414B2 (ja) | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 | |
| JP4620231B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| KR960016870B1 (ko) | 발효에 의한 l-이소로이신의 제조방법 | |
| MXPA98005058A (en) | Process to produce l-amino acids by fermentac |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20031210 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20031225 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080109 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090109 Year of fee payment: 5 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090109 Year of fee payment: 5 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090109 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100109 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110109 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110109 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120109 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130109 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |