JP2003506030A

JP2003506030A - アミノ酸産生の代謝工学

Info

Publication number: JP2003506030A
Application number: JP2001514080A
Authority: JP
Inventors: ピー．ジョンラヤパティ，; コレイエム．クラフトン，
Original assignee: アーカー−ダニエルズ−ミッドランドカンパニー
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2003-02-18
Also published as: US20060154345A1; CA2380613C; CA2380613A1; EP1200553B1; WO2001009286A1; AU779019B2; CN1367823A; JP2010022374A; KR100815041B1; BR0012963A; BR0012963B1; DE60042552D1; JP2006280383A; KR20020033749A; US7323321B2; NZ516893A; AU6617400A; JP5319489B2; US7635579B2; US20080090272A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アミノ酸の発酵産生に関し、微生物、方法およびそれに有用なプロセスが提供される。本発明の微生物は、親株よりも高効率で、グルコースをＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換することができる。本発明は、突然変異により一つ以上の分枝鎖アミノ酸を合成するために栄養要求性またはブラディトロフになるように改変され、親株よりも所望するアミノ酸をより高いパーセント収率で産生できる能力について選択された微生物株を提供する。好適な微生物は、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明分野）本発明は、微生物遺伝学および組み換えＤＮＡ技術の分野に関する。より具体
的には、本発明は、アミノ酸の発酵産生に関する。本発明により、アミノ酸産生
に有用な微生物、アミノ酸産生を向上させる方法、およびアミノ酸産生プロセス
が提供される。

【０００２】（関連分野）発酵によるアミノ酸産生は、糖密、酢酸およびエタノールなどの廉価な炭素源
からの安価な産生を可能とする。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａがアミノ酸の工
業生産に有用である（Ｓ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏ
ｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＥｎｚ
ｙｍｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２：４６４−４６８（１９５７））という認識に
従って、発酵プロセスによるアミノ酸の商業生産が、変異株の分離を用いてより
実施可能になった。アミノ酸産生の微生物プロセスで用いられる微生物を４つの
クラスに分類し得る：野生型株、栄養要求性変異株、調節変異株および栄養要求
性調節変異株（Ｋ．Ｎａｋａｙａｍａら、ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬＩＭＰＲＯ
ＶＥＭＥＮＴＯＦＦＯＯＤＡＮＤＦＥＥＤＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｍ．Ｆ
ｒｉｅｄｍａｎ編、（１９７８）、ｐｐ．６４９−６６１）。発酵により産生さ
れたアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較して、微生物プロセスによる
アミノ酸産生を優位なプロセスとし；微生物プロセスにより産生されるアミノ酸
は、通常Ｌ−型である。

【０００３】Ｌ−リシンは、工業的発酵により産生されるアミノ酸の一例である。この必須
アミノ酸の商業的産生は、グラム陽性微生物であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍお
よびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Ｋｌｅｅ
ｍａｎｎ，Ａら、ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，ＵＬＬＭＡＮ‘ＳＥＮＣＹＣＬＯ
ＰＥＤＩＡＯＦＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ｖｏｌ．Ａ２
，ｐｐ．５７−９７、Ｗｅｉｎｈａｍ：ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓ
ｃｈａｆｔ（１９８５））を利用して主に行なわれ；累積的に、これら３つの微
生物は現在、一年間におよそ２５０，０００トンのＬ−リシンを産生すると報告
されている。

【０００４】発酵プロセスによるＬ−リシン産生の経済的重要性があるなら、生産コストを
下げると同時に、産生される総量を増加させることが有用であろう。それを目標
として、Ｌ−リシン合成の生化学的経路が集中的にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ（最近、Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８２：２５−
３９（１９９６）によってレビューされた）において研究されている。リシン経
路への入り口は、Ｌ−アスパラギン酸で始まる（図１参照）。Ｌ−アスパラギン
酸自身は、オキサロ酢酸のアミノ基転移により産生される。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍの特殊な性質は、リシン中間体ピペリジン２，６−ジカルボキシレートを
二つの異なるルートで、すなわち、スクシニル化中間体に関する反応によってか
、またはジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの単一反応によって、ジアミノピ
メリン酸に変換するその能力である。全体的に見ると、経路への炭素流量は、２
点で調節される：第一に、Ｌ−スレオニンおよびＬ−リシン両方のレベルによる
アスパラギン酸キナーゼのフィードバック阻害によるもの、第二は、ジヒドロジ
ピコリン酸合成レベルの調節によるものである。従って、これら２つの酵素の活
性を調節解除および増加させることにより、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａにお
いてＬ−リシン産生を増加させ得る。

【０００５】Ｌ−リシン合成を導く生化学的経路に加えて、最近の証拠は、細胞から媒質へ
のリシン輸送に関する考察が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリシン過剰産生株の
開発において考慮されるべき別の条件であるということを示す。Ｋｒａｍｅｒお
よびその同僚による研究は、易漏出性の膜の性質の結果として起こる細胞からの
受動的輸送だけで、リシン流出が説明されるものではないことを示す；これらの
データは、以下のような性質を持つ特定のキャリアを示唆する：（１）トランス
ポーターは、リシンに対するかなり高いＫｍ値（２０ｍＭ）を有する；（２）ト
ランスポーターは、ＯＨ^-共輸送系（取り込み系は、Ｈ⁺対向輸送系である）およ
び（３）トランスポーターは正に荷電しており、膜電位が分泌を刺激する（Ｓ．
ＢｒｏｅｒおよびＲ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：１
３７−１４３（１９９１））。

【０００６】栄養要求性または抵抗性の性質について分離された様々な株を利用したいくつ
かの発酵プロセスが、Ｌ−リシン産生に関して当該分野において公知である：米
国特許第２，９７９，４３９号は、ホモセリン（またはメチオニンおよびスレオ
ニン）要求性の変異体を開示し；米国特許第３，７００，５５７号は、スレオニ
ン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、フェニル
アラニン、シスチン、またはシステインについて栄養要求性を有する変異株を開
示し；米国特許第３，７０７，４４１号は、リシンアナログに対して抵抗性を持
つ変異体を開示し；米国特許第３，６８７，８１０号は、Ｌ−リシン産生能力お
よびバシトラシン、ペニシリンＧまたはポリミキシンに対する抵抗性の両方を有
する変異株を開示し；米国特許第３，７０８，３９５号は、ホモセリン、スレオ
ニン、スレオニンおよびメチオニン、ロイシン、イソロイシンまたはそれらの組
み合わせについて栄養要求性を有し、かつリシン、スレオニン、イソロイシンま
たはそれらのアナログに対する抵抗性を有する変異体を開示し；米国特許第３，
８２５，４７２号は、リシンアナログに対する抵抗性を有する変異株を開示し；
米国特許第４，１６９，７６３号は、Ｌ−リシンを産生し、かつアスパラギン酸
アナログおよびサルファ剤の少なくとも一つに対して抵抗性であるＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍの変異株を開示し；米国特許第５，８４６，７９０号は、ビ
オチン作用抑制剤非存在化でＬ−グルタミン酸およびＬ−リシンを産生し得る変
異株が開示し；そして米国特許第５，６５０，３０４号は、４−Ｎ−（Ｄ−アラ
ニル）−２，４−ジアミノ−２，４−ジデオキシ−Ｌ−アラビノース、２，４−
ジデオキシ−Ｌ−アラビノースまたはその誘導体に対して抵抗性を持つ、Ｌ−リ
シンの産生に関して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属に分類される株を開示する。

【０００７】ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａのＬ−リシン発酵産生の分野における、より最
近の発展は、リシン産生を増大させるための分子生物学技術の使用と関連がある
。以下の例は、本技術の典型的な例として提供されるものである：米国特許出願
番第４，５６０，６５４号および同第５，２３６，８３１号は、Ｓ−（２−アミ
ノエチル）−システインに対して感受性のあるホストＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物に対して、Ｓ−（２−アミノ
エチル）−システインに対する抵抗性およびリシン産生能の両方を付与するＤＮ
ＡフラグメントをベクターＤＮＡに挿入した組み換えＤＮＡ分子を用いて形質転
換することにより得られるＬ−リシン産生変異株を開示し；米国特許出願第５，
７６６，９２５号は、ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ細菌（Ｌ−リシンおよびＬ−スレオ
ニンにより脱感作されるフィードバック阻害を有する）由来のアスパルトキナー
ゼをコードする遺伝子を、漏出型ホモセリンデヒドロゲナーゼを有するＣｏｒｙ
ｎｅｆｏｒｍ細菌、またはホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失したＣｏｒ
ｙｎｅｆｏｒｍ細菌の染色体ＤＮＡに組み込むことにより産生される変異株を開
示する。

【０００８】Ｌ−リシンに加えて、他のアミノ酸、例えば、分枝鎖アミノ酸であるＬ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリン産生にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍおよび関連生物が有用である。分枝鎖アミノ酸生合成に至る生化学的経路もま
た良く研究されている。アスパラギン酸経路への炭素流量は、Ｌ−イソロイシン
産生に利用されうる、Ｌ−リシンまたはＬ−スレオニン産生に送り込まれうる（
図１Ｂ）。５つの反応により、Ｌ−スレオニンからＬ−イソロイシンが産生され
る。すなわち、これらの反応を触媒する酵素には、次のものが含まれる。（１）
スレオニンデヒドラターゼ、（２）アセトヒドロキシ酸シンターゼ、（３）イソ
メロレダクターゼ、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、および（５）トラン
スアミナーゼＢ、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソロイシン合成特有
である、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素は、また他の分枝
鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。スレオニンから
イソロイシンへの炭素流量は、スレオニンデヒドラターゼおよびアセトヒドロキ
シ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）により制御される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍにおけるイソロイシン経路の酵素をコードする遺伝子（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，
ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤおよびｉｌｖＥ）クローニングを利用して（Ｃ．Ｃｏｒｄｅ
ｓら、Ｇｅｎｅ１１２：１１３−１１６（１９９２）；Ｂ．Ｍｏｅｃｋｅｌら
、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：８０６５−８０７２（１９９２）お
よび、Ｃ．Ｋｅｉｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５：５５
９５−５６０３（１９９３））、新規株を作製するために組み換えＤＮＡ技術を
適用し得る。

【０００９】分枝鎖アミノ酸生合成経路における酵素活性の向上によるアミノ酸、Ｌ−イソ
ロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの産生における発展について説明され
ている。さらに、ｉｌｖＢＮオペロンによりコードされるアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ（ＡＨＡＳ）活性の改善による分枝鎖アミノ酸産生における改善につい
て説明されている。（概要として、Ｈ．Ｓａｈｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．７８２：２５−３９（１９９６）を参照）。

【００１０】分枝鎖アミノ酸産生の例示的なプロセスには、次のものが含まれる。米国特許
第５，１８８，９４８号において、ポリケチドに対して抵抗性である微生物を利
用したＬ−バリン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第５，
５２１，０７４号において、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物を利用したＬ−バリン産生のためのプロセスが開
示されている。これらの微生物は、ａ）バリン産生能、ｂ）唯一の炭素源として
酢酸を含む培地中における、Ｌ−バリンに対する抵抗性、およびｃ）唯一の炭素
源としてグルコースを含む培地中における、ピルビン酸アナログに対する感受性
を示す。米国特許第４，６０１，９８３号において、コリネフォルム細菌におい
て複製可能で、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシン産生に使用されるホモセ
リンデヒドロゲナーゼ活性を持つ蛋白質産生をコードする遺伝子配列が開示され
ている。米国特許第４，４４２，２０８号において、組み換えＤＮＡ技術によっ
て得られた、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸抵抗性を持つＢｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を利用した、Ｌ−イソロ
イシン産生に対する発酵プロセスが開示されている。米国特許第４，６５６，１
３５号において、Ｌ−イソロイシン産生のためのプロセスが開示されている。こ
のプロセスには、メチルリシン抵抗性またはα−ケトマロン酸抵抗性を持ち、液
体培地中でＬ−イソロイシン産生し得、その液体培養液から蓄積したＬ−イソロ
イシンを回収しうるＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物の培養が含まれる。米国特許第５，１１８，６１
９号において、Ｄ−ラクテートを利用する変異体による、Ｄ，Ｌ−α−ヒドロキ
シブチレートからのＬ−イソロイシン発酵産生のための方法が開示されている。
米国特許第５，７６３，２３１号において、Ｌ−ロイシン産生のためのプロセス
が開示されている。このプロセスは、培養培地中でのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｉｃ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属株をインキュベーションする工程および、得られた細
胞をサッカリドおよび酢酸またはその塩と反応させて、反応溶液中でＬ−ロイシ
ンを形成かつ蓄積させる工程を包含する。および、米国特許第３，９７０，５１
９号において、ロイシンまたはそのアナログによるフィードバック阻害に対して
抵抗性を持ち、Ｌ−ロイシンを産生するための増殖栄養としてイソロイシン、ス
レオニンまたはメチオニンのうち少なくとも一つを必要とする株が開示されてい
る。

【００１１】バリン産生減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。

【００１２】ＡＨＡＳ活性減少によるアミノ酸産生の改善については記述されていない。

【００１３】（本発明の要旨）本発明の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物を提供す
ることである。変換効率は次の式により定量され得る。すなわち、［（ｇ産生されたアミノ酸／ｇ消費されたデキストロース）×１
００］＝パーセント収率およびデキストロースからの収率として表される。

【００１４】ある実施形態において、本発明は、変異誘発により一つ以上の分枝鎖アミノ酸
合成に対して栄養要求性に改変され、所望するアミノ酸に対して、親株よりも高
いパーセント収率を生じるという能力について選択された微生物を提供する。

【００１５】より具体的な、ランダム化学変異誘発に親株を供することにより得られた微生
物を提供する本発明の実施形態において、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求
性である変異誘発された変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換
可能な変異株を選択する。別の具体的な本発明の実施形態は、ｉｌｖＢＮオペロ
ンの核酸配列における改変（すなわち、変異）を導入するために、ｒＤＮＡ法を
利用し、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性またはブラディトローフである
変異誘発変異体を単離し、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよ
びＬ−バリン以外のアミノ酸へ、親株よりも非常に効率よく変換可能な改変体を
選択して得られる微生物を提供する。

【００１６】好適な実施形態において、本発明微生物はＬ−リシンを産生する。その他の好
適な本発明の実施形態は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物、またはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物を指向し、そして特に好適な微生物は、Ｌ−リ
シンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ微生物である。最も好適な実施形態において、微生物は、ＮＲＲＬ番号Ｂ
−３０１４９（ＬＣ１０としても知られている）またはＮＲＲＬ番号Ｂ−３０１
５０（ＢＦ１００−１０３０としても知られている）という同定特徴を有し、こ
れらの株は、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５Ｎｏｒｔｈ
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１
６０４ＵＳＡに１９９９年６月２９日に寄託された。

【００１７】本発明の別の目的は、親株の変異誘発、一つ以上の分枝鎖アミノ酸合成に対す
る栄養要求性である細胞の選択、および所望するアミノ酸の親株よりも高いデキ
ストロースからのパーセント収率で産生する分枝鎖アミノ酸栄養要求性の選択に
よりアミノ酸産生を増加させる方法を提供する。

【００１８】好適な実施形態において、本方法は、ランダム化学変異誘導または組み換えＤ
ＮＡ（ｒＤＮＡ）技術を用いて一つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシ
ンまたはバリンに対して栄養要求性またはブラディトローフであるように改変さ
れたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養から得られる、デキストロースから
のアミノ酸Ｌ−リシンの収率の向上を指向する。

【００１９】１つの特定の実施形態において、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍの化学変異誘発の結果である。代替の具体的な実施形態にお
いて、分枝鎖アミノ酸栄養要求性は、ｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペロンの
変異誘発の結果である。

【００２０】本発明の別の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロ
イシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物によ
るアミノ酸産生プロセスを提供することである。

【００２１】ある実施形態において、本発明は、培地中での、分枝鎖アミノ酸合成に対して
栄養要求性またはブラディトローフであるように親株を誘発し、そして、親株よ
りも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ
−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することより得られた微生物
を培養する工程を包含するアミノ酸産生プロセスを提供する。

【００２２】本プロセスの好適な実施形態において、親株をランダム化学変異誘発に供し、
分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である変異を誘発された改変体を単離し
、そして親株よりも非常に効率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロ
イシンおよびＬ−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することによ
り、発酵に利用される微生物が得られる。本プロセスにおけるその他の好適な実
施形態において、ｒＤＮＡ法によりｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオチド配列を変
化させ（つまり、変異の導入）、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性または
ブラディトローフである変異を誘発された変異体を分離し、親株よりも非常に効
率よく、グルコースを、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリン以外
のアミノ酸へ変換し得る改変体を選択することにより、発酵に利用される微生物
を得る。

【００２３】前記の一般的記述および次の詳細な記述は例示的であり、かつ例示のみであり
、特許請求の範囲のとおりの本発明のさらなる説明を提供することを意図される
ことが理解されるべきである。

【００２４】（好適な実施形態の詳細な説明）（１．定義）明細書および特許請求の範囲の明確で矛盾のない理解を提供するために、これ
らの語が使われるべき範囲を含めて、次の定義を提供する。

【００２５】栄養要求性株：本明細書中で使用される場合、栄養要求性株なる語は、増殖す
るために、獲得遺伝的欠損のために合成不可能な、特定の代謝物質の外的な源を
必要とする微生物株を意味する。

【００２６】アミノ酸補充：本明細書中で使用される場合、「アミノ酸補充」なる語は、成
長に必要とされ、栄養要求性成長を助けるために最小培地に添加されるアミノ酸
を意味している。

【００２７】ブラディトローフ：本明細書中で使用される場合、ブラディトローフなる語は
、特異的な代謝物質の外的な源がない状態において遅い成長を示す微生物株を意
味している。ブラディトローフ微生物は、代謝物質を合成しうるが、獲得遺伝的
欠損のために、合成速度が親株での同じ代謝物質の合成速度よりも遅い。

【００２８】分枝アミノ酸：本明細書中で使用される場合、この語は、ロイシン、イソロイ
シンおよびバリンなど、Ｒ基が分枝した炭素構造を持つアミノ酸を意味している
。

【００２９】炭素流動：本明細書中で使用される場合、この語は、生体内の両方向性、異化
作用性および／または同化作用性の生化学的合成的経路の間の炭素の移動を意味
している。

【００３０】染色体組込み：本明細書中で使用される場合、この語は、外因性ＤＮＡ断片の
、宿主生物染色体への挿入を意味している。より具体的には、この語は、外因性
ＤＮＡ断片と宿主細胞染色体との適切な領域間の相同的組み換えを意味するもの
として使用される。

【００３１】高収率誘導体：本明細書中で使用される場合、この語は、その誘導体が由来す
る親株と比較した場合、高い収率で、デキストロースから特異的なアミノ酸を産
生する微生物株を意味している。

【００３２】変異：本明細書中で使用される場合、この語は、目的のヌクレオチド配列にお
ける、単一塩基対変化、挿入または欠失を意味している。

【００３３】オペロン：本明細書中で使用される場合、この語は、構造遺伝子および調節エ
レメントを含む、ＤＮＡにおける細菌遺伝子発現および調節の単位を意味してい
る。オペロンに含まれる調節エレメントの例には、プロモーターおよびオペレー
ターが含まれるがこれに限定されない。

【００３４】親株：本明細書中で使用される場合、この語は、本発明の微生物を得るために
ある形態の変異誘発に供される微生物株を意味している。

【００３５】デキストロースからの収率パーセント：本明細書中で使用される場合、この語
は、次の式で定義されるデキストロースからのアミノ酸収率を意味している。す
なわち、［（ｇ産生されたアミノ酸／ｇ消費されたデキストロース）×１００］＝％
収率、である。

【００３６】表現型：本明細書中で使用される場合、この語は、微生物の遺伝的構成に依存
した、識別できる形質的特徴を意味している。

【００３７】相対的成長：本明細書中で使用される場合、この語は、規定された期間にわた
って、規定された培養液中で、親株の成長と子孫株の成長を直接的に比較するこ
とによって、成長の評価を提供する測定を意味している。

【００３８】変異誘発：本明細書中で使用される場合、この語は、ＤＮＡにおいて変異が発
生するプロセスを意味している。「ランダム」変異誘発を用いて、変異の正確な
部位を予想することはできず、微生物ゲノムのどこでも起こり、また、放射線照
射または化学処理などの因子により引き起こされる物理的損傷の結果として変異
が引き起こされる。ｒＤＮＡ変異誘発は、クローニングされた目的のＤＮＡを指
向し、それはランダムまたは部位特異的なものでありうる。

【００３９】（２．分枝鎖アミノ酸合成に対する炭素流量の減少、および非分枝型アミノ酸
産生の増加に基づいた本発明の微生物）本発明は、概して、炭素流動を非分枝鎖アミノ酸合成に向けるために、分枝鎖
アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の作製を提供する。より具体的に
、ロイシン、イソロイシンまたはバリンなどの、一つ以上の分枝鎖アミノ酸（例
えば、イソロイシンおよびバリン）を必要とする特異的な栄養要求性表現型を選
択するか、またはイソロイシン、ロイシンおよびバリン合成への炭素流量を減少
させるｉｌｖＢＮオペロンにおける変異を設計することにより、この系の炭素流
動を、他の代謝経路（例えば、Ｌ−リシン合成）で利用できるようにし得る。

【００４０】１つの特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃを
提供する。ここで、この微生物Ｃは、次の方法によって得られる：（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物
Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学変異誘発；および（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂ
を産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工
程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリ
ンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならび
に（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘ
を産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚ
パーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、を包含する方法。

【００４１】デキストロースからの収率パーセントは、好適には、式［（ｇ産生されたア
ミノ酸／Ｌ／ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）×１００］を用いて計算
される。

【００４２】親微生物は、アミノ酸Ｘを産生しうる、当該分野で既知の任意の微生物からも
選択されうる。特に好適な親微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍおよび
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍである。

【００４３】本発明の株は、当業者にとって既知で利用可能な任意の方法および技術によっ
ても、調製され得る。本発明細菌株の構築に適した方法の例には、次のものが含
まれるが、これに限らない：Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（ＮＴＧ）のような適した薬剤を用いた変異誘発；線状ＤＮＡ断片の形質転換
および相同的組み換えを介した遺伝子組込み技術；およびバクテリオファージを
介した形質導入。これらの方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｊ．
Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１
９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎＢａ
ｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，
ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｇｅ
ｎｅｓ＆Ｇｅｎｏｍｅｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅＢｏｏｋ
ｓ，ＭｉｌｌＶａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二
版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ
ｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；
Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒａ
ｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭ
ｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ
（１９９５）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋお
よびＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ
，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；およびＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
，ＴｈｅＧｕｉｌｆｏｒｄＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（１９８９
）において説明されている。

【００４４】（Ａ．ランダム変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の構築）本発明のある具体的で好適な実施形態により、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシ
ンおよびＬ−バリン生合成に共通の酵素的ステップの改変が、デキストロースか
らのＬ−リシンのパーセント収率を向上させ得ることを提供する。

【００４５】最も好適な実施形態において、本発明は、親株に対するランダム変異誘発を行
い、その後特定の表現型を選択することより、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養
要求性である微生物の産生を提供する。変異誘発を行うために選択した親株は、
目的のアミノ酸を産生することが知られている任意の株でもあり得る。好適な生
物には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ株が含まれ、最も好適な生物には、Ｌ−リシンを産生するＣｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が含まれる。

【００４６】親株は、当該分野で既知の任意のランダム変異誘発を用いて、変異誘発され得
る。これには、放射線照射および化学的方法が含まれるがこれに限らない。特に
好適なものは、ランダム化学的変異誘発であり、最も好適なものは、Ｊ．Ｈ．Ｍ
ｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（１９７２））によって記述されているアルキル化剤法である
。

【００４７】例として、次のように化学的変異誘発を行った。リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ株の培養は、富化培地中で、３０℃にて、吸光度が６．０に達す
るまで行った。細胞を、最小培地で洗浄し、１００ｍｇ／ｍｌのＮＴＧを含む最
小培地で再懸濁した。細胞を、突然変異原に、３０℃で３０分間曝露した。細胞
を最小培地で洗浄し、富化培地に播種した。富化培地および最小培地上に、富化
培地で生じたコロニーのレプリカをとった。富化培地上で生育したが最小培地上
では生育しなかったコロニーを、栄養要求性株として分類した。栄養要求性変異
体に対して、最小培地および、１０ｍＭＬイソロイシンおよび１０ｍＭＬ−バリ
ンを含む最小培地上にレプリカをとった。イソロイシンおよびバリンによりレス
キューされたコロニーを、バリン栄養要求性株として分類した。株Ｂ４Ｂは、化
学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株である。

【００４８】（Ｂ．ｒＤＮＡ方法論を介した変異誘発による分枝鎖アミノ酸栄養要求性株の
構築）本発明のその別の具体的な好適な実施形態は、分枝鎖アミノ酸の生合成に重要
なタンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ配列のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ変異誘発をもたらすために、組み換えＤＮＡ技術を利用する。次い
で、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性で、親株よりも高収率でデキストロ
ースから非分枝鎖アミノ酸を産生する変異株を作製することを目的として、親株
を改変するために変異されたＤＮＡを使用し得る。

【００４９】ある具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡが、当該分野
で既知の任意の方法によっても組み換えＤＮＡ技術を介して変異され得る。当業
者によって既知であろうように、クローン化ＤＮＡにおける変異は、単一のヌク
レオチド変化（点変異）、多重ヌクレオチド変化、ヌクレオチド欠損または挿入
を含み得る。組み換えＤＮＡ技術の一般的方法は、当業者により既知であり、例
えば、核酸精製、制限酵素消化、ライゲーション、遺伝子クローニング、遺伝子
配列決定、遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）などの基礎技術を
記載する多くの一般の実験マニュアルにおいて見出され得る。（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９８９）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｂｅｌら編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ，（１９９４）；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＰＣＲプロトコ
ール）、Ｉｎｎｉｓら、編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ，４０７−４１５頁（１９９０）を参照すること。）さらに、クローン化ＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ変異誘発を具体的に示す参考文
献は、当業者により既知である。例えば、部位指向性変異誘発、オリゴヌクレオ
チド指向性変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、ｉｎｖｉｔｒｏにおけ
るランダム化学的変異誘発、カセット変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびその他の
方法が、ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９１）において詳しく説
明されている。

【００５０】別の具体的な好適な実施形態において、目的のクローン化ＤＮＡは、ホスト細
胞において、ｉｎｖｉｖｏで変異を起こし得る。このタイプの「ｉｎｖｉｖ
ｏ変異誘発」には、一つ以上のＤＮＡ修復経路に変異を持つＥ．ｃｏｌｉ株のＤ
ＮＡの増殖によって、目的の任意のクローン化ＤＮＡにおけるランダム変異を作
り出すプロセスが含まれる。これらの「変異誘発遺伝子（ｍｕｔａｔｏｒ）」株
は、野生型の親株よりも高いランダム変異頻度を持つ。これらの株の一つにおけ
るＤＮＡの生育により、ＤＮＡ中でランダム変異が作り出される。これを行うた
めに設計された系は、当業者にとって既知であり、そして商業的に利用し得る。
例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．により、そのＤＮＡ修復遺伝子（Ｍｕ
ｔＨ，ＭｕｔＬおよびＭｕｔＳ）が欠失され、その結果短時間で多くの異なる変
異が起こるＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１ＲｅｄＳｔｒａｉｎを利用した系が提供さ
れる。１０，０００までの変異が３０時間に起こり得、その結果当該分野で既知
の方法により変異ＤＮＡから完全な変異ＤＮＡライブラリーを用意し得る。

【００５１】変異のために選択されたクローン化ＤＮＡは、分枝鎖アミノ酸合成に重要であ
るとして当該分野で既知である任意の配列でもあり得る。その配列には、合成に
重要な一つ以上の酵素、または輸送および排出に重要な一つ以上のタンパク質産
物をコードする配列が含まれるがそれに限らない。最も好適なものは、Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペ
ロンの、クローン化配列である。分枝鎖アミノ酸合成に関係するＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子がクローニングされている。例えば、イソロイシン経路
に対して遺伝子配列が利用できる（ｉｌｖＡ，ｉｌｖＢ，ｉｌｖＣ，ｉｌｖＤお
よびｉｌｖＥ）。（Ｃ．Ｃｏｒｄｅｓら、Ｇｅｎｅ１１２：１１３−１１６（１
９９２）；Ｂ．Ｍｏｃｋｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：８０
６５−８０７２（１９９２）；およびＣ．Ｋｅｉｌｈａｕｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５：５５９５−５６０３（１９９３））。

【００５２】Ｌ−スレオニンから、５つの反応でＬ−イソロイシンが産生される。これらの
反応を触媒する酵素は、（１）スレオニンジヒドラターゼ（ｉｌｖＡ）、（２）
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢ）、（３）イソメロレダクターゼ（ｉ
ｌｖＣ）、（４）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、および（５）ト
ランスアミナーゼＢ（ｉｌｖＥ）、である。スレオニンデヒドラターゼは、イソ
ロイシン合成に特有な、この経路における唯一の酵素である。他の４つの酵素は
また、他の分枝鎖アミノ酸、バリンおよびロイシン産生においても利用される。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株におけるイソロイシン生合成に関係する酵素
経路は図２で表される。

【００５３】アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびイソメロレダクターゼ（Ｉ
Ｒ）は、イソロイシン、バリン、ロイシンおよびパントテナートに対して、代謝
物の流れにおいて続いて起こる反応を触媒する。他の細菌でのように、Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株のＡＨＡＳは、二つの遺伝子ｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ
によりコードされている。遺伝子分断により、これらの遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍにおいて単一のＡＨＡＳ活性をコードしていることが実証された（
Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ，Ｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７５：５５９５
−５６０３（１９７３））。３．９，２．３および１．１ｋｂの３個の転写産物
が、ノーザンブロット解析により、ｉｎｖｉｖｏで同定された。それらは、そ
れぞれｉｌｖＢＮＣ、ｉｌｖＮＣ、ｉｌｖＣメッセンジャーと対応する。ｉｌｖ
Ｃ転写産物（ＩＲをコードする）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｉｌｖオペロ
ンからの最も量の多い転写産物である。さらなる解析により、このオペロンで３
個のプロモーターが活性であること、ｉｌｖＢＮＣおよびｉｌｖＮＣメッセンジ
ャーの定常レベルが著しく単一ＡＨＡＳの全体としての活性に寄与していること
が示されている。

【００５４】最も好適な本発明の実施形態において、クローン化ｉｌｖＢＮオペロンＤＮＡ
配列内で欠損を作り出すことを目的として、制限酵素消化により、変異を作製し
得る。次に、変異誘発されたｉｌｖＢＮ配列を、相同的組み換えにより、野生型
配列と置き換え、分枝鎖アミノ酸に対する栄養要求性に関してスクリーニングし
得る。

【００５５】その他の本発明の実施形態は、一つ以上の分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイ
シンおよびバリンに対する栄養要求性を示し、そしてデキストロースから、親株
のパーセント収率よりも高い、目的のアミノ酸のパーセント収率を産み出す微生
物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに引き出される。特に好適な実施形態におい
て、産生されるアミノ酸は、Ｌ−リシンである。

【００５６】本発明の他の非常に好適な実施形態は、実質的にＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１
４９またはＮＲＲＬ受託番号Ｂ−３０１５０の性質全てを持つ微生物に引き出さ
れる。

【００５７】（３．アミノ酸の産生を増加させる方法）本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生を増加させる方法を提供する
。本発明は、アミノ酸Ｘの産生を増加させる方法を広く提供する。その方法が以
下：（ａ）デキストロースから上記アミノ酸をパーセント収率Ｙで産生する親微生
物Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学的変異誘発；およひ（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物
Ｂを産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工
程であって、該微生物Ｂは、１つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシン
およびバリンについて栄養要求性である、工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）から、パーセント収率Ｚでデキストロースから上記アミノ酸
Ｘを産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択することであって、ここで上記パ
ーセント収率Ｚは、上記パーセント収率Ｙよりも大きい、工程、を包含する。

【００５８】ある特に好適な実施形態において、デキストロースから決定されたパーセント
収率で目的のアミノ酸を産生する、該当分野で既知である任意の株が、親株とし
て選択され得る。デキストロースからのパーセント収率は、次の式を用いて簡便
に計算され得る［（ｇアミノ酸／Ｌ／（ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）］×
１００。

【００５９】この生物を選択し、アミノ酸のデキストロースからの（パーセント収率を決定
した後、好適には、生物のゲノム全体に指向されたランダム変異誘発技術、また
は目的のクローン化ＤＮＡに対して指向されるｒＤＮＡ技術、のいずれかにより
、変異誘発に供される。用いた変異誘発の特定の方法に関わらず、変異された生
物をスクリーニングし、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性に基づいて選択
される。次いで、どの株がデキストロースから所望されるアミノ酸を親株よりも
高いパーセント収率で産生するかを決定するために、選択された栄養要求性株を
スクリーニングし得る。

【００６０】本発明の種々の実施形態は、生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ，およびＥ．ｃｏｌｉ．から目的のアミノ酸産生を増加さ
せる方法を含む。さらに、特定の実施形態に依存して、本発明は、グリシン；ア
ラニン；メチオニン；フェニルアラニン；トリプトファン；プロリン；セリン；
スレオニン；システイン；チロシン；アスパラギン；グルタミン；アスパラギン
酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン；およびヒスチジンなどの非分枝鎖アミ
ノ酸の産生を増加する方法を提供する。

【００６１】好適な実施形態において、本発明は、分枝鎖アミノ酸合成に対する栄養要求性
株を作り、炭素の流れをロイシン、イソロイシンおよびバリンの合成から転用す
ることによって非分枝鎖アミノ酸産生を増加する方法を提供する。特に好適な実
施形態は、変異誘発された親株から、バリンおよびイソロイシン合成に対して栄
養要求性である株を選択することによってアミノ酸の産生を増加する方法に引き
出される。

【００６２】本発明は、アミノ酸の生産を増加するための方法について、種々の好適な実施
形態をさらに提供し、ここで親株は、ランダムな変異誘発技術（例えば、放射線
変異誘発または化学物質変異誘発）、またはｒＤＮＡ技術によるｉｌｖＢＮオペ
ロンの変異誘発のいずれかにより、変異誘発され得る。１つの特定の好適な実施
形態において、親株は、ランダムな化学物質変異誘発により変異誘発され得る。
別の特定の好適な実施形態では、親株はクローン化されたｉｌｖＢＮオペロンの
ヌクレオチド配列に指向されたｒＤＮＡ技術によって変異誘発される。

【００６３】（４．アミノ酸の産生のためののプロセス）本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。
本発明は、一般的にアミノ酸Ｘの産生のためのプロセスを提供し、これは以下を
含む：アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、上記プロセスは、以下：（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで上記微生物Ｃは、以
下の方法：（ｉ）デキストロースからパーセント収率Ｙの上記アミノ酸を産生する親
微生物Ａを選択すること；（ｉｉ）以下：（１）ランダム化学的変異誘発；および（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、からなる群から選択される方法により、上記親微生物Ａを変異誘発して、微生物
Ｂを産生させること；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを
選択する工程であって、上記微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシ
ンおよびバリンの１つ以上について栄養要求性である、こと；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から少なくとも１つの微生物Ｃを選択することで
あって、上記微生物Ｃは、上記アミノ酸Ｘをデキストロースからパーセント収率
Ｚで産生し、ここで上記パーセント収率Ｚは、パーセント収率Ｙより大きい、こ
と；により得られる、工程；ならびに（ｂ）上記微生物Ｃから産生される上記アミノ酸Ｘを回収する工程、を包含する。

【００６４】本発明の好適な実施形態は、培養される微生物を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉ
ｒｕｍ、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉを含む群から選択す
るプロセスに引き出される。特に好適であるのは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｒ
ｕｍ属の生物に引き出されるプロセスである。本発明プロセスのために選択され
る微生物は、目的のアミノ酸、特に非分枝鎖アミノ酸を産生するものである。さ
らに特に好適な微生物は、グリシン；アラニン；メチオニン；フェニルアラニン
；トリプトファン；プロリン；セリン；スレオニン；システイン；チロシン；ア
スパラギン；グルタミン；アスパラギン酸；グルタミン酸；リシン；アルギニン
；およびヒスチジンを産生する微生物である。選り抜きのアミノ酸の産生レベル
は、デキストロースからのパーセント収率を計算する以下の式によって簡便に決
定し得る［（ｇアミノ酸／Ｌ／（ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）］×１
００。

【００６５】本発明のプロセスにおいて使用される微生物は、選択される親株の変異誘発に
よって好適に得られる。本発明の好適な実施形態は、ゲノム全体に指向されるラ
ンダム変異誘発、または目的のクローン化されたＤＮＡのｒＤＮＡ変異誘発に、
選択された親株が供されるプロセスを含む。本発明の特に好適な実施形態において、親株は放射線処理、または化学物質処理
による変異誘発を含むがそれに限定されない、ランダム変異誘発に供される。よ
り特に好適な実施形態は、親株のランダム化学変異誘発に引き出される。本発明の別の特に好適な実施形態は、親株のｒＤＮＡ変異誘発を提供する。より
特に好適な実施形態は、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおけるｉｌｖ
ＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発に引き出される。変異誘発されたｉｌｖＢＮオ
ペロンまたはそのフラグメントの変異された形態は、当業者に周知である相同的
組み換え技術を介して野生型のｉｌｖＢＮオペロン配列と置き換えられ得る（実
施例６を参照のこと）。しかし、選択された親株またはクローン化されたＤＮＡ配列は、変異誘発され、
その結果として生ずる子孫は分枝鎖アミノ酸合成（すなわち、ロイシン、イソロ
イシンまたはバリン）の栄養要求性に関してスクリーニングされ、そして選択さ
れる。そのような変異体の選択は当業者に周知である。特に好適な実施形態は、
バリンおよびイソロイシンの生合成に対する栄養要求性株に引き出される。最終的には、本発明のプロセスの微生物の選択は、選り抜きのアミノ酸の産生に
依存する。デキストロースからのパーセント収率を決めるために、式［（ｇア
ミノ酸／Ｌ／ｇ消費されたデキストロース／Ｌ）］×１００の式を利用し
、所望する微生物が、選り抜きのアミノ酸のデキストロースからのパーセント収
率が親株よりも高い点に基づいて選択される。

【００６６】本発明の他の実施形態は、本発明の微生物を培養する特定の方法により変更す
るプロセスに引き出される。従って、アミノ酸産生に引き出される本発明プロセ
スにおいて行われ得る、種々の発酵技術が周知である。適切な炭素源の例示的な例には、グルコース、フルクトース、スクロース、デン
プン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜のような炭水化物；酢酸
、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸およびフマル酸のような有機酸；お
よびグリセロールのようなアルコールが含まれるが、その限りではない。適切な窒素源の例示的な例としては、アンモニアガスおよび液体アンモニアを含
むアンモニア；塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよ
び酢酸アンモニウムのような無機酸または有機酸のアンモニウム塩；ならびに、
肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズ
固形加水分解産物および酵母抽出物を含む他の窒素含有物が挙げられるがその限
りではない。

【００６７】一般的に、アミノ酸は商業的に本発明からバッチ型または流加型などの発酵プ
ロセスにおいて産生され得る。バッチ型発酵において、発酵の開始時に全ての栄
養素を添加する。流加型発酵または広い意味での流加型発酵においては、一つま
たは多数の栄養素を、発酵開始すぐ、または培養がある一定の状態に達した後、
または、添加される栄養素が培養液から使い果たされたとき、培養液に連続的に
補給される。広義の流加型発酵のバッチの改変には、繰り返し流加型、またはフ
ィルアンドドロー（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ）発酵があり、発酵槽の内容物
の一部をある時点（例えば、発酵物が満たされたとき、栄養物の補給が続けられ
ている間）で除去する。この方法において、発酵をより長時間に延長し得る。

【００６８】発酵の別の型、連続的発酵、またはケモスタット培養は、完全培地の連続補給
を使用するが、その一方で、発酵物におけるブロスの体積をほぼ同じに保つよう
な方法で培養液を連続的または半連続的に回収する。連続的発酵は、原則的には
、無限に維持され得る。

【００６９】バッチ発酵において、培地中の必須栄養素のうちの一つが消費されつくすまで
、または発酵状態が不適当になるまで（例えば、ｐＨが、微生物増殖を抑制する
値にまで低下する）生物は増殖する。流加型発酵において、通常、適切な増殖条
件を維持するために、例えばｐＨコントロールを用いて測定を行い、そして一つ
以上の必須栄養素が、消費されつくされることを防ぐために、これらの栄養素を
培養液中に供給する。微生物は、栄養素補給の割合により規定された増殖速度で
増殖し続けるだろう。一般的に、単一栄養素は、殆どの場合炭素源であるが、増
殖を制限するものとなるであろう。同じ原理は、連続発酵にも適用され、通常、
培地中の単一栄養素は限られており、全ての他の栄養素は過剰である。限られた
栄養素は、培養液体中に非常に低い濃度、しばしば、測定不能である程低濃度で
存在するであろう。異なる型の栄養素制限が使用され得る。炭素源制限はもっと
も頻繁に使用される。他の例としては、窒素源による制限、酸素による制限、ビ
タミンまたはアミノ酸のような特定の栄養素による制限（微生物がそのような化
合物について栄養素要求性の場合）、硫黄による制限および亜リン酸による制限
がある。

【００７０】アミノ酸は当業者に周知の方法によって回収され得る。例示的な手順は、Ｖａ
ｎＷａｌｓｅｍ，Ｈ．Ｊ．＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．５９：１２７−１３２（１９９７）および米国特許第３，５６５，
９５１号で提供される。両文献とも本明細書中で参考として援用される。

【００７１】本明細書中に引用される全ての特許および刊行物は明確に参考として援用され
る。

【００７２】（実施例）（実施例１）（化学的変異誘発およびバリン栄養要求性株の選択）リシン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＦ１００を、Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｊ．Ｈ．１９７２（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９７２Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｃｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で記載されているように、アルキル化剤に
より、変異誘発を行った。最小培地（ＭＭ）上にコロニーのレプリカを取った。
ＭＭ上で増殖しなかったが完全培地（ＣＭ）で増殖したコロニーを栄養要求性株
として同定した。Ｌ−バリンおよびＬ−イソロイシンを補給した場合ＭＭ上で成
長可能なそれらの栄養要求性株を、リシン収率解析を行うために選択した。

【００７３】ＭＭは、１リットル中の、２０ｇのＤ−グルコース、１０ｇの硫酸アンモニウ
ム、２．５ｇの尿素、１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇのＭｇＳＯ₄，７Ｈ₂Ｏ・１ｇ
のＮａＣｌ、０．０１ｇのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
、１０ｍｇのパントテン酸、５０ｍｇのビオチン、２００ｍｇのチアミン、およ
び５０ｍｇのナイアシンアミドから構成され、ｐＨ７．２であった。Ｌ−アミノ
酸をＭＭの補助剤として用いた場合、５０ｍｇ／Ｌのそれぞれのアミノ酸を使用
した。ＭＭＩＶは、イソロイシンおよびバリンを添加したＭＭであった。

【００７４】親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した最小寒天培地上で化
学的変異誘発によって産み出された高収率誘導体は、表１で示す。補助剤は、５
０ｍｇ／ＬＬ−アミノ酸であった。成長は、３０Ｃにて３日後の相対的コロニ
ーサイズとして示す。

【００７５】（実施例２）（ｒＤＮＡ技術を用いた分枝鎖栄養要求性株の産生）（１．欠損ｉｌｖＢ遺伝子の調製）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ＡＴＣＣ
２１７９９）のｉｌｖＢＮオペロンをＰＣＲで増幅し、ｐＡＬ２０３を作製する
ためにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローニングした。ｉｌｖＢ遺伝子には、２つの
ＥｃｏＮＩ制限酵素部位により挟まれた３９０ｂｐの領域が含まれる。ＥｃｏＮ
Ｉは、プラスミドｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔを切断しない。ＥｃｏＮＩを用いてプラ
スミドｐＡＬ２０３を切断し、ｐＡＬ２０３ｄｅｌｔａを回収するようにセルフ
ライゲーションさせることにより、ｉｌｖＢ欠損対立遺伝子を設計した。

【００７６】（２．改変ｉｌｖＢＮ対立遺伝子のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体へ
の相同的組み換え）二重交差による対立遺伝子交換のためのベクターを、Ｍａｌｏｙら、１９９６
（ＭａｌｏｙＳ．Ｒ．，ＳｔｅｗａｒｔＶ．Ｊ．，およびＴａｙｌｏｒＲ．
Ｋ．１９９６ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉ
ｃＢａｃｔｅｒｉａ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）により記述されているように構築し
た。ＡＴＣＣ３７７６６は、Ｅ．ｃｏｌｉ．中で複製するが、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ中では複製しないプラスミド、ｐＫ１８４の元となるものであっ
た。ｓａｃＢ遺伝子をｐＪＣ３に挿入するために、ＳｓｐＩ部位にサブクローニ
ングした。ｐＪＣ３は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製し得ない。ど
のカナマイシン耐性コロニーも、相同的組み換えによりクローニングされた遺伝
子内の部位に相同的組み換えを行うことにより染色体へ導入されたベクターを有
する。導入されたベクターにおけるｓａｃＢ遺伝子の致死発現により、スクロー
ス存在下での成長が阻害される。スクロース存在下での成長には、クローニング
された挿入断片の相同的領域に沿って生じる第二の交差が必要とされる。第一お
よび第二の交差が、改変（欠損、部位突然変異）に隣接する場合、ｉｌｖＢＮの
改変対立遺伝子は、宿主株の染色体上に存在する対立遺伝子と交換される。

【００７７】ｐＡＬ２０３Δ由来のｉｌｖＢＮオペロンの改変対立遺伝子を、導入ベクター
ｐＪＣ３にサブクローニングし、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのＢＦ１００
株に対して電気穿孔法を行い、スクロースを欠いているがカナマイシンを含むリ
ッチ培地（ＤＭＫ）プレートに播種した。コロニーを採取し、スクロースおよび
カナマイシンを含まないリッチブロス中で４８時間成長させた。培養液を、カナ
マイシンを欠くがスクロースを含むリッチプレート上に、ストリークした。シン
グルコロニーをスクロースプレートから採取し、ＤＭＫ，ＳＭ１，ＭＭおよびＭ
ＭＩＶプレート上に、レプリカを取った。スクロース上で成長し得るもので、Ｍ
Ｍ上では成長し得ないがＭＭＩＶ上で成長可能であるカナマイシン耐性を持たな
いコロニーを選択し、フラスコでの実験へと進めた。ＬＣ１０は、ＢＦ１００由
来栄養要求性株である。

【００７８】親株の成長パターンおよび、３種類のアミノ酸を補給した一連の最小寒天プレ
ート上での組み換えＤＮＡ法を用いて産生した高収率誘導体を、表２に示す。補
助剤は、５０ｍｇ／ＬのＬ−アミノ酸である。成長は、３０Ｃにて３日後の相対
的コロニーサイズとして示す。

【００７９】（実施例３）（ランダム化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−
リシン収率の震盪フラスコ培養による分析）ＳＭ１プレートからシングルコロニーを拾い、ＳＭ１ブロスに移すことにより
Ｂ４Ｂ種菌を調製した。ＳＭ１は、水１Ｌ中に、５０ｇスクロース、３ｇＫ₂Ｈ
ＰＯ₄、３ｇ尿素、０．５ｇＭｇＳＯ₄，７Ｈ₂０、２０ｇポリペプトン、５ｇビ
ーフ抽出物、０．９ｍｇＤ−ビオチン、３ｍｇチアミン、１２５ｍｇナイアシン
アミド、０．５ｇＬ−メチオニン、０．２５ｇＬ−スレオニン、０．５ｇララニ
ンを混合して調製し、ｐＨ７．３に調整した。プレートには２０ｇ／Ｌの寒天が
含まれていた。ＳＭ１ブロス中で成長培養を１６時間行った後、等容量の３０％
グリセロールを添加し、培養液を−８０Ｃにて凍結した。

【００８０】２０ｍｌのＳＦＭが入ったバッフル付き２５０ｍｌシード震盪フラスコに、０
．１ｍｌの解凍種菌を播種した。播種培地（ＳＦＭ）は、水１Ｌ中の、６０ｇ
Ｄ−グルコース、３ｇＫ₂ＨＰＯ４、３ｇ尿素、０．５ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ ₂ Ｏ、２０ｇポリペプトン、５ｇビーフ抽出物、３ｍｇＤ−ビオチン、１
２５ｍｇナイアシンアミド、０．５ｇＬ―メチオニン、０．２５ｇＬ−ス
レオニン、および０．５ｇＬ−アラニンで構成され、ｐＨ７．３に調整した。
培養物は、３０Ｃにて、１６時間成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通
気した。種培養のうち２ｍｌを、２１ｍｌの発酵培地（ＦＭ４）の播種に使用し
た。ＦＭ４培地は、１６ｍｌの主要培地と５ｍｌのデキストロースストックを混
合して調製した。デキストロースストックは、１８０ｇＤ−グルコースに５０
０ｍｌの水を添加して調製した。主要培地には、１Ｌ中に、０．０８３ｇのＭｎ
ＳＯ₄、０．４ｍｇＤ−ビオチン、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅ
ｅｐｌｉｑｕｏｒ）、ラフィネートおよび５０ｇのＣａＣＯ₃が含まれていた
。ＦＭ４の最終容量が４％の乾燥固体になるようにコーンスティープを添加した
。ＦＭ４の最終容量が５％硫酸アンモニウムになるようにラフィネートを添加し
た。３０Ｃにて、４８時間、２５０ｍｌのバッフル付き震盪フラスコで、培養物
を成長させ、２４０ｒｐｍで２インチの変位で通気を行った。

【００８１】表３にて、震盪フラスコ中での、バリンおよびイソロイシン要求性に対する選
択により向上させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生で
のデータを示す。

【００８２】（実施例４）（ｒＤＮＡ法により作製されたバリン栄養要求性株からの、Ｌ−リシン収率の
震盪フラスコ測定）表４にて、震盪フラスコ中での、ｉｌｖＢＮオペロンの染色体コピーから３９
０塩基対のＤＮＡ配列のを欠失させることにより改善したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ株によるＬ−リシン産生におけるデータを示す（実施例２参照）。培
養物を成長させ、実施例３に記載のように分析した。

【００８３】（実施例５）（バリン栄養要求性によるリシン収率の微小発酵測定）２Ｌのバッフル付き震盪フラスコ中で、５００ｍＬＳＭ１で、１８時間、種
菌を成長させた。３．１ＬのＦＭ４培地を、４Ｌ微小発酵槽で使用した。温度
およびｐＨを、３２Ｃおよび７．２にそれぞれ維持した。２０時間の時点で、フ
ラスコの撹拌を７００ｒｐｍから９５０ｒｐｍに増加させた。４．５ＬＰＭで空
気を供給した。デキストロースを、３ｇ／Ｌになるように維持した。発酵時間は
、４８時間であった。

【００８４】表５にて、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを合成し得ないＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ株を用いた４リットル発酵装置中での、Ｌ−リシン産生におけ
るデータを示す。

【００８５】（実施例６）（クローン化ＩＬＶＢＮのＩｎＶｉｖｏ変異誘発により産生されたブラディ
トローフによるＬ−リシン産生）（１．機能的ＡＨＡＳ酵素を産生する、欠損型ｉｌｖＢＮオペロンの調製）ｐＶＡＬ１を得るために、ｐＡＬ２０３のｉｌＶＢＮオペロンを、シャトルベ
クターｐＭ２にサブクローニングした。ｐＭ２は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの両方で複製し得る。ｐＶａｌＩを、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅＣｏ．の変異誘発株ＸＬ１ＲＥＤに形質転換した。ＸＬ１ＲＥＤキット説
明書に従って、変異誘発プラスミドを調製し、バリン栄養要求性であるＣｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して電気穿孔法を行った。バリン栄養要求性株は、
イソロイシンおよびバリン補給、または機能的ｉｌｎＢＮオペロンを用いた遺伝
学的補足なしではＭＭプレート上で成長不可能である。

【００８６】ＳＭ１プレートからカナマイシン耐性形質転換株を選択し、ＭＭプレート上に
レプリカをとった。ＭＭプレート上で成長したそれらのコロニーは、ｉｌｎＢＮ
欠損の機能的補完性を示した。親プラスミド（ｐＶＡＬ１）を持つバリン栄養要
求性コロニーよりも小さいコロニーを、バリン栄養要求性活性アッセイを行うた
めに選択した。ｐＲＶ１Ｂ５は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍで複製し得るｐＶＡＬ１に由来するプラスミドである。バリン栄養要求性
株において、そのプラスミドが産生したＡＨＡＳ活性は、ｐＶＡＬ１により産生
されたＡＨＡＳ特異的活性の１％未満であった。この構築物のｉｌｖＢＮオペロ
ンは、漏出ＡＨＡＳ活性を有する。

【００８７】（２．Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ染色体ＤＮＡへの相同的組み換え）ｉｌｖＢＮオペロンのＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子を、導入ベクターｐＪＣ３に
サブクローニングし、実施例２で行われたような相同的組み換えにより、バリン
栄養要求性株において漏出対立遺伝子を欠損対立遺伝子に交換するために使用し
た。ＢＦ１００−１０３０は、ＲＶ１Ｂ５対立遺伝子を用いて構築されたバリン
ブラディトローフ株である。表６にて、ＢＦ１００−１０３０が震盪フラスコ中
で、親株よりも少量しかバリンを産生しないことを表すデータを示す。表７にて
、ＢＦ１００−１０３０ブラディトローフ株が表５の栄養要求性株に対して改善
した成長を有することを示す。表７にて、また、ブラディトローフにより、微小
発酵において親株よりも少量のバリンしか産生しないことを示す。

【００８８】（表）次の表で示すデータは、実施例セクションで考察している。用語「成長」は、
６６０ｎｍで測定された光学密度をいい；用語「力価」は、１リットルあたりの
アミノ酸のグラム数をいい；用語「収率」は、以下の式：［（ｇリシン／Ｌ／
（ｇデキストロース消費／Ｌ］×１００によって定義されること；Ｂ４Ｂ＝化
学的変異誘発により構築されたバリン栄養要求性株；ＬＣ１０＝染色体ｉｌｖＢ
遺伝子を、ｐＡＬ２０３ΔのｉｌｎＢ欠損対立遺伝子と置換することにより構築
されたバリン栄養要求性株；ＢＦ１００−１０３０＝染色体ｉｌｎＢ遺伝子を、
ＲＶ１Ｂ５漏出対立遺伝子と置換することにより構築されたバリンブラディトロ
ーフであることに注意すること。

【００８９】

【表１】

【００９０】

【表２】

【００９１】

【表３】

【００９２】

【表４】

【００９３】

【表５】

【００９４】

【表６】

【００９５】

【表７】

【００９６】

【表８】

【００９７】

【表９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−リシン産生を導く
生化学的経路の略図である。

【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける、Ｌ−イソロイシン産生
に至る生化学的経路概略図である。

【図２Ａ】図２Ａは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオ
チド配列（配列番号１）を示す。

【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのｉｌｖＢＮオペロンのヌクレオ
チド配列（配列番号１）を示す。

【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの、ｉｌｖＢＮオペロンのアミノ
酸配列（配列番号２）を示す。

【図３Ａ】図３Ａは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体について
のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体について
のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、プラスミドｐＡＬ２０３ΔにおけるｉｌｖＢＮ欠失変異体について
のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す
。

【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す
。

【図４Ｃ】図４Ｃは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す
。

【図４Ｄ】図４Ｄは、ｐＲＶ１Ｂ５対立遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 ＸＣ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クラフトン，コレイエム．アメリカ合衆国イリノイ 62526，ディカター，ダブリュー．パーシングロード 1371 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA72 BA73 BA74 BA75 CA01 DA05 DA06 GA14 GA19 GA25 4B064 AE04 AE08 AE10 AE14 AE16 AE17 AE18 AE19 AE20 AE24 AE25 AE26 AE29 AE30 AE34 AE35 CA02 CA19 CC24 CD09 DA01 DA10 DA16 DA20 4B065 AA22X AA22Y AA24X AA24Y AA26X AA26Y AB01 AC14 AC20 BA03 BA18 BB15 CA17 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸Ｘを産生する微生物Ｃであって、ここで該微生物Ｃは
、以下の工程：（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物
Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学変異誘発；および（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂ
を産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工
程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリ
ンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならび
に（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘ
を産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚ
パーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、を包含する方法により得られる、微生物Ｃ。
【請求項２】請求項１に記載の微生物Ｃであって、ここでアミノ酸Ｘは、
以下：（ａ）グリシン；（ｂ）アラニン；（ｃ）メチオニン；（ｄ）フェニルアラニン；（ｅ）トリプトファン；（ｆ）プロリン；（ｇ）セリン；（ｈ）トレオニン；（ｉ）システイン；（ｊ）チロシン；（ｋ）アスパラギン；（ｌ）グルタミン；（ｍ）アスパラギン酸；（ｎ）グルタミン酸；（ｏ）リジン；（ｐ）アルギニン；および（ｑ）ヒスチジン、からなる群から選択される、微生物Ｃ。
【請求項３】微生物Ａが、以下：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、からなる群から選択される、請求項２に記載の微生物Ｃ。
【請求項４】微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性
またはブラディトローフである、請求項３に記載の微生物Ｃ。
【請求項５】工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、
請求項３に記載の微生物Ｃ。
【請求項６】工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異
的変異誘発である、請求項３に記載の微生物Ｃ。
【請求項７】微生物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株であって、該株
は、以下の特徴：（ａ）分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンの１つ以上につい
ての栄養要求性またはブラディトローフ性；（ｂ）培地で培養される場合、以下：（ｉ）グリシン；（ｉｉ）アラニン；（ｉｉｉ）メチオニン；（ｉｖ）フェニルアラニン；（ｖ）トリプトファン；（ｖｉ）プロリン；（ｖｉｉ）セリン；（ｖｉｉｉ）トレオニン；（ｉｘ）システイン；（ｘ）チロシン；（ｘｉ）アスパラギン；（ｘｉｉ）グルタミン；（ｘｉｉｉ）アスパラギン酸；（ｘｉｖ）グルタミン酸；（ｘｖ）リジン；（ｘｖｉ）アルギニン；および（ｘｖｉｉ）ヒスチジン、からなる群からら選択されるアミノ酸を産生すること；ならびに（ｃ）少なくとも３０％である、デキストロースからの工程（ｂ）のアミノ酸
のパーセント収率を生じること、を有する、株。
【請求項８】前記ｉｌｖＢＮオペロンにおける変異によりさらに特徴付け
られる、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、欠失、挿入または点変異で
ある、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】前記ｉｌｖＢＮオペロン変異が、配列番号３または配列番
号５の配列により特徴付けられる、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１４９の同定特徴を有する微生
物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
【請求項１２】ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−３０１５０の同定特徴を有する微生
物Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの株。
【請求項１３】アミノ酸Ｘの産生を増加する方法であって、該方法は、以
下：（ａ）デキストロースから該アミノ酸を収率Ｙパーセントで産生する親微生物
Ａを選択する工程；（ｂ）以下：（ｉ）ランダム化学変異誘発；および（ｉｉ）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発；からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発させて、微生物
Ｂを産生させる工程；（ｃ）工程（ｂ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選択する工
程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリ
ンの１つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程；ならび
に（ｄ）工程（ｃ）から、収率Ｚパーセントでデキストロースから該アミノ酸Ｘ
を産生する少なくとも１つの微生物Ｃを選択する工程であって、ここで該収率Ｚ
パーセントは、該収率Ｙパーセントよりも大きい、工程、を包含する方法。
【請求項１４】前記アミノ酸Ｘが、以下：（ａ）グリシン；（ｂ）アラニン；（ｃ）メチオニン；（ｄ）フェニルアラニン；（ｅ）トリプトファン；（ｆ）プロリン；（ｇ）セリン；（ｈ）トレオニン；（ｉ）システイン；（ｊ）チロシン；（ｋ）アスパラギン；（ｌ）グルタミン；（ｍ）アスパラギン酸；（ｎ）グルタミン酸；（ｏ）リジン；（ｐ）アルギニン；および（ｑ）ヒスチジン、からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記微生物Ａが、以下：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養
要求性またはブラディトローフである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】工程（ｂ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】工程（ｂ）の変異誘発が、ｉｌｖＢＮオペロンの部位特異
的変異である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】アミノ酸Ｘを産生するためのプロセスであって、該プロセ
スは、以下：（ａ）微生物Ｃを培地で培養する工程であって、ここで該微生物Ｃは、以下：（ｉ）デキストロースから収率Ｙパーセントの該アミノ酸を産生する親微生
物Ａを選択する工程；（ｉｉ）以下：（１）ランダム化学変異誘発；および（２）ｉｌｖＢＮオペロンのｒＤＮＡ変異誘発、からなる群から選択される方法により、該親微生物Ａを変異誘発して、微生物Ｂ
を産生させる工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から少なくとも１つの変異誘発された微生物Ｂを選
択する工程であって、該微生物Ｂは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンお
よびバリンの１つ以上について栄養要求性である、工程；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）から栄養要求性である少なくとも１つの微生物Ｃを
選択する工程であって、該微生物Ｃは、該アミノ酸Ｘをデキストロースから収率
Ｙパーセントで産生する、工程、を包含する方法により得られる、工程；（ｂ）該微生物Ｃから産生される該アミノ酸Ｘを回収する工程、を包含する、プロセス。
【請求項２０】前記アミノ酸Ｘが、以下：（ａ）グリシン；（ｂ）アラニン；（ｃ）メチオニン；（ｄ）フェニルアラニン；（ｅ）トリプトファン；（ｆ）プロリン；（ｇ）セリン；（ｈ）トレオニン；（ｉ）システイン；（ｊ）チロシン；（ｋ）アスパラギン；（ｌ）グルタミン；（ｍ）アスパラギン酸；（ｎ）グルタミン酸；（ｏ）リジン；（ｐ）アルギニン；および（ｑ）ヒスチジン、からなる群から選択される、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】前記微生物Ａが、以下：（ａ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；（ｂ）Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ；および（ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ、からなる群から選択される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】前記微生物Ｂが、バリンおよびイソロイシンについて栄養
要求性またはブラディトローフである、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ランダム化学変異誘発で
ある、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２４】前記工程（ｉｉ）の変異誘発が、ｉｌｖＢｎオペロンの部
位特異的変異誘発である、請求項２１に記載のプロセス。