KR830001261B1 - 발효에 의한 l-글루타민 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

발효에 의한 L-글루타민 제조방법

본 발명은 발효법에 의한 L-글루타민을 제조할 때 배지중에 항산화제를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 그 목적은 배지중에 항산화제를 존재시키므로서 배지의 산화방지는 물론 균체의 L-글루타민 생산효소 활성을 높은 활성으로 유지시키고 L-글루타민의 세포막 투과성을 현저히 증대시켜 주므로써 배양액 내에 고수율의 L-글루타민을 축적 분리하는 방법에 관한 것이다.

L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기궤양 치료제, 알콜 중독성 치료제, 뇌기능개선제 등 의약용으로 크게 각광을 받고 있는 물질이다.

종래의 발효에 의한 L-글루타민 제조방법으로써는 일본특허공보 소 39-7391호에 글루타민산 생상균주를 과잉의 질소원이 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본특허공보 소 49-81587호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법이, 또는 일본특허 소 51-15688호에 항생물질을 배양액에 첨가하거나 항생물질과 계면활성제를 첨가시켜서 L-글루타민을 생산 축적시키는 방법 등이 알려져 있다.

그러나 질소과잉의 배지에서는 균주의 정상적인 생육이 저해를 를받으므로 이를 제거시키기 위해 다량의 무기염을 첨가시켜야 했으며, 또한 축적된 L-글루타민이 부산물인 푸로린이나 알지닌 합성계로 전환되어 많은 양의 L-글루타민의 축적이 어려웠다.

설파제 내성균주를 분리하여 배양할 경우에는 내성균주의 분리가 용이하지 않으며 내성균주를 분리하여 이용할 경우에도 배양액에 설파제의 첨가농도, 시간 등이 사용균주나 균주의 생육상태에 따라 상이하므로 공업적으로 매우 난점이 있었다.

또 항생물질이나 계면활성제 첨가시에도 사용균주의 성질이나 균주의 생육조건, 생육상태에 따라 약제의 처리기간, 농도등이 상이하여 공업적으로 어려운 문제점이 있는 방법이었다.

본 발명자들은 오랜기간 동안 L-글루타민의 발효에 의한 생산을 연구해 오던중 L-글루타민 발효시 배지 내에 항산화제를 첨가하므로서 다량의 L-글루타민이 축적됨을 알게되어 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 본 발명은 발효에 의하여 L-글루타민을 제조함에 있어서 배지중에 항산화제를 0.1-0.2mg/ml를 첨가하여 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 것이다. L-글루타민 생산균주는 호기성이므로 발효시 다량의 산소공급을 필요로 한다.

그러나 이 조건은 L-글루타민 발효배지에 산화를 일으켜 배지 내에 첨가된 여러가지 물질 즉, 균체의 여러가지 효소가 작용할 때 필요로 하는 비타민류 혹은 아미노산, 무기염류 등이 과잉의 산소공급에 의해서 산화가 일어나게 되어 균체의 생육 및 생리작용에 이용되지 못할뿐 아니라 균체 자체의 성분, 예를 들면 세포지질막의 주요구성 성분인 지질성질등의 변화가 일어나게 된다.

이러한 균체의 배지조성의 변화와 균체내 성분의 산화에 의해 균체의 노화가 가속적으로 일어나게 되고 이에 의해서 L-글루타민 생성효소계도 산화에 의한 실활이 일층 가속적으로 일어나게 된다.

본 발명자들은 오랜기간 동안 L-글루타민의 발효에 의한 직접생산을 연구해 오던중 다량의 산소공급하에서 균체의 배지조성의 산화는 물론 균체세포의 노화, L-글루타민 생합성계 효소활성의 실활등이 과잉의 산소공급에 의한 산화에 기인되는 것으로 판단하고 배양액 내에 항산화제를 첨가하여 배양해본 결과 배지성분의 산화방지는 물론 균체 구성성분의 산화를 방지하며, L-글루타민 생합성 효소계의 활성을 높은 활성으로 오랫동안 유지시킬 수 있었으며, 세포내에서 합성된 L-글루타민을 체외로 배출시키는 막투과성을 증가시키므로써 다량의 L-글루타민을 배양액 내에 축적하는 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 이용된 항산화제는 BHT(Butylated Hydroxytoluene), BHA(Butylated Hydroxyanisole), PG(Propyl gallate), EP(Ethyl protocatechuate), 씨미라이저 MDP(Similizer MDP : 日本住友化學), 안티젠 BBM(Antigen BBM : 日本住友化學), 라수미트(Lasumit : 日本第一工業製藥), TPL(Diauryl thiodipropionate), 아스콜빅산(Ascorbic acid), 비타민 E(Vitamin E)등이다.

상기한 항산화제에 의해서 나타난 효과에 대해서는 그 작용기작 전체가 완전히 알려져 있지 않으나 균체 세포에 대한 항산화제의 중요한 작용은 배지구성성분의 산화를 방지시키므로서 미량원소등 영양인자의 용이한 흡수로 균주의 생육이 촉진되며 균체 세포질막 및 세포벽의 주요한 구성성분인 인지질의 산화에 의한 변화를 방지하고 L-글루타민의 세포막 투과성을 증가시켜 배양액에 L-글루타민의 축적을 향상시키는 것으로 판단되었다.

항산화제를 사용할 경우 균주의 종류, 배지의 구성성분에 따라서 항산화제의 종류, 첨가농도, 첨가방법이 상이할 수 있으며, 그 효과도 다르게 나타날 수 있다.

본 발명자들이 실험한 항산화제의 종류, 첨가농도, 첨가방법 등은 다음표 1,2,3과 같다.

[표 1]

[항산화제 종류와 L-글루타민의 축적]

[표 2]

[항산화제 혼합첨가시 L-글루타민의 축적]

주 1) BHA : Butylated Hydroxyanisole BHT : Butylated Hydroxytoluene

TPL : Diauryl thiopropionate PG : Propyl gallate

[표 3]

[항산화제 첨가시간별 L-글루타민의 축적]

주 1) 사용균주, 배지, 배양방법 : 후기 실시예 1과 동일하게 행함.

표 1,2,3에서 알 수 있듯이 항산화제 BHA나 비타민 E를 각각 0.1-0.2mg/ml 첨가하는 것이 가장 좋은 효과를 나타내고 있으며, 첨가시간은 접종전 보다 접종 후 10시간에 첨가하는 것이 더 좋은 효과를 나타내고 있고, 또 표 2에서 보는 바와 같이 2 종류의 항산화제를 혼합하여 첨가해도 좋은 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.

본 발명에 사용된 배지조성으로는 탄소원으로 당밀, 전분가수 분해물, 포도당 등이 이용가능하며, 유기질소원으로써 대두가수 분해액, 육즙, 콘스립리커(C.S.L) 등이 이용가능하며, 무기질소원으로 유안, 염안, 요소, 암노니아수 등을 이용할 수 있으며, 무기염으로 황산철, 황산아연, 인산제1카리, 인산제2카리, 황산 마그네슘 등을 혼합한 배지면 이용가능하다.

배양방법은 27-30℃ 온도에서 pH를 5.5-7.5로 유지하면서 호기적 조건으로 배양한다.

배양종료 후 발효액내의 L-글루타민의 정제는 상명에 따라 균체를 분리하여 이온교환수지에 통액시킨 다음 에탄올을 처리 조결정을 얻었다.

이하 본 발명의 실시예를 통하여 상세한 설명을 한다.

[실시예 1]

사용균주 : 코리네박테리움 MWM-800208(KFCC-10033)

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30r/

, pH 7.0

발효배지 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 콘스립리커(C.S.L) 0.5%, 제1인산카리 0.2%, 제2인산카리 0.2%, 염화암모늄 2%, 황산마그네슘 0.05%, 황산철 20mg/

, 황산망간 20mg/

, 황산아연 10mg/

, 치아민염산염 3mg/

, 대두가수분해액 0.5%, 육즙 0.7%, 요소 0.5%, 탄산칼슘 5%(별살첨가), 유안 2%,

배양방법 : 상기의 배지조성을 갖는 종배지를 멸균된 진탕후 라스크에 50ml씩 분주하여 120℃에서 10분간 가압멸균한 다음 본 발명 사용균주 코리네박테리움 MWM-800208을 접종하여 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하여 종균배양액으로 한다.

발효배지를 20ml 사입 멸균한 500ml 진탕 후 라스크에 미리 준비한 종균 배양액 2ml를 접종하여 30℃에서 진탕배양한다.

접종직후 BHA를 0.1mg/ml 첨가하여 56시간 동안 배양한다.

L-글루타민생성량 : 배양완료액중의 L-글루타민축적량은 52.8mg/ml 이었다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일방법으로 배양을 행하며 접종직후에 아스콜빅산을 0.2mg/ml 첨가하여 배양했다. 배양완료액중의 L-글루타민 축적량은 50.9mg/ml 이었다.

[실시예 3]

실시예 1의 발효배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 2

를 사입하여 멸균한 5

소형 발효조에 종균배양액을 200ml 접종하고 650r.p.m, 2vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다.

접종직후에 0.1mg/ml의 BHA를 첨가하여 배양한다.

배양중 pH는 암노니아수로 6.0-7.0 사이로 조절한다.

배양완료액중의 L-글루타민은 58.9mg/ml이 축적되었다.

[실시예 4]

실시예 2의 발효배지 조성중 포도당 대신 폐당밀을 포도당으로 10% 되게 첨가한 발효배지 2

를 삽입하여 멸균한 5

소형발효조에 종균배양액 200ml를 접종하여 650rpm, 2vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다.

접종 5시간 후 0.1mg/ml의 BHA를 첨가한다.

배양중 pH는 암모니아수로 6.0-7.0으로 조절한다.

배양완료액중의 L-글루타민의 축적량은 54.7mg/ml 이었다.

[실시예 5]

실시예 2의 발효배지중 폐당밀 대신에 전분가수분해물을 10%되게 첨가하여 동일한 방법으로 배양한다.

배양완료액중의 L-글루타민 축적량은 56.3mg/ml 이었다.

[실시예 6]

실시예 1과 동일한 방법으로 배양하나 접종직후 BHA와 아스콜빅산을 각각 0.05mg/ml과 0.1mg/ml 혼합 첨가하여 배양한다.

배양완료액중의 L-글루타민 축적량은 51.2mg/ml 이었다.

[실시예 7]

실시예 1에 사용한 균주 코리네박테리움 MWM-800208 대신 코리네박테리움 MWM-791012를 배양한다. 그외는 실시예 1과 동일한 방법으로 행한다.

배양완료액 중의 L-글루타민축적량은 53.1mg/ml 였다.

Claims (1)

1. 발효에 의하여 L-글루타민을 제조함에 있어서, 배지중에 항산화제를 0.1-0.2mg/ml 첨가하여 다량의 L-글루타민을 축적시키는 것을 특징으로 하는 발효에 의한 L-글루타민의 제조방법.