KR830001445B1

KR830001445B1 - 미생물에 의한 l-글루타민의 제조방법

Info

Publication number: KR830001445B1
Application number: KR1019810003289A
Authority: KR
Inventors: 한상열; 이새배; 옥치영; 최종수
Original assignee: 미원주식회사; 홍연석
Priority date: 1981-09-03
Filing date: 1981-09-03
Publication date: 1983-07-29

Abstract

내용 없음.

Description

미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법

본 발명은 L-로이신 요구성을 갖고 알라닌에 의해서 생육이 촉진되는 L-글루타민 생성균주를 변이 처리하여 얻은 스트렙토마이신 내성균주를 배양하여 다량의 L-글루타민을 배지내에 축적하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의해 L-글루타민을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-글루타민은 아미노산의 일종으로써 영양제 및 소화기 궤양치료제, 알콜중독 치료제, 뇌기능 개선제등 의약용으로 크게 각광을 받고 있는 물질이다.

종래 미생물에 의한 L-글루타민 제조 방법으로서는 일본 특허공보 소 39-7391호에 L-글루타민산 생산균주를 과잉의 질소원이 함유되어 있는 배지에 배양하는 방법이, 일본특허 공보소 49-31587호에 설파제 내성균주를 분리 배양하는 방법이, 일본 특허공보소 53-12490호에 항생물질은 배양액내에 첨가하는 방법이, 일본 특허공보소 51-15688호에 항생물질과 계면활성제를 첨가시켜서 L-글루타민을 생상 축적시키는 방법등이 알려져 있다.

그러나 질소과잉의 배지에서는 균주의 정상적인 생육이 저해를 받으므로 이를 해제시키기 위해 다량의 무기염을 첨가시켜야 했으며, 또한 축적된 L-글루타민이 부산물인 푸로린이나 알지닌 합성계로 전환되어 많은 양의 L-글루타민의 축적이 어려웠다.

본 발명자들은 오랜 기간동안 L-글루타민의 미생물에 의한 생산을 연구 해오던중 생육에 푸로린과 알지닌을 동시에 요구하는 코리네박테리움 MWM-800208(KFCC-10033)를 분리하고 이를 다시 변이처리하여 얻은 스트렙토마이신(Streptomycin) 내성균주인 코리네 박테리움 MWM-810405(기탁번호 KFCC-10035, 기탁기관 : 한국종균협회, 기탁일자 : 1981. 8. 24)가 내성을 갖지 않는 친주에 비해 배양액내에 L-글루타민 생성능력이 현저히 우수한 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명의 새로운 균주의 분리방법은 코리네박테리움 MWM-800208(KFCC-10033)를 통상의 변이처리 즉, 자외선조사나 화학변이 유기제인 NTG (N-메칠-N'-메칠-N-니트로소구아니니딘), DES(에칠설폐이트)를 처리하여 일정농도 이상의 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 배양한후 이를 분석 다량의 L-글루타민을 축적시키는 균주를 분리 이용했다.

신균주의 분리용 배지의 조성은

포도당 10%, 염화암모늄 3%, 제1인산칼륨 1%, 제2인산칼륨 1%, 황산마그네슘 500mg/ι, 황산망간 10mg/ι, 치아민염산염 1mg/ι, 육즙0.5%, 푸로린 50mg/ι, 알지닌 50mg/ι, PH 7.2, 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가), 스트렙토마이신 0.1%이다.

분리배지에서의 배양방법은 분리배지 10mι를 50mι삼각후라스크에 분주하여 멸균한후 변이 처리한 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 진탕배양 하였으며, L-글루타민의 생성량을 페리퍼크로마토그라피 및 아미노산 자동분석기를 이용 분석하여 L-글루타민 축적량이 높은 것을 알았다.

이와같은 방법으로 선별 분리한 본 발명의 신균주의 균학적 성질을 친주인 코네박테리움 MWM-800208과 비교해본 결과 다음 표 1에 기재된 바와같이 친주에 비해 스트렙토마이신의 내성이 강한 것으로 나타났다.

[표 1]

스트렙토 마이신 첨가에 의한 균주의 생육 및 글루타민 축적량(mg/mι)

주 1) 생육도 : 배지(후기실시예 1참조)에서 48시간 진탕배양한 배양액을 희석 610nm에서 흡광도 측정함.

주 2) Gln축전량 : L-글루타민 축적량(mg/mι)

이와같은 성질은 갖는 본 발명의 새로운 균주 MWM-810405를 이용하여 L-글루타민을 발효할때 L-글루타민 축적량이 현저히 증가하는 것은 스트렙토마이신이 균체막이 영향을 주어 L-글루타민의 균체막 투과성을 증가시켜주기 때문인 것으로 판단된다.

L-글루타민 발효의 배양조건은 탄소 원으로써 포도당, 페당밀, 전분 가수분해물 등을 사용할 수 있으며, 질소 원으로써는 암모니아가스, 암모니아수, 염화암모늄, 유안, 요소, 인산암모늄 등을 이용할 수 있으며, 그 외 천연의 영양원과 무기금속염이 혼합된 배지면 이용 가능하다.

배양방법은 온도 30℃ 내외에서 PH를 5.5-7.5로 유지시키면서 호기적으로 2-3일간 배양한다.

스트랩토마이신 첨가시간은 다음 표 2에 나타난 바와 같이 흡광도값이 0.5-0.6일 때 첨가하는 것이 가장 적합했다.

[표 2]

스트렙토마이신 첨가시간과 L-글루타민 축적량(mg/mι)

주 1) 스트렙토마이신 농도 1mg/mι

주 2) 배지및 배양방법 : 후기 실시예 2참조.

주 3) 흡광도 : 배양액을 희석하여 610nm에서 흡광도를 측정함.

배양완료액내에 축적된 L-글루타민은 통상의 방법에 따라 이온 교환수지에 흡착, 분리시켜 용리액을 얻고 여기에 에탄올을 처리 정제하여 L-글루타민 조결정을 얻는다. 이하 실시예에서 상세히 설명한다.

[실시예 1]

사용 균주 : 코리네박테리움 MWM-810405(KFCC-10035)

종배지조성 : 포도당 5%, 펩톤 1%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 요소 0.3%, 비오틴 30r/ι, PH7.0

발효배지 조성 : 포도당 10%, 염화암모늄 3.5%, 유안 2%, 콘스팁리커(C.S.L) 0.5%, 육즙 0.7%, 제1인산카리 0.2%, 제2인산카리 0.2%, 황산마그네슘 300mg/ι 황산철 20mg/ι, 황산망간 20mg/ι, 황산아연 10mg/ι, 치아민염산염 1mg/ι, 요소 0.5%, 푸로틴 50mg/ι, 알지닌 50mg/ι, 스트렙토마이신 1mg/mι(별도첨가), 탄산칼슘 5%(별도 멸균첨가) PH7.2

배양방법 : 상기 종배지 50mι를 500mι진탕 후라스크에 분주하여 통상의 방법에 따라 가압 멸균한 후 스트렙토마이신 내성균주인 본 발명의 신균주 코리네박테리움 MWM-610405를 접종하여 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양한 것을 종균 배양액으로 한다.

상기 발효 배지 20mι를 500mι진탕 후라스크에 분주하여 120℃에서 10분간 가압 멸균하여 준비한 본 배지에 종균 배양액 2mι를 접종한후 30℃에서 72시간 도안 진탕배양 한다.

스트렙토 마이신 첨가는 배양액의 흡광도가 0.5-0.6일 때 첨가한다.

발효 종료후 배양액내의 L-글루타민 축적량은 60.4mg/mι였다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효 배지에서 탄산칼슘을 제외한 배지 2ι를 사입하여 멸균한 5ι소형 발효조에 미리 준비한 종균 배양액 200mι를 접종하고 600rpm, 1vvm의 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다.

스트렙토 마이신의 첨가는 배양액의 흡광도가 0.5-0.6일때 첨가한다.

PH조절은 암모니아수로 6.0-7.0으로 조절한다.

발효 완료 후 배양액내 L-글루타민 축적량은 61.4mg/mι였다. 발효완료액 1ι를 여과하여 균체를 제거한후 통상의 방법에 따라 이 온 교환수지에 흡착, 분리, 정제하여 L-글루타민 조결정 53.8g을 얻었다.

[실시예 3]

실시예 2의 발효 배지중 포도당 대신 폐당밀을 포도당으로 환산 10%되게 첨가한 발효배지 2ι를 5ι소형 발효조에 사입하여 120℃에서 15분간 멸균한후 냉각하여 미리 준비한 종균배양액 200mι를 접종한후 600rpm, 1vvm의 호기적인 조건으로 30℃에서 48시간 배양한다.

그외는 실시 예 2와 동일하게 행한다.

발효 종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 58.2mg/mι였다.

[실시예 4]

실시예 2와 동일한 발효배지중 포도당 대신 전분 가수 분해물 을 포도당으로 10%도게 첨가한 발효 배지를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 행하였다.

발효종료시 배양액내의 L-글루타민 축적량은 59.4mg/mι였다.

[실시예 5]

실시예 2와 동일한 방법으로 발효를 행할때 0.5mg/mι의 스트렙토마이신을 배양액의 흡광도가 0.5-0.6이 될때 처리하여 발효를 행한다. 그외는 실시예 2와 같은 방법으로 행한다. 발효종료액중의 L-글루타민 축적량은 58.7mg/mι였다.

Claims

미생물에 의한 L-글루타민을 제조함에 있어서, 푸로린과 알지닌 동시 요구성을 가지며 스트렙토마이신 내성을 갖는 코리네박테리움 MWM-810405(KFCC-10035)를 당질을 주원료로 하는 영양배지에 호기적으로 배양할때 스트렙토마이신 0.5-1mg/mι을 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 L-글루타민의 제조방법.