MXPA02001174A - Ingenieria metabolica de la produccion de aminoacidos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a la produccion fermentativa de aminoacidos, proporcionado microorganismos, metodos y procedimientos utiles para los mismos. Los microorganismos de la invencion son capaces de convertir la glucosa a aminoacidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. La invencion proporciona microorganismos que son hechos auxotroficos o braditroficos para la sintesis de uno o mas aminoacidos de cadena ramificada mediante la mutagenesis y se seleccionan por su capacidad para exhibir porcentajes de produccion mas altos del aminoacido deseado que la cepa de origen. Los microorganismos preferidos son Corynebacterium, Brevibacterium o Escherichia coli que producen L-lisina. La mutagenesis se realiza mediante tecnicas clasicas a traves de la metodologia del ADNr. Los metodos de la invencion estan disenados para incrementar la produccion de un aminoacido mediante la mutagenesis de una cepa de origen, la seleccion de celulas auxotroficas o braditroficas para la sintesis de uno o mas aminoacidos de cadena ramificada y la seleccion de auxotrofos o braditrofos para los aminoacidos de cadena ramificada que exhiben un porcentaje de produccion mas alto a partir de dextrosa del aminoacido deseado que la cepa de origen. Los procedimientos de la invencion estan disenados para la produccion de un aminoacido que comprende el cultivo en un medio de un microorganismo obtenido mediante la mutagenesis de una cepa de origen y la seleccion de variantes que son capaces de convertir la glucosa a aminoacidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen.

Description

INGENIERÍA ETABOLICA DE LA PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La invención se refiere a las áreas de la genética microbiana y la tecnología del ADN recombinante. Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción fermentativa de aminoácidos. La invención proporciona microorganismos útiles para la producción de aminoácidos, métodos para incrementar la producción de aminoácidos y procedimientos para la producción de aminoácidos .

Técnica Relacionada La producción de aminoácidos a través de la fermentación hace posible la producción poco costosa a partir de fuentes de carbono baratas, tales como melaza, ácido acético y etanol. Después de reconocer que los microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um fueron útiles para la producción industrial de aminoácidos (S. Kinoshita y colaboradores , Proceedings of the In terna tional Symposium on Enzyme Chemistry 2:464-468 REF : 135679 (1957)), la producción comercial de aminoácidos mediante procedimientos fermentativos se hizo más posible con el aislamiento de cepas mutantes. Los microorganismos empleados en los procedimientos microbianos para la producción de aminoácidos se pueden dividir en cuatro clases: cepa de tipo no cultivado, mutante auxotrófica, mutante reguladora y mutante reguladora auxotrófica (K. Nakayama y colaboradores, en NUTRITIONAL IMPROVEMENT OF FOOD AND FEED PROTEINS, M. Friedman, ed., (1978), páginas 649-661). La estereoespecificidad de los aminoácidos producidos mediante la fermentación hace al procedimiento ventajoso comparado con los procedimientos sintéticos; los aminoácidos producidos mediante los procedimientos microbianos son generalmente de la forma L. La L-lisina es un ejemplo de un aminoácido producido mediante la fermentación industrial. La producción comercial de este aminoácido esencial se hace principalmente utilizando los microorganismos gram-positivos que pertenecen al género Corynebacteri um glutami cum , Brevibacteri um flavum y Brevibacteri um la ctof ermen tum (Kleemann, A. y colaboradores , Amino Acids, en ULLMANN'S ENCICLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, vol. A2, páginas 57-97 einham: VCH-Verlagsgesellschaft (1985), acumulativamente, estos tres microorganismos dan cuenta actualmente de aproximadamente 250,000 toneladas de L-lisina producida al año.

Dada la importancia económica de la producción de L-lisina mediante los procedimientos fermentativos, sería benéfico incrementar la cantidad total producida mientras que se disminuyen simultáneamente los costos de producción. Para este fin, la ruta bioquímica para la síntesis de L-lisina ha sido investigada intensivamente en la bacteria Corynebacteri um (revisada recientemente por Sahm y colaboradores, Ann . N. Y. Acad. Sci . 782 : 25-39 (1996)). La entrada en la ruta de la lisina comienza con L-aspartato (ver la figura 1) , el cual es producido en sí mediante la transaminación de oxaloacetato . Una característica especial de la bacteria C. glutamicum es su capacidad para convertir el producto intermedio de lisina, 2, 6-dicarboxilato de piperideina a diaminopimelato mediante dos rutas diferentes, es decir mediante reacciones que involucran productos intermedios succinilados o mediante la reacción simple de diaminopimelato deshidrogenasa. Por lo general, el flujo de carbono en la ruta es regulado en dos puntos: primero, a través de la inhibición de retroalimentación de la aspartato cinasa por los niveles de tanto L-treonina como L-lisina; y segundo, a través del control de nivel de la dihidrodipicolinato sintasa. Por lo tanto, la producción incrementada de L-lisina se puede obtener en los microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium mediante la desregulación y el incremento de la actividad de estas dos enzimas. Además de la ruta bioquímica que conduce a la síntesis de L-lisina, la evidencia reciente indica que la consideración del transporte de lisina fuera de las células en los medios es otra condición a ser considerada en el desarrollo de las cepas que sobreproducen la lisina de C. gl utamicum . Los estudios de Krámer y colegas indican que el transporte pasivo fuera de la célula, como resultado de una membrana permeable, no es la única explicación para el efluvio de lisina; sus datos sugieren un portador específico con las siguientes propiedades: (1) el transportador posee un valor Km preferiblemente alto para la lisina (20 mM) ; (2) el transportador es un sistema symport OH" (los sistemas de captación son sistemas antiport H+) ; y (3) el transportador está cargado positivamente, y la membrana estimula el potencial de la secreción (S. Bróer y R. Kramer, Eur, J. Biochem , 202 : 137-143 (1991). Varios procedimientos de fermentación que utilizan diversas cepas aisladas por sus propiedades auxotróficas o de resistencia son conocidos en la técnica para la producción de L-lisina: la patente norteamericana No. 2,979,439 describe mutantes que requieren homoserina (o metionina y treonina) ; la patente norteamericana No. 3,700,557 describe mutantes que tienen un requerimiento nutricional de treonina, metionina, arginina, histidina, leucina, isoleucina, fenilalanina, cistina, o cisteína; la patente norteamericana No. 3,707,441 describe un mutante que tiene resistencia a un análogo de lisina; la patente norteamericana No. 3,687,810 describe un mutante que tiene tanto capacidad para producir L-lisina como resistencia a la bacitracina, penicilina G o polimixina; la patente norteamericana No. 3,708,395 describe mutantes que tienen un requerimiento nutricional de homoserina, treonina, treonina y metionina, leucina, isoleucina o mezclas de las mismas y resistencia a la lisina, treonina, isoleucina o análogos de las mismas; la patente norteamericana No. 3,825,471 describe un mutante que tiene resistencia a un análogo de lisina; la patente norteamericana No. 4,169,763 describe cepas imitantes de Corynebacteri um que producen L-lisina y son resistentes a al menos uno de análogos aspárticos y fármacos sulfa; la patente norteamericana No. 5,846,790 describe una cepa mutante capaz de producir ácido L-glutámico y L-lisina en la ausencia de cualquier agente de acción sorprendente de biotina; y la patente norteamericana No. 5,650,304 describe una cepa que pertenece al género Coryneba cteri um o Brevibacterium para la producción de L-lisina que es resistente a 4-N- (D-alanil) -2, -diamino-2, 4-didesoxi-L-arabinosa 2, -didesoxi-L-arabinosa o un derivado de las mismas.

Los desarrollos más recientes en el área de la producción fermentativa de L-lisina en microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium involucra el uso de técnicas de biología molecular para aumentar la producción de lisina. Los siguientes ejemplos se proporcionan como ejemplares de la técnica: las solicitudes de patente norteamericanas Nos. 4,560,654 y 5,236,831 describen una cepa mutante que produce L-lisina obtenida mediante la transformación de un microorganismo hospedero de Coryneba cteri um o Breviba cteri um el cual es sensible a la S- (2-aminoetil) -cisteína con una molécula de ADN recombinante en donde el fragmento de ADN que confiere tanto resistencia a la S- (2-aminoetil) -cisteína como la capacidad para producir lisina es insertado en un ADN del vector; la solicitud de patente norteamericana No. 5,766,925 describe una cepa mutante producida mediante la integración de un gen que codifica la aspartocinasa, que se origina de bacterias corineformes, con una inhibición de la retroalimentación desensibilizada por la L-lisina y L-treonina, en un ADN cromosómico de una bacteria corineforme, que contiene homoserina deshidrogenasa del tipo permeable o una bacteria corineforme deficiente en el gel de homoserina deshidrogenasa . Además de la L-lisina, los microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium y los organismos relacionados son útiles para la producción de otros aminoácidos, por ejemplo los aminoácidos de cadena ramificada L-leucina, L-isoleucina y L-valina. Las rutas bioquímicas que conducen a la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada también están bien estudiadas. El flujo de carbono en la ruta de aspartato puede ser encausado en la producción de L-lisina o L-treonina, que se puede utilizar para la producción de L-isoleucina (Figura IB) . La L-isoleucina es producida a partir de L-treonina en cinco reacciones; las enzimas que catalizan estas reacciones incluyen: (1) treonina dehidratasa; (2) acetohidroxiácido sintasa; (3) isomerorreductasa; (4) dihidroxiácido dehidratasa; y (5) transaminasa B. En esta ruta única solo la enzima treonina dehidratasa es para la síntesis de isoleucina; las otras cuatro enzimas también son utilizadas en la producción de los otros aminoácidos de cadena ramificada, valina y leucina. El flujo de carbono de la treonina a la isoleucina es controlado por la treonina dehidratasa y la acetohidroxiácido sintasa (AHAS) . Con la clonación de los genes que codifican las enzimas de la ruta de isoleucina ( ilvA, ilvB, ilvC, ilvD e ilvE) en los microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um (C. Cordes y colaboradores , Gene 112: 113-116 (1992); B. Móckel y colaboradores , J. Bacteriology 174: 8065-8072 (1992); y C. Keilhauer y colaboradores , J. Bacteriology 175: 5595-5603 (1993)), las técnicas del ADN recombinante se pueden aplicar para generar nuevas cepas. Han sido descritos mejoramientos en la producción de los aminoácidos L-isoleucina, L-leucina y L-valina al incrementar la actividad de las enzimas en la ruta biosintética de aminoácidos de cadena ramificada. Adicionalmente, han sido descritos mejoramientos en la producción de aminoácidos de cadena ramificada al mejorar la actividad de la acetohidroxiácido sintasa (AHAS) codificada por el operón ilvBN. (ver generalmente H. Sahm y colaboradores , Ann . N. Y. Acad Sci . 782:25-39 (1996). Los procedimientos ejemplares para la producción de aminoácidos de cadena ramificada incluyen los siguientes: la patente norteamericana No. 5,188,948 describe un procedimiento de fermentación para producir L-valina utilizando un microorganismo que es resistente a un policétido; la patente norteamericana No. 5,521,074 describe un procedimiento para producir L-valina utilizando un microorganismo el cual pertenece al género Corynebacteri um o Breviba cteri um, el cual exhibe a) capacidad para producir L-valina, b) resistencia a la L-valina en un medio que contiene ácido acético y una sola fuente de carbono, y c) sensibilidad a un análogo de ácido pirúvico en un medio que contiene glucosa como la única fuente de carbono; la patente norteamericana No. 4,601,983 describe una secuencia genética que codifica la producción de una proteína que tiene la actividad de homoserina deshidrogenasa capaz de la réplica en bacterias corineformes y utilizada para producir L-treonina y L-isoleucina; la patente norteamericana No. 4,442,208 describe un procedimiento de fermentación para la producción de L-isoleucina utilizando una cepa de Brevibacteri um o Coryneba cteri um obtenida mediante las técnicas del ADN recombinante que es resistente al ácido a-amino-ß-hidroxi valérico; la patente norteamericana No. 4,656,135 describe un procedimiento para producir L-isoleucina, el cual comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Breviba cteri um o el género Corynebacteri um el cual tiene una resistencia a la metillisina o resistencia al ácido a-cetomalónico y el cual es capaz de producir L-isoleucina en un medio líquido, y obtener la L-isoleucina acumulada del medio; la patente norteamericana No. 5,118,619 describe un método para la producción fermentativa de L-isoleucina a partir de D, L- -hidroxibutirato por medio de mutantes que utilizan D-lactato; la patente norteamericana No. 5,763,231 describe un procedimiento para producir L-leucina, el cual incluye incubar una cepa del género Coryneba cteri um , Escheri chia , Brevibacteri um o Microbacterium en un medio de cultivo y hacer reaccionar las células resultantes con sacáridos y ácido acético o su sal para formar y acumular L-leucina en la solución de reacción; y la patente norteamericana No. 3,970,519 describe cepas que resisten la inhibición de la retroalimentación por la leucina y sus análogos y requieren al menos uno de isoleucina, treonina o metionina como un nutrimento para el crecimiento para producir L-leucina. No se han descrito mejoramientos en la producción de aminoácidos al disminuir la producción de valina. No se han descrito mejoramientos en la producción de aminoácidos al disminuir la actividad de la AHAS .

Breve descripción de la Invención Es un objetivo de la presente invención proporcionar microorganismos que sean capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. La eficacia de la conversión puede ser cuantificada mediante la fórmula : [ (g de aminoácido producido/g de dextrosa consumida) *100] =% de Producción y puede ser expresada como la producción a partir de dextrosa . En una modalidad, la invención proporciona microorganismos que son hechos auxotróficos para la síntesis de uno o más aminoácidos de cadena ramificada mediante la mutagénesis y se seleccionan por su capacidad para exhibir porcentajes de producción más altos del aminoácido deseado que la cepa de origen. En una modalidad más específica de la invención se proporcionan microorganismos obtenidos al sujetar una cepa de origen a la mutagénesis química aleatoria, aislar una variante mutagenizada que es auxotrófica para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y seleccionar las variantes que sean capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. Otra modalidad específica de la invención proporciona microorganismos obtenidos al utilizar metodologías del ADNr para introducir un cambio (es decir, una mutación) en la secuencia de ácido nucleico del operón ilvBN, aislar una variante mutagenizada que es auxotrófica o braditrófica para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y seleccionar las variantes que sean capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. En una modalidad preferida, los microorganismos de la invención producen L-lisina. Otra modalidad preferida de la invención se dirige a los microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium o microorganismos que pertenecen al género Brevibacterium y los microorganismos particularmente preferidos son los microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium o Brevibacterium que producen L-lisina. En una modalidad más preferida, los microorganismos tienen las características de identificación de las cepas NRRL No. B-30149 (también conocida como LC10) o NRRL No. B-30150 (también conocida como BF100-1030) , depositadas el 29 de Junio de 1999 con la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604 EUA. Otro objetivo de la invención proporciona métodos para incrementar la producción de un aminoácido mediante la mutagénesis de una cepa de origen, la selección de las células auxotróficas para la síntesis de uno o más aminoácidos de cadena ramificada y la selección de auxótrofos para los aminoácidos de cadena ramificada que exhiben un porcentaje de producción mayor a partir de dextrosa del aminoácido deseado que la cepa de origen. En una modalidad preferida, el método se dirige a incrementar la producción a partir de dextrosa del aminoácido L-lisina obtenido al cultivar los microorganismos que pertenecen al género Coryneba cteri um los cuales, a través de la mutagénesis química aleatoria o la tecnología del ADN recombinante (ADNr) , se vuelven auxotróficos o braditróficos para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina y valina.

En una modalidad específica, la auxotrofía para los aminoácidos de cadena ramificada es el resultado de la mutagénesis química de los microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium . En una modalidad específica alternativa, la auxotrofía para los aminoácidos de cadena ramificada es el resultado de la mutagénesis del operón ilvBN mediante técnicas del ADNr. Otro objetivo de la invención es proporcionar procedimientos para la producción de un aminoácido a partir de microorganismos que son capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. En una modalidad, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un aminoácido que comprende cultivar en un medio un microorganismo obtenido mediante la mutagénesis de una cepa de origen para ser auxotrófica o braditrófica para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y seleccionar las variantes que son capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. En una modalidad preferida para el procedimiento, el microorganismo utilizado en la fermentación se obtiene al sujetar la cepa de origen a la mutagénesis química aleatoria, aislar una variante mutagenizada que sea auxotrófica para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y seleccionar las variantes que sean capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. En otra modalidad preferida para el procedimiento, el microorganismo utilizado en la fermentación se obtiene al alterar ( es decir, introducir una mutación) la secuencia de nucleótidos del operón ilvBN mediante la metodología del ADNr, aislar una variante mutagenizada que sea auxotrófica o braditrófica para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y seleccionar las variantes que sean capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. Se entiende que la anterior descripción general y la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas únicamente y tienen el propósito de proporcionar una explicación adicional de la invención reclamada.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 (A) Una presentación esquemática de la ruta bioquímica que conduce a la producción de L-lisina en microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um; Figura 1 (B) Una presentación esquemática de la ruta bioquímica que conduce a la producción de L-isoleucina en microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um. Figura 2. A-B) Presentación de la secuencia de nucleótidos del operón ilvBN de los microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um (SEC ID N0:1); C) Presentación de la secuencia de aminoácidos del operón ilvBN de los microorganismos que pertenecen al género Corynebacteri um (SEC ID N0:2). Figura 3. A-B) Presentación de la secuencia de nucleótidos para el mutante de supresión ilvBN en el plásmido pAL203? (SEC ID NO: 3); C) Presentación de la secuencia de aminoácidos para el mutante de supresión ilvBN en el plásmido pAL203? (SEC IN NO: 4) . Figura 4. A-C) Presentación de la secuencia de nucleótidos del alelo pRVlB5 (SEC ID NO: 5); D) Presentación de la secuencia de aminoácidos del alelo pRVlB5 (SEC ID NO : 6) .

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas J. Definiciones A fin de proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se les da a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones. Auxótrofo: Como se utiliza en la presente, el término auxótrofo se refiere a una cepa de microorganismos que requiere, para el crecimiento, una fuente externa de un metabolito específico que no puede ser sintetizado debido a un efecto genético adquirido. Suplemento de Aminoácido : Como se utiliza en la presente, el término "Suplemento de Aminoácido" se refiere a un aminoácido requerido para el crecimiento y adicionado a un medio mínimo para soportar el crecimiento del auxótrofo. Braditrofo : Como se utiliza en la presente, el término braditrofo se refiere a una cepa de un microorganismo que exhibe un crecimiento retardado en la ausencia de una fuente externa de un metabolito específico. Un braditrofo puede sintetizar el metabolito, pero debido a un defecto genético adquirido, la velocidad de la síntesis es menor que la velocidad de la síntesis de la cepa de origen del mismo metabolito. Aminoácido Ramificado : Como se utiliza en la presente, el término se refiere a aquellos aminoácidos en los cuales el grupo R posee una estructura de carbono ramificada, tal como leucina, isoleucina y valina. Flujo de Carbono: Como se utiliza en la presente, el término se refiere al movimiento del carbono entre las rutas químicas anfibólica, catabólica y/o anabólica de un organismo. Integración Cromosómica : Como se utiliza en la presente, el término se refiere a la inserción de un fragmento de ADN exógeno en el cromosoma de un organismo hospedero; más particularmente, el término se utiliza para referir la recombinación homologa entre un fragmento de ADN exógeno y la región apropiada del cromosoma de la célula hospedera . Derivado de Alta Producción: Como se utiliza en la presente, el término se refiere a una cepa de microorganismos que exhibe una producción más alta a partir de dextrosa de un aminoácido específico comparada con la cepa de origen de la cual se deriva. Mutación: Como se utiliza en la presente, el término se refiere a un cambio, inserción o supresión de un par de bases individual en la secuencia de nucleótidos de interés . Operón: Como se utiliza en la presente, el término se refiere a una unidad de expresión y regulación de genes bacterianos, que incluye los genes estructurales y elementos reguladores, en el ADN. Ejemplos de elementos reguladores que se encuentran dentro del operón incluyen, pero no están limitados a, promotores y operadores.

Cepas de Origen: Como se utiliza en la presente, el término se refiere a una cepa de un microorganismo sujetada a alguna forma de mutagénesis para producir el microorganismo de la invención. Porcentaje de Producción a Partir de Dextrosa : Como se utiliza en la presente, el término se refiere a la producción del aminoácido a partir de dextrosa definida por la fórmula [ (g de aminoácido producido/g de dextrosa consumida) *100] = % de Producción. Fenotipo : Como se utiliza en la presente, el término se refiere a las características físicas observables que dependen de la constitución genética de un microorganismo. Crecimiento Relativo: Como se utiliza en la presente, el término se refiere a una medición que proporciona una valoración del crecimiento mediante la comparación directa del crecimiento de una cepa de origen con aquel de una cepa progenie durante un período de tiempo definido y con un medio definido. Mutagénesis : Como se utiliza en la presente, el término se refiere a un procedimiento mediante el cual se genera una mutación en el ADN. Con la mutagénesis "aleatoria", el sitio exacto de la mutación no es predecible, ocurriendo en cualquier parte en el genoma del microorganismo, y la mutación es causada como resultado del daño físico causado por agentes tales como radiación o tratamiento químico. La mutagénesis del ADNr se dirige al ADN clonado de interés, y puede ser aleatoria o dirigida a un sitio. 2. Microorganismos de la Invención Basados en el Flujo de Carbono Disminuido para la Síntesis de Aminoácidos de Cadena Ramificada y la Producción Incrementada de Aminoácidos no Ramificados .

La invención proporciona en general la creación de microorganismos que son auxotróficos para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada a fin de dirigir el flujo de carbono a la síntesis de aminoácidos de cadena no ramificada. Más específicamente, al seleccionar un fenotipo auxotrófico específico que requiere uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina o valina (por ejemplo, isoleucina y valina) o diseñar mutaciones en el operón ilvBN que disminuyen el flujo de carbono para la síntesis de isoleucina, leucina y valina, el flujo de carbono en el sistema puede entonces llegar a ser disponible para otras rutas metabólicas (por ej emplo, la síntesis de L-lisina) . En una modalidad específica, la invención proporciona un microorganismo C que produce un aminoácido X, en donde el microorganismo C se obtiene mediante el siguiente método: (a) seleccionar un microorganismo de origen A que produzca el aminoácido a partir de dextrosa en el porcentaje de producción Y; (b) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir el microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) mutagénesis química aleatoria; y (ii) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (c) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico o braditrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina y valina; y (d) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual produzca el aminoácido X a partir de dextrosa en el porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y. El porcentaje de producción a partir de dextrosa se calcula preferentemente utilizando la fórmula [ (g de aminoácido/L/ (g de dextrosa consumida/L) ] *100. Los microorganismos de origen se pueden seleccionar de cualquier microorganismo conocido en la técnica que puede producir el aminoácido X. Particularmente, los microorganismos de origen favorecidos son Corynebacterium y Brevibacteri um . Las cepas de la invención se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos y técnicas conocidos y disponibles para aquellas personas de experiencia en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de los métodos adecuados para construir las cepas bacterianas inventivas incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: mutagénesis utilizando agentes adecuados tales como N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ; técnicas de integración de genes, mediadas por fragmentos de ADN lineales, transformantes y la recombinación homologa; y transducción mediada por un bacteriófago. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en J. H. Miller, Experimen ts in Molecular Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1972); J: H. Miller, A Short Course in Ba cterial Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1992); M. Singer y P. Berg, Genes & Genomes , University Science Books, Mili Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Labora tory manual , 2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); P.B: Kuafman y colaboradores, Handbook of Molecular and Cellular Methods in Bilogy and Medicine, CRC Press, Boca Ratón, Florida (1^95); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick y J. E. Thompson, Eds., CRC Press, Boca Ratón, Florida (1993); y P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, Nueva York, NY (1989) .

A. Construcción de Auxótrofos para los Aminoácidos de Cadena Ramificada Mediante la Mutagénesis Aleatoria .

Una modalidad preferida, específica de la invención estipula que la modificación de un paso enzimático común para la biosíntesis de L-isoleucina, L-leucina y L-valina puede incrementar el porcentaje de producción de L-lisina a partir de dextrosa. En una modalidad más preferida, la invención proporciona la producción de microorganismos que son auxotróficos para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada por medio de la mutagénesis aleatoria de una cepa de origen seguida por la selección del fenotipo específico. La cepa de origen seleccionada para la mutagénesis puede ser cualquier cepa conocida que produce el aminoácido de interés. Los organismos preferidos incluyen cepas de Coryneba cterium y cepas de Brevibacteri um y los organismos más preferidos incluyen cepas de Corynebacterium y cepas de Brevibacterium que producen L-lisina.

La cepa de origen puede ser mutagenizada utilizando cualquier técnica de mutagénesis aleatoria conocida en la técnica, que incluye, pero no está limitada a, radiación y procedimientos químicos. La mutagénesis química aleatoria es particularmente preferida, y el método de agentes de alquilación es el más preferido el cual es descrito por J.H. Miller (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory (1972). A manera de ejemplo, la mutagénesis química se condujo como sigue. Un cultivo de una cepa de Corynebacteri um que produce lisina se cultiva en un medio rico a 30°C hasta una densidad óptica de 6.0. Las células fueron lavadas con un medio mínimo y resuspendidas en un medio mínimo que contiene 100 microorganismos por mL de NTG. Las células se expusieron al mutágeno durante 30 minutos a 30°C. Las células se lavaron con un medio mínimo y se colocan en placas en un medio rico. Las colonias del medio rico se replicaron en placas para un medio rico y mínimo. Las colonias que se desarrollaron en un medio rico pero no crecieron en el medio mínimo se clasificaron como auxótrofos. Los mutantes auxótrofos se replicaron en placas en un medio mínimo y un medio mínimo que contenía L-isoleucina 10 mM y L-valina 10 mM. Las colonias que se rescataron por la isoleucina y valina se clasificaron como auxótrofos de valina. La cepa B4B es un auxótrofo de valina generado mediante la mutagénesis química.

B. Construcción de Auxótrofos para los Aminoácidos de Cadena Ramificada mediante la Mutagénesis a través de la Tecnología del ADNr.

Otra modalidad específica, preferida de la invención utiliza la tecnología del ADN recombinante para efectuar la mutagénesis in vi tro e in vivo de las secuencias de ADN clonadas que codifican las proteínas importantes para la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada. El ADN mutado entonces puede ser utilizado para modificar la cepa de origen para producir las cepas mutantes que son auxotróficas para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y que exhiben una producción más alta a partir de dextrosa de aminoácidos de cadena no ramificada que la cepa de origen. En una modalidad preferida, específica, el ADN clonado de interés puede ser mutado a través de la tecnología del ADN recombinante por cualquier medio conocido en esa técnica. Como una persona experta en la técnica sabría, las mutaciones en el ADN clonado puede constituir cambios de nucleótidos individuales (mutaciones de punto) , cambios de nucleótidos múltiples, supresiones o inserciones de nucleótidos. Los métodos generales para la tecnología del ADN recombinante son conocidos para aquellas personas expertas en la técnica y se pueden encontrar en un gran número de manuales de laboratorio comunes que describen técnicas fundamentales, tales como la purificación de ácido nucleico, la digestión de enzimas de restricción, ligadura, clonación de genes, ordenamiento en secuencias de genes, amplificación de cadenas de polimerasa (PCR) de secuencias de genes, y similares ( ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores , Molecular Cloning: A Labora tory Manual , Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel y colaboradores , eds., John Wiley & Sons, Nueva York, (1994); PC Protocols, Innis y colaboradores, eds., Academic Press, Inc., Nueva York, páginas 407-415 (1990)). Además, las referencias que enseñan específicamente la mutagénesis in vi tro del ADN clonado son conocidas para aquellas personas expertas en la técnica. Por ejemplo, las estrategias tales como la mutagénesis dirigida a un sitio, la mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos, la mutagénesis de exploración de enlazadores, la mutagénesis química aleatoria in vi tro, la mutagénesis de caset, la mutagénesis de PCR y otras son detalladas en Directed Mutagenesis : A Practical Approa ch , M. J. McPherson, ed. , Oxford University Press, Nueva York, (1991) . En otra modalidad preferida, específica, el ADN clonado de interés puede ser mutado in vivo en una célula hospedera. Este tipo de "mutagénesis in vivo" incluye procedimientos para generar mutaciones aleatorias en cualquier ADN clonado de interés mediante la propagación del ADN en una cepa de E. coli que lleva mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Estas cepas "imitadoras" tienen una velocidad de mutación aleatoria más alta que aquella de una cepa de origen de tipo no cultivado. La propagación del ADN en una de estas cepas generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Los sistemas diseñados para realizar esto son conocidos para aquellas personas expertas en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, Stratagene, Inc. proporciona un sistema que utiliza la cepa XL 1 Red de E . coli el cual ha tenido sus genes de reparación de ADN (MutH, MutL y MutS) suprimidos tal que muchas mutaciones diferentes ocurren en corto tiempo. Hasta 10,000 mutaciones pueden tomar lugar dentro de un lapso de tiempo de 30 horas tal que una genoteca de ADN mutado completa puede ser preparada a partir del ADN mutado mediante los procedimientos conocidos en la técnica. El ADN clonado seleccionado para la mutación puede ser cualquier secuencia conocida en la técnica que sea importante para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada, que incluye pero no está limitado a, secuencias que codifican una o más enzimas importantes para la síntesis o uno o más productos proteínicos importantes para el transporte y excreción. La secuencia clonada para el operón ilvBN de Corynebacterium o Brevibacterium es la más preferida. Los genes de Corynebacterium involucrados en la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada han sido clonados, por ejemplo, las secuencias de genes están disponibles para la ruta de isoleucina (ilvA, ilvB, ilvC, ilvD e ilvE) (C. Cordes y colaboradores , Gene 112: 113-116 (1992); B. Móckel y colaboradores , J. Bacteriology 174: 8065-8072 (1992); y C. Keilhauer y colaboradores, J. Bacteriology 175: 5595-5603 (1993) ) . La L-isoleucina es producida a partir de L-treonina en cinco reacciones; las enzimas que catalizan estas reacciones incluyen: (1) treonina dehidratasa (ilvA) ; (2) acetohidroxiácido sintasa (ilvBN) ; (3) isomerorreductasa (ilvC); (4) dihidroxiácido dehidratasa (ilvD) ; y (5) transaminasa B (ilvE) . La treonina dehidratasa es la única enzima en esta ruta única para la síntesis de isoleucina; las otras cuatro enzimas también son utilizadas en la producción de los otros aminoácidos de cadena ramificada, valina y leucina. La ruta enzimática involucrada en la biosíntesis de isoleucina en las cepas de Coryneba cterium se presenta en la figura 2. La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) y la isomerorreductasa (IR) catalizan las reacciones subsecuentes en el flujo de los metabolitos a través de la isoleucina, valina, leucina y pantotenato. Como en otras bacterias, la AHAS de cepas de Corynebacterium es codificada por dos genes, ilvB e ilvN. La disrupción de genes verificó que estos genes codifican la actividad de la AHAS individual en C. glutamicum (Keilhauer, C, y colaboradores, J. Bacteriology 175:5595- 5603 (1973)). Tres transcripciones de 3.9, 2.3 y 1.1 kb se identificaron ín vivo mediante el análisis de la técnica de inmunotransferencia de Northern, las cuales corresponden a los mensajes ilvBNC, ilvNC e ilvC, respectivamente, la transcripción ilvC (que codifica IR) es la transcripción más abundante del operón ilv de C. glutamicum . Un análisis adicional indica que tres promotores son activos en este operón; los niveles ya establecidos de los mensajes ilvBNC e ilvNC contribuyen significantemente a la actividad total de la AHAS individual. En una modalidad más preferida de la invención, una mutación puede ser generada por medio de la digestión de la enzima de restricción para crear una supresión en la secuencia de ADN del operón ilvBN clonado. La secuencia de ilvBN mutada entonces puede ser sustituida por la secuencia de tipo no cultivado mediante la recombinación homologa y examinada por la auxotrofía para los aminoácidos de cadena ramificada . Otra modalidad de la invención se dirige a un microorganismo del género Corynebacterium que tiene lo siguiente que es auxotrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada isoleucina, leucina y valina y exhibe un porcentaje de producción a partir de dextrosa de un . aminoácido de interés que es mayor que aquel del porcentaje de producción de la cepa de origen. En una modalidad particularmente preferida, el aminoácido producido es L-lisina. Otras modalidades altamente preferidas de la invención se dirigen a los microorganismos que tienen sustancialmente todas las características del depósito de NRRL No. B-30149 o el depósito de NRRL No. B-30150. 3. Métodos para Incrementar la Producción de un Aminoácido Un objetivo adicional de la invención proporciona métodos para incrementar la producción de un aminoácido. La invención proporciona generalmente un método para incrementar la producción de un aminoácido X, que comprende: (a) seleccionar un microorganismo de origen A que produce el aminoácido a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Y; (b) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir el microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) mutagénesis química aleatoria; y (ii) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (c) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina y valina; y (d) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual produce el aminoácido X a partir de dextrosa en el porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y. En una modalidad particularmente preferida, cualquier cepa conocida en "la técnica se puede seleccionar como una cepa de origen que produce el aminoácido de interés en un porcentaje de producción determinado a partir de dextrosa. El porcentaje de producción a partir de dextrosa puede ser calculado fácilmente utilizando la siguiente fórmula: [ (g de aminoácido/L/ (g de dextrosa consumida/L) ] *100. Después de seleccionar el organismo y determinar el porcentaje de producción a partir de dextrosa del aminoácido, el microorganismo es sujetado preferiblemente a la mutagénesis ya sea mediante las técnicas de mutagénesis aleatoria dirigidas al genoma completo del organismo o mediante las técnicas del ADNr dirigidas hacia el ADN clonado de interés. Sin importar el método particular de mutagénesis empleado, los organismos mutados se examinan y se seleccionan en base a la auxotrofía para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Los auxótrofos seleccionados entonces pueden ser examinados para determinar que cepas producen un porcentaje de producción mayor del aminoácido deseado a partir de dextrosa que la cepa de origen. Diversas modalidades de la invención incluyen métodos para incrementar la producción de un aminoácido de interés a partir de los organismos Coryneba cteri um , Breviba cteri um y E. coli . Adicionalmente, dependiendo de la modalidad particular, la invención proporciona métodos para incrementar la producción de aminoácidos no ramificados, tales como glicina; alanina; metionina; fenilalanina; triptófano prolina; serina; treonina; cisteína, tirosina; asparagina; glutamina; ácido aspártico; ácido glutámico; lisina; arginina e histidina. En una modalidad preferida, la invención proporciona métodos para incrementar la producción de aminoácidos de cadena no ramificada mediante la creación de auxótrofos para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada y el suministro de flujo de carbono de la síntesis de leucina, isoleucina y valina. Una modalidad particularmente preferida se dirige a un método para incrementar la producción de un aminoácido mediante la selección de una cepa de origen mutagenizada, una cepa que es auxotrófica para la síntesis de valina e isoleucina. La invención además proporciona diversas modalidades preferidas para métodos para incrementar la producción de un aminoácido en donde la cepa de origen puede ser mutagenizada ya sea mediante las técnicas de mutagénesis aleatoria (por ejemplo, mutagénesis química o por radiación) o mutagénesis del operón ilvBN mediante las técnicas del ADNr. En una modalidad particularmente preferida, la cepa de origen puede ser mutagenizada mediante la mutagénesis química aleatoria. En otra modalidad particularmente preferida, la cepa de origen es mutagenizada mediante técnicas del ADNr dirigidas a la secuencia de nucleótidos del operón ilvBN clonado. 4. Procedimientos para la Producción de un Aminoácido Un objetivo adicional de la invención proporciona procedimientos para la producción de un aminoácido. La invención proporciona generalmente un procedimiento para producir un aminoácido X que comprende: (a) cultivar un microorganismo C en un medio, en donde el microorganismo C se obtiene mediante el siguiente método: (i) seleccionar un microorganismo de origen A que produzca el aminoácido a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Y; (ii) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir el microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (1) mutagénesis química aleatoria; y (2) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (iii) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina y valina; y (iv) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual produzca el aminoácido X a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y; y (b) recuperar el aminoácido X que es producido a partir del microorganismo C.

Las modalidades preferidas de la invención se dirigen a procedimientos en los cuales el microorganismo cultivado se selecciona del grupo que incluye Corynebacterium , Brevibacterium y E. coli . Se prefieren particularmente los procedimientos dirigiros a organismos del género Corynebacterium . Los microorganismos seleccionados para los procedimientos de la invención son aquellos que producen un aminoácido de interés, particularmente aminoácidos de cadena no ramificada. Los microorganismos más particularmente preferidos son microorganismos que producen glicina; alanina; metionina; fenilalanina; triptófano; prolina; serina; treonina; cisteína; tirosina; asparagina; glutamina; ácido aspártico; ácido glutámico; lisina; arginina; e histidina. El nivel de producción del aminoácido de la selección se puede determinar convenientemente mediante la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de producción a partir de dextrosa: [ (g de aminoácido/L (g de dextrosa consumida/L) ] *100. Los microorganismos utilizados en los procedimientos de la invención se obtienen preferiblemente mediante la mutagénesis de la cepa de origen seleccionada. Las modalidades preferidas de la invención incluyen procedimientos en los cuales las cepas de origen seleccionadas se sujetan ya sea a la mutagénesis aleatoria dirigida al genoma completo o a la mutagénesis del ADNr del ADN clonado de interés. Las modalidades particularmente preferidas de la invención en donde la cepa de origen se sujeta a la mutagénesis aleatoria incluyen, pero no están limitadas a, la mutagénesis mediante el tratamiento de radiación o el tratamiento químico. Una modalidad más particularmente preferida se dirige a la mutagénesis química aleatoria de la cepa de origen. Otra modalidad particularmente preferida de la invención proporciona la mutagénesis del ADNr de la cepa de origen. Una modalidad más particularmente preferida se dirige a la mutagénesis del ADNr del operan ilvBN in vi tro o in vivo . Las formas mutadas del operón ilvBN, o fragmentos del mismo, entonces pueden ser sustituidas por la secuencia del operón ilvBN de tipo no cultivado a través de las técnicas de recombinación homologa que son bien conocidas para aquellas personas expertas en la técnica (ver el Ejemplo 6) . Sin embargo, las cepas de origen seleccionadas o las secuencias de ADN clonadas son mutagenizadas, la progenie resultante son examinadas y seleccionadas por la auxotrofía para la síntesis de aminoácidos de cadena ramificada (es decir, leucina, isoleucina o valina) . La selección de estos mutantes está dentro del criterio de aquellas personas expertas en la técnica. Una modalidad particularmente preferida se dirige a cepas que son auxotróficas para la biosíntesis de valina e isoleucina. Finalmente, la selección de los microorganismos de los procedimientos de la invención es dependiente de la producción del aminoácido de la selección. Utilizando la fórmula [ (g de aminoácido/L/ (g de dextrosa consumida/L) ] *100 para determinar el porcentaje de producción a partir de dextrosa, los microorganismos deseados se seleccionan en base a tener un porcentaje de producción mayor a partir de dextrosa del aminoácido de la selección que la cepa de origen. Otras modalidades de la invención se dirigen a procedimientos que varían por el método específico para cultivar los microorganismos de la invención. De esta manera, una variedad de técnicas de fermentación es conocida en la técnica, las cuales se pueden emplear en los procedimientos de la invención dirigidos a la producción de aminoácidos. Ejemplos ilustrativos de fuentes de carbono adecuadas incluyen, pero no están limitados a: carbohidratos, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, hidrolizado de almidón, hidrolizado de celulosa y melaza; ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico y ácido fumárico; y alcoholes tales como glicerol.

Los ejemplos ilustrativos de fuentes de nitrógeno adecuadas- incluyen, pero no están limitados a: amoníaco, que incluye gas amoníaco y amoníaco acuoso; sales de amonio de ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como cloruro de amonio, fosfato de amonio, sulfato de amonio y acetato de amonio; y otras que contienen nitrógeno, que incluyen extracto de carne, peptona, licor de infusión de maíz, hidrolizado de caseína, hidrolizado de pastel de soya y extracto de levadura . Generalmente, los aminoácidos pueden ser producidos comercialmente a partir de la invención en procedimientos de fermentación tales como del tipo por lotes o del tipo por lotes alimentados. En las fermentaciones del tipo por lotes, todos los nutrientes son adicionados al inicio de la fermentación. En las fermentaciones del tipo por lotes alimentados o lotes alimentados extendidos uno o varios nutrientes son suministrados continuamente al cultivo, desde el inicio de la fermentación o después de que el cultivo ha alcanzado cierta edad, o cuando el (los) nutriente (s) que son alimentados fueron agotados del fluido de cultivo. Una variante de la fermentación del tipo por lotes alimentados o lotes extendidos es la fermentación del tipo por lotes alimentados repetidamente o de llenar y extraer, donde parte de los contenidos del fermentador es removida en algún momento, por ejemplo cuando el fermentador está lleno, mientras que la alimentación de un nutriente es continua. De esta manera, una fermentación puede ser extendida durante un tiempo más largo. Otro tipo de fermentación, la fermentación continua o cultivo quimioestato, utiliza la alimentación continua de un medio completo, mientras que el fluido del cultivo es retirado continuamente o semicontinuamente de una manera tal que el volumen del caldo en el fermentador permanece aproximadamente constante. Una fermentación continua puede ser mantenida en principio durante un tiempo infinito. En una fermentación por lotes, un organismo crece hasta que uno de los nutrientes esenciales en el medio llega a agotarse, o hasta que las condiciones de fermentación llegan a ser desfavorables (por ejemplo las disminuciones del pH a un valor inhibitorio para el crecimiento microbiano) . En las fermentaciones por lotes alimentados las mediciones se toman normalmente para mantener las condiciones de crecimiento desfavorables, por ejemplo, al utilizar un control de pH y el agotamiento de uno o más nutrimentos esenciales se previene al alimentar este (os) nutriente (s) al cultivo. El microorganismo continuará creciendo a una velocidad de crecimiento dictada por la velocidad de la alimentación del nutriente. Generalmente, un nutrimento individual, muy frecuentemente la fuente de carbono, llegará a ser limitante del crecimiento. El mismo principio se aplica a una fermentación continua, usualmente un nutriente en el medio alimentado es limitante, todos los otros nutrientes están en exceso. El nutriente limitante estará presente en el fluido de cultivo en una concentración muy baja, frecuentemente tan baja que no se puede medir. Los diferentes tipos de limitación de nutrientes pueden ser empleados. La limitación de la fuente de carbono es la más frecuentemente utilizada. Otros ejemplos son la limitación por la fuente de nitrógeno, la limitación por el oxígeno, la limitación por un nutriente específico tal como una vitamina o un a aminoácido (en el caso que el microorganismo sea auxotrófico para este compuesto) , la limitación por el azufre y la limitación por el fósforo. El aminoácido puede ser recuperado por cualquier método conocido en la técnica. Los procedimientos ejemplos se proporcionan en los siguientes documentos: Van Walsem, H.J. & Thompson, M.C., J. Biotechnol . 59 : 121-132 (1997) y la patente norteamericana No. 3,565,951, ambos de los cuales se incorporan en la presente por referencia. Todas las patentes y publicaciones referidas en la presente son incorporadas expresamente por referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Mutagénesis Quími ca y Selección de Auxótrofos para Valina Una cepa de Corynebacterium que produce lisina BF100 fue mutagenizada con un agente de alquilación como se describe en Miller, J.H. 1972 (Miller, J.H. 1972 Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory). Las colonias fueron duplicadas en placas en un medio mínimo (MM) . Aquellos que no crecieron en el MM pero crecieron en el medio completo (CM) fueron identificados como auxótrofos. Aquellos auxótrofos que fueron capaces de crecer en el MM cuando se complementó con L-valina y L-isoleucina se seleccionaron para el análisis de producción de lisina. El MM consistió de 20 g de D-glucosa, 10 g de sulfato de amonio, 2.5 g de urea, 1 g de KH2P04, 0.4 g de MgSO4.7H20, 1 g de NaCl, 0.01 g de MnSO4.H20, 0.01 g de FeSO4.7H20, 10 mg de pantotenato, 50 mg de biotina, 200 mg de tiamina y 50 mg de niacinamida por litro a pH 7.2. Cuando los L-aminoácidos se utilizaron para complementar el MM, se utilizó 50 mg/L de cada uno. El MMIV fue MM con isoleucina y valina adicionadas. El patrón de crecimiento de una cepa de origen y un derivado de alto rendimiento producido mediante la mutagénesis química en placas de agar mínimo complementadas con tres aminoácidos se presenta en la Tabla 1. Los suplementos son a 50 mg/L de L-aminoácidos. El crecimiento se presenta como el tamaño de la colonia relativo después de 3 días a 30C.

Ej mplo 2 Producción de Auxótrofos de Cadena Ramificada con Tecnología del ADNr Preparación de un Gen ilvB Suprimido El operón ilvBN de Corynebacterium lactof ermen tum (ATCC 21799) fue amplificado mediante la PCR y clonado en pCR-Script para hacer pAL203. El gen ilvB contiene una región de 390 bp separada por 2 sitios de restricción EcoNI. El EcoNI no corta el plásmido pCR-Script. El alelo de supresión ilvB fue diseñado al cortar el plásmido pAL203 con EcoNI seguido por la autoligadura para producir el pAL203delta. 2. Recombinación Homologa de un Alelo ilvBN Modificado en el Cromosoma de Corynebacterium Un vector para el intercambio de alelos mediante el cruzamiento doble se construyó como se describe por Maloy y colaboradores 1996 (Maloy S.R., Stewart V.J., y Taylor R.K. 1996 Genetic Analysis of Pathogenic Bacteria: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) . El ATCC 37766 fue la fuente de pK184 un plásmido que se duplica en E. coli pero no en Corynebacterium . Un gen sacB se subclonó en su sitio SspI para dar pJC3. El pJC3 no se puede duplicar en Corynebacterium . Cualquier colonia resistente a la canamicina tendrá el vector integrado en el cromosoma mediante la recombinación homologa en un sitio dentro del gen clonado. La expresión letal del gen sacB en el vector integrado previene el crecimiento en la presencia de sacarosa. El crecimiento en la presencia de sacarosa requiere que ocurra un segundo cruzamiento a lo largo de una región homologa del inserto clonado. Si el primero y se'gundo cruzamientos flanquean una modificación (supresión, mutación- del sitio) , entonces el alelo modificado de ilvBN será intercambiado por el alelo presente en el cromosoma de la cepa hospedera. El alelo modificado del operón ilvBN de pAL203? fue subclonado en el vector de integración pJC3 y sujetado a la electroporación en la cepa BF100 de Coryneba cterium y colocado en placas con medio rico que carecen de sacarosa pero que tienen canamicina (DMK). Las colonias se seleccionaron y se cultivaron en caldo rico que carece de sacarosa y canamicina durante 48 horas. Los cultivos fueron depositados en líneas en placas ricas que carecen de canamicina pero que tienen sacarosa. Las colonias individuales fueron seleccionadas de las placas de sacarosa y fueron duplicadas en placas en DMK, SM1, MM y MMIV. Las cepas que no tuvieron resistencia a la canamicina, pudieron crecer en sacarosa, y no pudieron crecer en MM pero pudieron crecer en MMIV se seleccionaron para los experimentos en matraces oscilantes. EL LC10 es un auxótrofo derivado de BF100. El patrón de crecimiento de una cepa de origen y un derivado de alto rendimiento producido con los métodos del ADN recombinante en una serie de placas de agar mínimo complementadas con tres aminoácidos se presenta en la Tabla 2. Los suplementos son a 50 mg/L de L-aminoácidos. El crecimiento se presenta como tamaño relativo de la colonia después de 3 días a 30°C.

Ejemplo 3 Determinación en Matraces Oscilantes de la Producción de L- lisina a partir de una Cepa Auxótrofa para Valina Producida Mediante la Mutagénesis Qa±mica Aleatoria El inoculo B4B se preparó al seleccionar una colonia individual de una placa SM1 y transferir al caldo SM1. El SM1 se hizo al combinar 50 g de sacarosa, 3 g de K2HP04, 3 g de urea, 0.5 g de MgSO4.7H20, 20 g de polipeptona, 5 g de extracto de carne, 0.9 mg de D-biotina, 3 mg de tiamina, 125 mg de niacinamida, 0.5 g de L-metionina, 0.25 g de L-treonina, 0.5 g de L-alanina por litro de agua y ajustar el pH a 7.3. Las placas incluyeron 20 g/L de agar. Después de 16 horas de crecimiento de los cultivos en el caldo SM1, se adicionó un volumen igual de glicerol al 30% y los cultivos se congelaron a -80°C. Los matraces oscilantes semillas de 250 mL con deflector con 20 L de SFM fueron inoculados con 0.1 mL del inoculo descongelado. El medio semilla (SFM) consistió de 60 g de D-glucosa, 3 g de K2HP04, 3 g de urea, 0.5 g de MgSO4.7H20, 20 g de polipeptona, 5 g de extracto de carne, 3 mg de D-biotina, 125 de mg de niacinamida, 0.5 g de L-metionina, 0.25 g de L-treonina y 0.5 g de L-alanina por litro de agua con pH ajustado a 7.3. Los cultivos se hicieron a 30C durante 16 horas y se airearon a 240 rpm con un desplazamiento de 5.08 cm (2 pulgadas). Dos mL del cultivo semilla se utilizaron para inocular 21 mL del medio de fermentación (FM4) . El medio FM4 se hizo al mezclar 16 mL del medio principal con 5 mL de solución madre de dextrosa. La solución madre de dextrosa fue de 180 g de D-glucosa más 500 mL de agua. El medio principal contuvo 0.083 g de MnS04, 0.4 mg de D-biotina, licor de infusión de maíz, producto refinado y 50 g de CaC03 por litro. La infusión de maíz se adicionó de modo que el volumen final del FM4 fue 4% de sólidos secos. El producto refinado se adicionó de modo que el volumen final del FM4 tuvo 5% de sulfato de amonio. Los cultivos se hicieron durante 48 horas a 30C en matraces oscilantes con deflector de 250 L y se airearon a 240 rpms con un desplazamiento de 5.08 cm (2 pulgadas). La Tabla 3 presenta los datos sobre la producción de L-lisina en matraces oscilantes por la cepa de Corynebacterium mejorada por la selección del requerimiento de valina e isoleucina.

Ejemplo 4 Determinación en Matraces Oscilantes de la Producción de L- lisina a partir de la Cepa Auxótrofa para Valina Producida mediante la Metodología del ADNr La Tabla 4 presenta datos sobre la producción de L-lisina en matraces oscilantes por las cepas de Corynebacteri um mejoradas por la supresión de 390 bases de la secuencia de ADN de la copia cromosómica del operón ilvBN (ver Ejemplo 2) . Los cultivos se hicieron y se analizaron como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 5 Determinación de Microfermentación de la Producción de Lisina por el Auxótrofo de Valina El inoculo se cultivo en 500 mL de SM1 en un matraz oscilante con reflector de 2 L durante 18 horas. Se utilizaron 3.1 L del medio FM4 en microfermentadores de 4 L. La temperatura y el pH se mantuvieron a 32C y 7.2, respectivamente. La agitación se incrementó de 700 rpms a 950 rpms en 20 horas. El aire se alimentó a 4.5 LPM. La dextrosa de mantuvo a 3 g/L. El tiempo de fermentación fue 48 horas. La Tabla 5 presenta datos sobre la producción de L-lisina en fermentadores de 4 litros utilizando una cepa de Coryneba cteri um la cual no puede sintetizar L-isoleucina y L-valina.

Ej mplo 6 Producción de L-Lisina por un Braditrofo Producido mediante la Mutagénesis In Vivo del ILVBN Clonado 1. Preparación de un Operón ilvBN Imperfecto que Produce una Enzima AHAS Funcional El operón ilvBN de pAL203 se subclonó en un vector transportador pM2 para dar el pVALl. El pM2 puede duplicarse en tanto E. coli como Corynebacterium . El pVall se transformó en la cepa mutagénica XL1RED de Stratagene Co . El plásmido mutagenizado se preparó de acuerdo con las instrucciones del equipo de XL1RED y se sometió a la electroporación en un auxótrofo de valina, Corynebacterium . Un auxótrofo para valina no fue capaz de crecer en las placas de MM sin el suplemento por leucina y valina o el complemento genético con un operón ilvBN funcional. Los transformantes resistentes a la canamicina se seleccionaron de las placas de SMl y se duplicaron en placas de MM. Aquellas colonias que crecieron en placas de MM mostraron una complementación funcional de la supresión de ílvB. Las colonias que fueron más pequeñas que las colonias del auxótrofo para' valina con el plásmido de origen (pVALl) se seleccionaron para los ensayos de actividad de auxótrofo para valina. El pRVlB5 es un plásmido derivado de pVALl que puede duplicarse en E. coli y Coryneba cterium . En la cepa auxótrofa para valina, se produjo actividad de AHAS en al menos 1% de la actividad específica de la AHAS producida por la pVALl. El operón ilvBN de esta construcción tuvo una actividad de AHAS permeable. 2. Recombinación Homologa en el ADN Cromosómico de Coryneba c teri?m El alelo permeable RV1B5 del operón ilvBN fue subclonado en el vector de integración pJC3 y se utilizó para el intercambio del alelo permeable por el alelo de supresión en un auxótrofo para valina mediante la recombinación homologa como se hizo en el Ejemplo 2. El BF100-1030 es un braditrofo para valina construido con el alelo RV1B5. La Tabla 6 presenta datos que muestran que el BF100-1030 hace menos valina en los matraces oscilantes que su cepa de origen. La Tabla 7 muestra que el braditrofo BF100-1030 tiene un crecimiento mejorado sobre los auxótrofos en la Tabla 5. La Tabla 7 también muestra "que el braditrofo produce menos valina en los microfermentadores que la cepa de origen.

Tablas Los datos presentados en las siguientes tablas son discutidos en la sección de Ejemplos. Observar que el término "Crecimiento" se refiere a la densidad óptica medida a 660 nm; el término "Título" se refiere a los gramos de aminoácido por litro; el término "Producción" se define por la siguiente fórmula: [ (g de lisina/L / (g de dextrosa consumida/L) ] *100; B4B = un auxótrofo para valina construido con la mutagénesis química; LC10 = un auxótrofo para valina construido al reemplazar el gen cromosómico ilvB con el alelo de supresión ilvB de pAL203?; BF100-1030= un braditrofo para valina construido al reemplazar el gen cromosómico ilvB con el alelo permeable RV1B5.

Tabla 1 Selección del Auxótrofo para Valina Después de la Mutagénesis Química Tabla 2 Selección del Auxótrofo Después de la Modificación del ADNr Tabla 3 Determinación en Matraces Oscilantes de la Producción de L- lisina a partir de una Cepa de Auxótrofo para Valina Producida Mediante la Mutagénesis Química Aleatoria Tabla 4 Determinación de Matraces Oscilantes de la Producción de L- lisina a partir de una Cepa de Auxótrofo para Valina Producida Mediante la Metodología del ADNr Tabla 5 Determinación Mediante la Microfermentación de la Producción de Lisina Tabla 6 Determinación en Matraces Oscilantes del Título L-Valina Disminuido de una Cepa Braditrofa para Valina Producida Mediante la Integración del Alelo RV1B5 de ilvB en el Cromosoma Tabla 7 Determinación Mediante la Micro fermentación del Título de L- Valina Disminuido de una Cepa Braditrofa para Valina Producida Mediante la Integración del Alelo RV1B5 de ilvB en el Cromosoma LISTADO DE SECUENCIAS <110> Archer-Daniels-Midlan Company Rayapati, P. John Craf on, Corey M. <120> Ingeniería Metabólica de la Producción de Aminoácidos <130> 1503.074PC01 <140> <141> c!50> US 60/146,379 <151> 02-08-1999 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1895 < 12> ADN <213> Corynebacteriutn sp. <400> 1 ggagccagaa agtcgtgaat gtggcagctt ctcaasagcc cactcccgcs acggttgcaa 60 gccgtggtcg atccgccgcc cctgagcgga tgacaggtgc aaaggcaatt gttcgatcgc 120 tcgaggagct taacgccgac atcgtg tcg gtattcctgg tggtgcggtg ctaccggtgt 180 atgacccgct ctattcctcc acaaaggtgc gccacgtctt ggtgcgccac gagcagggcg 240 caggccacgc agcaaccggc tacgcgcagg ttactggacg cgttggcgtc tgca tgcaa 300 cctctggccc aggagcaacc aacttggtta ccccaatcgc tgatgcaaac ttggactccg 360 ttsccatggt tgccatcacc ggcsaggtcg gaagtggcct gctgggtacc gacgctttcc 420 aggaagccga tatccgcggc atcaccatgc cagtgaccaa gcacaacttc atggtcacca 480 accctaacga cattccacag gcattggctg aggcattcca cctcgcgatt actggtcgcc 540 ctggccctgt tctggtggat attcctaagg atgtccagaa cgctgaattg gatttcgtct 600 ggccaccaaa gatcgacctg ccaggctacc gcccagtttc aacaccacat gctcgccaga 660 tcgagcaggc agtcaagctg atsggtgagg ccaagaagcc cgtcctttac gttggtggtg 720 gcgtaatcaa ggctgacgca cacgaagagc ttcgtgcgtt cgctgagtac accggcatcc 780 cagttgtcac caccttgatg gctttgggta ctttcccaga gtctcacgag ctgsacatgg 840 gtatgccagg catgcatggc actgtgtccg ctgttggtgc actgcagcgc agcgacctgc 900 tgattgctat cggctcccgc tttgatgacc gcgtcaccgg tgacgttgac accttcgcgc 960 ctgacgccaa gatcattcac gccgacattg atcctgccga aatcggcaag atcaagcagg 1020 ttgaggttcc aatcgtgggc gatgcccgcg aagttcttgc tcgtctgctg gaaaccacca 1080 aggcaagcaa ggcagagacc gaggacatct ccgagtgggt tgactacctc aagggcc ca 1140 aggcacgttt cccgcgtggc tacgacgagc agccaggcga tctgctggca ccacagtttg 1200 tcattgaaac cctgtccaag gaagttggcc ccgacgcaat ttactgcgcc ggcgttggcc 1260 agcassaaat gtgggcagct cagttcgttg actttgaaaa gccacgcacc tggctcaact 1320 ccggtggact gggcaccatg ggctacgcag ttcctgcggc ccttggagca aaggctggcg 1380 cacctgacaa ggaagtctgg gctatcgacg gcgacggctg tttccagatg accaaccagg 1440 aactcaccac cgccgcagtt gaaggtttcc ccattaagat cgcactaatc aacaacggaa 1500 acctgggcat ggt cgccaa tggcagaccc tattctatga aggacggtac tcaaatacta 1560 aacttcgtaa ccagggcgag tacatgcccg actttgttac cctttctgag ggacttggct 1620 gtgttgccat ccgcgtcacc aaagcggagg aagtactgcc agccatccaa aaggctcgag 1680 agatcaacga ccgcccagta gtcatcgact tcatcgtcgg tgaagacgca caggtatggc 1740 caatggtgtc tgctggatca tccaactccg atatccagta cgcactcgga ttgcgcccat 1800 tctttgatgg tgatgaatct gcagcagaag atcctgccga cattcacgaa gccgtcagcg 1860 acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg cataa 1895 <210> 2 <211> 626 <212> PRT <213> Corynebacterium sp. <400> 2 Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala lie 20 25 30 Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp lie Val Phe Gly lie Pro 35 40 45 Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys 50 55 60 Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys He Ala Thr 85 90 95 Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro He Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala He Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp He Arg Gly He Thr 130 135 140 Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp He 145 150 155 160 Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala He Thr Gly Arg Pro 165 170 175 Gly Pro Val Leu Val Asp He Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu 180 185 190 Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys He Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val 195 200 205 Ser Thr Pro His Ala Arg Gln He Glu Gln Ala Val Lys Leu He Gly 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val He Lys Ala 225 230 235 240 Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly He Pro 245 250 255 Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu 260 265 270 Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly 275 280 285 Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu He Ala He Gly Ser Arg Phe Asp 290 295 300 Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys He 305 310 315 320 He His Ala Asp He Asp Pro Ala Glu He Gly Lys He Ly= Gln Val 325 330 335 Glu Val Pro He Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu 340 345 350 Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp He Ser Glu Trp 355 360 365 Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp 370 375 380 Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val He Glu Thr Leu 385 390 395 400 Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala He Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln 405 410 415 His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr 420 425 430 Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala 435 440 445 Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala He 450 455 460 Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala 465 470 475 480 Ala Val Glu Gly Phe Pro He Lys He Ala Leu He Asn Asn Gly Asn 485 490 495 Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr 500 505 510 Ser A=n Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val 515 520 525 Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala He Arg Val Thr Lys Ala 530- 535 54.0. Glu Glu Val Leu Pro Ala He Gln Lys Ala Arg Glu He Asn Asp Arg 545 550 555 560 Pro Val Val He Asp Phe He Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro 565 570 575 Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp He Gln Tyr Ala Leu Gly 580 585 590 Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly ASD Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala 595 600 605 Asp He His Glu Ala Val Ser Asp He Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr 610 615 620 Glu Ala 625 <210> 3 <211> 1505 <212> ADN <213> Corynebacterium sp. <400> 3 ?gagccagaa agtcgtgaat gtggcagctt ctcaacagcc cactcccgcc acggttgcaa 60 gccgtggtcg atccgccgcc cctgagcgga tgacaggtgc aaaggcaatt gtrcgatcgc 120 tcgaggagct taacgccgac atcgtgttcg gtattcctgg tggtgcggtg ctaccggtgt 180 atgacccgct ctattcctcc acaaaggtgc gccacgtctt ggtgcgccac gagcagggcg 240 caggccacgc agcaaccggc tacgcgcagg ttactggacg cgttggcgtc tgcattgcaa 300 cctctggccc aggagcaacc aacttggtta ccccaatcgc tgatgcaaac ttggactccg 360 ttcccatggt tgccatcacc ggccaggtcg gaagtggcct gctgggtacc gacgctttcc 420 aggaagccga tatccgcggc atcaccatgc cagtgaccaa gcacaacttc atggtcacca 480 accctaacga cattccacag gcattggctg aggcattcca cctcgcgatt actggtcgcc 540 ctggccctgt tctggtggat attcctaagg atgtccagaa cgctgaattg gatttcgtct 600 ggccaccaaa gatcgacctg ccaggctacc gcccagtttc aacaccacat gctcgccaga 660 tcgagcaggc agtcaagctg atcggtgagg ccaagaagcc cgtcctttac gttggtggtg 720 gcgtaatcaa ggctgacgca cacgaagagc ttcgtgcgtt cgctgagtac accggcatcc 7B0 cagttgtcac caccttgatg gctttgggta ctttcccaga gtctcacgag ctgcacatgg 840 gtatgccagg catgcatggc actgtgtccg ctgttggtgc actgcagcgc agcgacctgc 900 tgattgctat cggctcccgc tttgatgacc gcgtcaccgg tgacgttgac accttcgcgc 960 ctgacgccaa gatcattcac gccgacattg atcctgccga aatcggcaag atcaagcagg 1020 ttgaggttcc aatcgtgggc gatgcccgcg aagttcttgc tcgtctgctg gaaaccacca 1080 aggcaagcaa ggcagagacc gaggacatct ccgagtgggt tgactacctc aagggcctca 1140 aggcacgttt cccgcgtggc tacgacgagc agccaggcga tctgctggca ccacagtttg 1200 tcattgaaac cctgtctgag ggacttggct gtgttgccat ccgcgtcacc aaagcggagg 1260 aagtactgcc agccatccaa aaggctcgag agatcaacga ccgcccagta gtsatcgact 1320 tcatcgtcgg tgaagacgca caggtatggc caatggtgtc tgctggatca tccaactccg 1380 atatccagta cgcactcgga ttgcgcccat tctttgatgg tgatgaatct gcagcagaag 1440 atcctgccga cattcacgaa gccgtcagcg acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg 1500 cataa 1505 <210> 4 <211> 496 <212> PRT <213> Corynebacterium sp. <400> 4 Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala He 20 25 30 Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp He Val Phe Gly He Pro 35 40 45 Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Ly= 50 55 60 Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gíy Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys He Ala Thr 85 90 95 Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro He Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala He Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly 115 120 125 Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp He Arg Gly He Thr 130 135 140 Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn A=p He 145 150 155 160 Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala He Thr Gly Arg Pro 165 170 175 Gly Pro Val Leu Val Asp He Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu 180 185 190 Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys He Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val 195 200 205 Ser Thr Pro His Ala Arg Gln He Glu Gln Ala Val Lys Leu He Gly 210 215 220 Glu Ala Ly= Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val He Lys Ala 225 230 235 240 Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly He Pro 245 250 255 Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu 260 265 270 Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly 275 280 2B5 Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu He Ala He Gly Ser Arg Phe Asp 290 295 300 Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys He 305 310 315 320 He His Ala Asp He Asp Pro Ala Glu He Gly Lys He Lys Gln Val 325 330 335 Glu Val Pro He Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu 340 345 350 Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp He Ser Glu Trp 355 360 365 Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp 370 375 380 Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val He Glu Thr Leu 385 390 395 400 Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala He Arg Val Thr Lys Ala Glu Glu 405 410 415 Val Leu Pro Ala He Gln Lys Ala Arg Glu He Asn Asp Arg Pro Val 420 425 430 Val He Asp Phe He Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro Met Val 435 440 445 Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp He Gln Tyr Ala Leu Gly Leu Arg 450 455 460 Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala Asp He 465 470 475 480 His Glu Ala Val Ser Asp He Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr Glu Ala 485 490 495 <210> 5 <211> 2427 <212> ADN <213> Corynebacterium sp. <400> 5 aggagccaga aagtcgtgaa tgtggcagct tctcaacagc ccactcccgc cacggttgca 60 agccgtggtc gatccgccgc ccctgagcgg atgacaggtg cacaggcaat tgttcgatcg 120 ctcgaggasc ttaacgccga catcgtgttc ggtattcctg gtggtgcggt gctaccggtg 180 tatgacccgc tctattcctc cacaaaggtg cgccacgtcc tagtgcgcca cgagcagggc 240 gcaggccacg cagcaaccgg ctacgcgcag gttactggac gcgttggcgt ctgcattgca 300 acctctggcc caggcgcaac caacttggtt accccaatcg ctgatgcaaa cttggactcc 360 gttcccatgg ttgccatcac cggccaggtc ggaagtagcc tgctgggtac cgatgctttc 420 caggaagccg atatccgcgg catcaccatg ccagtgacca agcacaactt catggtcacc 480 aaccccaacg acattccaca ggcattggct gaggcattcc acctcgcgat tactggtcgc 540 cctggtcctg ttctagtgga tatccccaag gatgttcaga acgctgaatt ggatttcgtc 600 tggccaccaa agatcgacct gccaggctac cgcccagttt caacaccgca tgctcgacag 660 attgagcagg ctgtcaaact gatcggtgag tctaagaagc ctgtccttta cgttggcggc 720 ggcgttatca aggctgatgc ccacgaagag cttcgtgcgt tcgctgagca caccggcatt 780 ccagttgtca ccacattgat ggcgctggga accttcccag agtcccacga gctgcacatg 840 ggtatgccag gcatgcatgg cactgtgtcc gctgttggtg cactgcagcg cagcgacctg 900 ctgattgcta tcggctcccg ctttgatgac cgcgtcaccg gtgacgttga cactttcgca 960 cctgatgcca agatcattca cgccgacatt gatcctgccg aaatcggcaa gatcaagcag 1020 gttgaggttc caatcgtggg cgatgcccgc gaggttcttg ctcgtctgct cgaaaccacc 1080 aaggcaagca aggcagagtc tgaggacatc tccgagtggg ttgactacct caagggcctc 1140 aaggcacgtt tcccacgtgg ctacgacgag cagccaggcg atctgctggc accacagttt 1200 gtcattgaaa ccctgtccaa ggaagttggc cccgacgcaa tttactgcgc cggcgttggc 1260 cagcaccaga tgtgggcagc tcagttcgtt gacttcgaaa agccacgcac ctggctcaac 1320 tccggtggac tgggcaccat gggctacgca gttcctgcgg ctcttggagc aaaggctggc 1380 gcacctgaca aggaagtctg ggctatcgac ggcgacggct gtttccagat gaccaaccag 1440 gaactcacca ccgccgcagt tgaaggtttc tccattaaga tcgcactaat caacaacgga 1500 aacctgggta tggttcgcca atggcagacc ctattctatg aaggacggta ctcaaatact 1560 aaacttcgta accagggcga gtacatgccc gactttgtta ccctttctga gggacttggc 1620 tgtgttgcca tccgcgtcac caaagcggag gaagtactgc cagccatcca aaaggctcga 1680 gagatcaacg accgcccagt agtcatcgac ttcatcgtcg gtgaagacgc acaggtatgg 1740 ccaatggtgt ctgctggatc atccaactcc gatatccagt acgcactcgg attgcgccca 1800 ttctttgatg gtgatgaatc tgcagcagaa gatctgccga cattcacgaa gccgtcagcg 1860 acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg cataaggaga gacccaagat ggctaattct 1920 gacgtcaccc gccacatcct gtccgtactc gttcaggacg tagacggaat catttcccgc 1980 gtatcaggta tgttcacccg acgcgcattc aacctcgtgt ccctcgtgtc tgcaaagacc 2040 gaaacactcg gcatcaaccg catcacggtt gttgtcgacg ccgacgagct caacattgag 2100 cagatcacca agcagctcaa caagctgatc cccgtgctca aagtcgtgcg actrgatgaa 2160 gagaccacta tcgcccgcgc aatcatgctg gttaaggttt ctgcggacag caccaaccgt 2220 ccgcagatcg tcgacgccgc gaacatcttc cgcgcccgag tcgtcgacgt ggctccagac 2280 tctgtggtta ttgaatccac aggcacccca ggcaagctcc gcgcactgct tgacgtgatg 2340 gaaccattcg gaatccgcga actgatccaa tccggacaga ttgcactcaa ccgcggtccg 2400 aagaccatgg ctccggccaa gatctaa 2427 <210> 6 <211> 803 <212> PRT <213> Corynebacterium sp. <400> 6 Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala He 20 25 30 Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp He Val Phe Gly He Pro 35 40 45 Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys 50 55 60 Val Arg His Val Leu Val Arg flis Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala 65 70 75 80 Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys He Ala Thr 85 90 95 Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro He Ala Asp Ala Asn 100 105 110 Leu Asp Ser Val Pro Met Vß.1 Ala He Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser 115 120 125 Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp He Arg Gly He Thr 130 135 140 Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp He 145 150 155 160 Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala He Thr Gly Arg Pro 165 170 175 Gly Pro Val Leu Val Asp He Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu 180 185 190 A=p Phe Val Trp Pro Pro Lys He Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val 195 200- 205 Ser Thr Pro His Ala Arg Gln He Glu Gln Ala Val Lys Leu He Gly 210 215 220 Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val He Lys Ala 225 230 235 240 A=p Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly He Pro 245 250 255 Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu 260 265 270 Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly 275 280 285 Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu He Ala He Gly Ser Arg Phe Asp 290 295 300 Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys He 305 310 315 320 He His Ala A=p He Asp Pro Ala Glu He Gly Lys He Lys Gln Val 325 330 335 Glu Val Pro He Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu 340 345 350 Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp He Ser Glu Trp 355 360 365 Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tvr Asp 370 375 380 Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val He Glu Thr Leu 385 390 395 400 Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala He Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln 405 410 415 His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr 420 425 430 Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala 435 440 445 Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu' Val Trp Aia He 450 455 460 Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala 465 470 475 480 Ala Val Glu Gly Phe Ser He Lys He Ala Leu He Asn Asn Gly Asn 485 490 495 Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr 500 505 SIO Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val 515 520 525 Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala He Arg Val Thr Lys Ala 530 535 540 Glu Glu Val Leu Pro Ala He Gln Lys Ala Arg Glu He Asn Asp Arg 545 550 555 560 Pro Val Val He Asp Phe He Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro 565 570 575 Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp He Gln Tyr Ala Leu Gly 580 585 590 Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Leu Pro 595 600 605 Thr Phe Thr Lys Pro Ser Ala Thr Leu Met Pro Pro Leu Asn Arg Pro 610 615 620 Arg His Ly= Glu Arg Pro Lys Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His 625 630 635 640 He Leu Ser Val Leu Val Gln Asp Val Asp Gly He He Ser Arg Val 645 650 655 Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser 660 665 670 Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly He Asn Arg He Thr Val Val Val A=p 675 680 685 Ala Asp Glu Leu Asn He Glu Gln He Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu 690 695 700 He Pro Val Leu Lys Val Val Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr He Ala 705 710 715 720 Arg Ala He Met Leu Val Lys Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro 725 730 735 Gln He Val A=p Ala Ala Asn He Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val 740 745 750 Ala Pro Asp Ser Val Val He Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu 755 760 765 Arg Ala Leu Leu Asp Val Met Glu Pro Phe Gly He Arg Glu Leu He 770 775 780 Gln Ser Gly Gln He Ala Leu Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro 7B5 790 795 800 Ala Lys He Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un microorganismo C que produce el aminoácido
2. X, caracterizado porque el microorganismo C se obtiene mediante el siguiente método: (a) seleccionar un microorganismo de origen A que produzca el aminoácido a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Y; (b) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir un microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) mutagénesis química aleatoria; y (ii) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (c) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico o braditrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina y valina; y (d) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual produzca el aminoácido X a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y. 2. El microorganismo C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido X se selecciona del grupo que consiste de: (a) glicina; (b) alanina; (c) metionina; (d) fenilalanina; (e) triptófano; (f) prolina; (g) serina; (h) treonina; (i) cisteína; (j) tirosina; (k) asparagina; (1) glutamina; (m) ácido aspártico; (n) ácido glutámico; (o) lisina; (p) arginina; e (q) histidina.
3. 3. El microorganismo C de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo A se selecciona del grupo que consiste de: (a) Corynebacterium; (b) Brevibacterium; y (c) E. coli .
4. 4. EL microorganismo C de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el microorganismo B es auxotrófico o braditrófico para valina e isoleucina.
5. 5. El microorganismo C de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la mutagénesis del paso (ii) es la mutagénesis química aleatoria.
6. 6. El microorganismo C de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la mutagénesis del paso (ii) es la mutagénesis específica para un sitio del operón ilvBN.
7. 7. Una cepa del microorganismo Coryneba cterium, caracterizada porque tiene las siguientes características: (a) auxotrofía o braditrofía para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, isoleucina, leucina y valina; y (b) cuando se cultiva en un medio, produce un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de: (i) glicina; (ii) alanina; (iii) metionina; (iv) fenilalanina; (v) triptófano; (vi) prolina; (vii) serina; (viii) treonina; (ix) cisteína; (x) tirosina; (xi) asparagina; (xii) glutamina; (xiii) ácido aspártico; (xiv) ácido glutámico; (xv) lisina; (xvi) arginina; e (xvii) histidina; y (c) ' exhibe un porcentaje de producción a partir de dextrosa del aminoácido del paso (b) de al menos aproximadamente 30 por ciento.
8. 8. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado adicionalmente por una mutación en el operón ilvBN.
9. 9. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la mutación del operón ilvBN es una supresión, inserción o mutación de punto.
10. 10. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la mutación del operón ilvBN está caracterizada por la secuencia de SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 5.
11. 11. Una cepa del microorganismo Corynebacteri um, caracterizada porque tiene las características de identificación del depósito de NRRL No. B-30149.
12. 12. Una cepa del microorganismo Corynejacterium, caracterizada porque tiene las características de identificación del depósito de NRRL No. B-30150.
13. 13. Un método para incrementar la producción de un aminoácido X, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar un microorganismo de origen A que produzca el aminoácido a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Y; (b) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir un microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (i) mutagénesis química aleatoria; y (ii) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (c) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico o braditrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina y valina; y (d) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual produzca el aminoácido X a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el aminoácido X se selecciona del grupo que consiste de: (a ) glicina; (b ) alanina; (c ) metionina; (d ) fenilalanina; (e triptófano; (f prolina; (g serina; (h treonina; (i cisteína; (j tirosina; (k asparagina; (1) glutamina; (m) ácido aspártico; (n) ácido glutámico; (o) lisina; (P) arginina; e (q) histidina.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo A se selecciona del grupo que consiste de: (a) Corynebacterium; (b) Brevibacterium; y (c) E. coli .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el microorganismo B es auxotrófico o braditrófico para valina e isoleucina.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la mutagénesis del paso (b) es mutagénesis química aleatoria.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la mutagénesis del paso (b) es la mutagénesis específica para un sitio del operón ilvBN.
19. 19. Un procedimiento para producir un aminoácido X, caracterizado porque comprende: (a) cultivar un microorganismo C en un medio, en donde el microorganismo C se obtiene por el siguiente método: (i) seleccionar un microorganismo de origen A que produzca un porcentaje de producción Y a partir de dextrosa del aminoácido; (ii) mutagenizar el microorganismo de origen A para producir un microorganismo B por un método seleccionado del grupo que consiste de: (1) mutagénesis química aleatoria; y (2) mutagénesis del ADNr del operón ilvBN; (iii) seleccionar del paso (b) al menos un microorganismo mutagenizado B que sea auxotrófico para uno o más de los aminoácidos de cadena ramificada, leucina, isoleucina y valina; y (iv) seleccionar del paso (c) al menos un microorganismo C el cual sea un auxótrofo que produce el aminoácido X a partir de dextrosa en un porcentaje de producción Z, en donde el porcentaje de producción Z es mayor que el porcentaje de producción Y; y (b) recuperar el aminoácido X que es producido a partir del microorganismo C.
20. 20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el aminoácido X se selecciona del grupo que consiste de: (a) glicina; (b) alanina; (c) metionina; (d) fenilalanina; (e) triptófar.e; (f) prolina; (g) serina; (h) treonina; (i) cisteína; (j) tirosina; (k) asparagina; (1) glutamina; (m) ácido aspártico; (n) ácido glutámico; (o) lisina; (p) arginina; e (q) histidina.
21. 21. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el microorganismo A se selecciona del grupo que consiste de: (a) Corynebacteri um; (b) Breviba cteri um; y (c) E. coli .
22. 22. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el microorganismo B es auxotrófico o braditrófico para valina e isoleucina.
23. 23. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la mutagénesis del paso (ii) es mutagénesis química aleatoria.
24. 24. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la mutagénesis del paso (ii) es la mutagénesis específica para un sitio del operón ilvBN. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a la producción fermentativa de aminoácidos, proporcionado microorganismos, métodos y procedimientos útiles para los mismos. Los microorganismos de la invención son capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. La invención proporciona microorganismos que son hechos auxotróficos o braditróficos para la síntesis de uno o más aminoácidos de cadena ramificada mediante la mutagénesis y se seleccionan por su capacidad para exhibir porcentajes de producción más altos del aminoácido deseado que la cepa de origen. Los microorganismos- preferidos son Corynebacterium, Brevibacteri um o Escheri chia coli que producen L-lisina. La mutagénesis se realiza mediante técnicas clásicas a través de la metodología del ADNr. Los métodos de la invención están diseñados para incrementar la producción de un aminoácido mediante la mutagénesis de una cepa de origen, la selección de células auxotróficas o braditróficas para la síntesis de uno o más aminoácidos de cadena ramificada y la selección de auxótrofos o braditrofos para los aminoácidos de cadena ramificada que exhiben un porcentaje de producción más alto a partir de dextrosa del aminoácido deseado que la cepa de origen. Los procedimientos de la invención están diseñados OZ A para la producción de un aminoácido que comprende el cultivo en un medio de un microorganismo obtenido mediante la mutagénesis de una cepa de origen y la selección de variantes que son capaces de convertir la glucosa a aminoácidos diferentes de L-isoleucina, L-leucina y L-valina con mayor eficacia que la cepa de origen. 02 ¡u