KR950005133B1 - L-발린의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

L-발린의 제조방법
본 발명은 L-발린(valine)의 제조방법에 관한 것이다. L-발린은, 주로 영양수액(infusion) 및 총합아미노산 제제 등의 의약용으로 사용되는 아미노산이며, 또한 조미료, 사료로서도 사용된다.
종래, 코리네박테륨(Corynebacterium)속 또는 브레비박테륨(Brevibacterium)속 등에 속하는 코리네형 글루타민산 생산균을 사용하는 L-발린의 제조법으로서는, D,L-아미노부티르산에 내성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특개소 63-160592호 공보), 치아졸알라닌에 내성을 갖고 로이신, 이소로이신 또는 쓰레오닌요구성인 미생물을 사용하는 방법(동 특공소 52-116호 공보), 아미노에틸시스테인에 내성을 갖는 미생물을 사용하는 방법(일본 특공소 58-2678호 공보) 등이 알려져 있다.
본 발명은, 코리네박테륨 또는 브레비박테륨속에 속하고, a) L-발린 생산능력이 있고, b) 초산이 유일탄소원인 배지에서 L-발린에 대해 내성을 갖으며, c) 글루코스를 유일탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 아나로그에 대해 감수성을 나타내는 미생물을 배양하고, 배양물중에 L-발린을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 L-발린을 회수함을 특징으로 하는 L-발린 제조방법을 제공한다.
하기에, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 미생물은, 코리네박테륨속 또는 브레비박테륨속에 속하는, 코리네형 글루탐산 생산균이며, L-발린 생산능려과, 초산이 유일 탄소원인 배지에서 L-발린에 대한 내성 및 글루코스가 유일탄소원인 배지에서 피루브산 유사물(analog)에 대한 감수성을 나타낸다. 이러한 특성을 갖는 미생물들은 하기의 코리네형 글루탐산 생산균을 들 수 있다:
코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13032
코리네박테륨 아세토애시도필럼 ATCC 13870
코리네박테륨 헤르클리스 ATCC 13868
코리네박테륨 릴리움 ATCC 15990
브레비박테륨 플래범 ATCC 14067
브레비박테륨 락토퍼멘텀 ATCC 13869
브레비박테륨 디바리캐텀 ATCC 14020
브레비박테륨 치오게니탈리스 ATCC 19240
상기 균주들은, 아세트산을 유일 탄소원으로 하는 배지에서, L-발린에 의해 생육이 저해된다.
본 발명에서 사용되는 미생물은, 초산을 유일탄소원으로 하여 모균주가 감수성을 나타내는 농도의 L-발린을 함유하는 배지에서 L-발린 비감수성인 변이주를 선택한 후, 이들 변이주 중에서, 글리코스를 유일탄소원으로 하여 모균주가 감수성을 나타내지 않는 농도의 피루브산 유사물에 감수성을 나타내는 변이주를 선택함으로써 취득할 수 있다.
또는, 상기 본 발명에 사용되는 미생물은, 글루코스를 유일탄소원으로 하는 배지에서 모균주가 감수성을 나타내지 않는 농도의 피루브산 유사물에 가수성을 나타내는 변이주를 선택한 후 이들 변이주중에서, 초산을 유일의 탄소원으로 하고 모균주가 감수성을 나타내는 농도의 L-발린을 함유하는 배지에서 L-발린 비감수성으로 된 변이주를 선택함으로써 취득할 수 있다.
본 발명을 하기에서 구체적으로 설명한다.
먼저, 자외선조사 또는 N-메틸-N'-니트로 -N-니트로 소구아니딘(하기에서 "NTG"라고 약칭함), 아질산 등의 화학처리 등, 통상 사용되는 변이처리방법에 의해서 처리하여 모균주를 돌연변이시킨 후, 초산을 유일한 탄소원으로 하고 L-발린을 함유하는 배지상에서 생육시켜서 큰 콜로니를 채취하거나, 또는, 글루코스를 유일 탄소원으로 하고 피루브산 유사물을 함유하는 배지에서 작은 콜로니를 채취하고, 또한 상기 특성 중 다른 형질을 갖는 변이주를 선택함으로써 본 발명의 미생물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 피루브산 유사물로는, β-후루오르피루브산, β-브로모피루브산, β-클로로피루부산, β-시클로헥실피루브산, β-머캡토피루브산, β-이미다졸린 피루브산, 트리메틸피루브산, β-히드록시 피루브산 α-케토부티르산 등이 있다.
본 발명의 미생물은, 초산을 유일탄소원으로 하는 배지에서 L-발린 내성을 나타내고, 또한, 글루코스를 유일탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 유사물에 감수성을 갖음을 특징으로 하나, 이러한 형질외에, 종래, 미생물에 L-발린 생산성을 부여함이 알려져 있는 아미노산의 영양요구성, 그 유사물에 대한 내성 등의 형질을 함께 갖어도 좋다.
이러한 다중 변이주는 각 변이를 순차로 부여함으로써, 또는 각 변이를 별개로 갖는 균주간의 프로토플라스트(protoplast) 융합을 통하여 교잡해서 취득할 수 있다.
본 발명에 의한 미생물에 의한 L-발린의 생산은, 통산의 배양법에 의하여 달성할 수 있다.
사용되는 배양배지로는, 적당량의 탄소원, 질소원, 무기물 및 선택된 균주가 요구하는 미량의 영양소를 함유하는 것이면, 합성배지 또는 천연배지 어느것이라도 사용할 수 있다.
탄소원으로서는, 글루코스, 글리세롤, 후락토스(fructose), 수크로스, 말토스, 만노스, 전분, 전분 가수 분해물, 당밀 등의 탄수화물; 폴리알콜; 피루브산, 푸마르산, 유산, 초산 등의 각종 유기산을 사용할 수 있다.
또한, 미생물의 자화성에 따라서, 탄화수소, 알콜류 등도 사용된다.
질소원으로서는, 암모니아 또는 염화 암모늄, 황산암모늄, 탄소 암모늄, 초산 암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄 염류 또는 요소 및 기타 질소함유물질 및 펩톤, NZ-아민, 육즙, 효모추출물, 콘스팁(corn steep)액, 카세인 가수분해물, 피쉬밀(fish mill) 또는 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.
상기 무기물로서는, 인산 제1수소칼륨, 인산 제2수소칼륨, 황산 암모늄, 염화 암모늄 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 황산 제1철, 황산망간 및 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은, 진탕배양 또는 통기배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는, 일반적으로 20~40℃가 좋다. 배양중 배지의 pH는 중성부근에 유지하는 것이 바람직하다. 배양기간은 통상 1~5일간이다.
배양종료후, 알려져 있는 방법에 의하여, 배양액으로부터 L-발린을 채취한다. 예를 들어, 배양액으로부터 균체를 제거하고, 잔존 상청액을 농축하고, 활성탄처리 및/또는 이온교환수지처리후에 정석한다.
본 발명을 실시예들을 참조하여 더욱 상세히 설명한다.
(실시예 1)
코리네박테륨, 글라타미쿰, ATCC 13032를 완전배지(분말 뷔욘(bouillon) 20g, 효모추출물 5g을 물 1ℓ에 용해하고, oH 7.2로 조정한 배지)에서 30℃, 16시간 배양한 균체를 수집하고, 0.05M 트리스-말레인산 완충액(pH 6.0)으로 세정 후, 균체의 농도가 약 109세포/mℓ로 되도록 상기 완충액에 현탁하고, 여기에 NTG를 최종농도가 500㎎/ℓ로 되도록 가하고, 30℃, 20분간 유지하여 변이처리를 행하였다. 이러한 변이처리균체를 상기와 동일한 완충액으로 세정 후, 이 균체를 표1에 나타낸 조성의 최소배지에 L-발린을 0.5g/ℓ 함유하는 한천배지에 도포했다.
[표 1]
30℃에서 2~4일간 배양한 후, 큰 콜로니들을 채취했다. 이 콜로니들 중에서, 표1에서 초산나트륨대신 5g/ℓ 글루코스를 탄소원으로 함유하고, β-후루오르피루브산(이하, "βFP"라고 한다.) 6㎎/ℓ을 함유하는 최소배지에서 생육이 느린 균주를 선택했다.
상기 변이주 중에서, L-발린 생산성이 높은 균주로서 코리네박테륨 글루타미쿰 AV1을 선택했다.
상기 코리네박테륨 글루타미쿰 AV1은, 1990년 7월 12일부로 일본 공업기술원의 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-3006으로 기탁돼 있다.
표2는, 모균주 ATCC 13032와 변이주 AV1의 L-발린에 대한 감수성 및 βFP에 대한 감수성을 나타낸다. L-발린 감수성은, 0.5G/ℓ의 L-발린을 함유하는, 표1의 최소한천배지 및 초산나트륨 대신에 글루코스 5g/ℓ를 탄수원으로 한 최소한천배지, 또한, βFP감수성은, 6㎎/ℓ의 βFP를 함유하는 글루코스 5g/ℓ를 탄소원으로 한 최소한천배지에 상기 두 균주를 도포하고, 30℃에서 2일간 배양후, 콜로니 크기에 의하여, L-발린 또는 βFP에 대한 감수성을 평가했다.
(실시예 2)
브레비박테륨 락토퍼멘텀 ATCC 13869를 완전배지에서 30℃, 16시간 배양한 균체를 수집하고, 0.5M 트릭스-말레인산 완충액(pH 6.0)으로 세정 후, 균체의 농도가 약 109세포/mℓ로 되도록 상기 완충액에 현탁하고, 여기에 NTG를 최종농도가 500㎎/ℓ로 되도록 가하고, 30℃, 20분간 유지했다.
동일한 완충액으로 세정후, 이 균체를 L-발린 0.5g/ℓ를 함유하는 표1에 나타낸 조성의 한천배지에 도포했다.
30℃에서 2~4일간 배양한 후, 큰 콜로니를 채취했다. 이중에서, 초산나트륨 대신 글루코스 5g/ℓ를 탄소원으로 함유하고, 6㎎/ℓ βFP를 함유하는 배지에서 생육이 느린 콜로니들을 선택했다.
L-발린 생산성이 높은 균주로서 브레비박테륨 락토퍼멘텀 AV11을 선택했다.
브레비박테륨 락토퍼멘텀 AV11은, 1990년 7월 12일부로, 일본 공업기술원의 미생물공업 기술연구소에 수탁번호 FERM BP-3007으로 기탁돼 있다.
표2는, 모균주 ATCC 13869와, 상기 변이주 AV11의 L-발린과 βFP에 대한 감수성을 나타낸다. L-발린과 βFP에 대한 감수성은 실시예 1에서와 마찬가지로 평가했다.
[표 2]
(실시예 3)
실시예 1 및 실시예 2에서 취득한 코리네박테륨 글루타미쿰 AV1(FERM BP-3006), 브레비박테륨 락토퍼멘텀 AV11(FERM BP-3007) 및 이들의 모균주를, 3mℓ의 종배지(글루코스 1%, 분말뷔욘 2%, 효모 추출물 0.5% pH 7.2)를 함유하는 시험관에 접종하고, 30℃에서 24시간 진탕배양했다. 이 종배양액 1mℓ를, 하기의 발효배지 20mℓ를 함유하는 300mℓ 3각 플라스크에 접종하여, 48시간 30℃에서 진탕 배양했다. 배양후, 배양액의 여액을 페이퍼 크로마토그래피로 처리하여, 닌히드린 발색후, 비색정량하여 L-발린의 생성량을 측정했다.
그 결과를 표3에 나타냈다.
상기 발효배지의 조성은 다음과 같다.
글루코스 8%, KH2PO40.1%, 황산 마그네슘 0.1%, 황산암모늄 5%, 요소 0.2%, 티아민 염산염 120㎍/ℓ, 비오틴 180㎍/ℓ, FeSO4.7H2O 12㎎/ℓ, MnSO4.4~6H2O 12㎎/ℓ, 콘스팁 액 1%, 탄산칼슘2%, pH=7.2.
[표 3]

Claims (5)

  1. 코리네박테륨속 또는 브레비박테륨속에 속하고, a) L-발린 생산능력이 있고, b) 초산을 유일 탄소원으로 하는 배지에서 L-발린에 대한 내성이 있으며, c) 글루코스를 유일탄소원으로 하는 배지에서 피루브산에 대해 감수성을 나타내는 미생물을 배지중에서 배양물중에 L-발린을 생성축적될 때까지 배양하고, 이 배양물로부터 L-발린을 회수함을 특징으로 하는 L-발린 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물이, 코리네박테륨 글타미쿰 또는 브레비 박테륨 락토퍼멘텀중에 속하는 것이 특징인 L-발린 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 미생물이, 코리네박테륨 글루타미쿰 AV1(FERM BP-3006) 또는 브레비박테륨 락토퍼멘템 AV11(FERM BP-3007)인 것이 특징인 L-발린 제조방법.
  4. 코린박테륨 글루타미쿰 AV1(FERM BP-3006)의 생물학적으로 순수한 배양물.
  5. 브레비박테륨 락토퍼멘템 AV11(FERM BP-3007)의 생물학적으로 순수한 배양물.
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