KR20020033749A - 아미노산 생산의 대사 공학 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아미노산의 발효 생산에 관한 것으로, 발효 생산에 유용한 미생물, 방법 및 공정을 제공한다. 본 발명의 미생물은 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있다. 본 발명은 돌연변이유발법에 의해 하나 이상의 분지쇄 아미노산의 합성에 대해 영양요구성 또는 영양완서성이 되도록 미생물을 제조하고, 모균주보다 더 큰 퍼센트 수율로 원하는 아미노산을 생산할 수 있는 능력에 대해 선별한 미생물을 제공한다. 바람직한 미생물은 L-리신을 생산하는 코리네박테리아, 브레비박테리아 또는 에쉐리키아 콜리이다. 돌연변이유발은 고전적인 기법이나 rDNA 기법으로 수행한다. 본 발명의 방법은 모균주를 돌연변이시키고, 하나 이상의 분지쇄 아미노산의 합성에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 세포를 선별하고, 덱스트로스로부터 원하는 아미노산을 모균주보다 더 높은 수율로 생산하는 분지쇄 아미노산 영양요구체 또는 영양완서체를 선별하여 아미노산 생산을 증가시키도록 고안된 것이다. 본 발명의 방법은 모균주를 돌연변이시켜서 얻은 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하는 단계를 포함하는 아미노산 생산을 위해 고안된 방법이다.

Description

아미노산 생산의 대사 공학{METABOLIC ENGINEERING OF AMINO ACID PRODUCTION}
발효를 통해 아미노산을 생산하면 당밀, 아세트산 및 에탄올과 같은 값싼 탄소원으로부터 저비용으로 생산이 가능하다. 코리네박테리아(Corynebacteria)가 아미노산의 산업적 생산에 유용하다는 것을 알게된 후(S. Kinoshita 등의 문헌[Proceedings of the International Symposium on Enzyme Chemistry2:464-468(1957)]), 돌연변이 균주를 분리하여 발효 공정에 의해 아미노산을 상업적으로 생산할 수 있는 가능성이 보다 증가하였다. 아미노산의 생산을 위한 미생물 공정에 이용되는 미생물은 4 부류로 나뉠 수 있다: 야생형 균주, 영양요구 돌연변이, 조절 돌연변이 및 영양요구성 조절 돌연변이(K. Nakayama 등의 문헌[NUTRITIONAL IMPROVEMENT OF FOOD AND FEED PROTEINS, M. Friedman 편저(1978), pp. 649-661]). 발효에 의해 생산되는 아미노산은 입체특이성을 지닌다는 점이 합성 공정과 비교하여 이점으로 작용하며, 미생물 공정에 의해 생산된 아미노산은 일반적으로 L-형이다.
산업적 발효에 의해 생산되는 아미노산의 일 예로는 L-리신이 있다. 이러한 필수 아미노산의 상업적 생산은 주로 그램 양성 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리아 플라범(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리아 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)을 이용하여 수행되며(Kleemann, A. 등의 문헌[Amino Acids, in ULLMANN'S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, vol. A2, pp. 57-97: Weinham: VCH-Verlagsgesellschaft(1985)]), 이러한 3종류의 유기체의 생산량을 합하면 현재 매년 생산되는 약 250,000 톤의 L-리신에 해당한다.
발효 공정에 의한 L-리신 생산이 경제적 중요성을 지닌다면, 생산되는 총량을 증가시키면서 동시에 생산 비용을 감소시키는 것이 이익이 될 것이다. 이 목적을 위해, 코리네박테리아에서 L-리신 합성을 위한 생화학적 경로를 집중적으로 연구하였다(Sahm 등의 문헌[Ann. N. Y. Acad. Sci.782:25-39(1996)]에 의해 최근에 재검토됨). 리신 경로로의 진입은 L-아스파르테이트에서 시작되며(도 1 참조), L-아스파르테이트 자체는 옥살아세테이트의 트랜스아민화에 의해 생산된다. C. 글루타미컴의 특수한 특징은 이것이 2가지의 상이한 경로, 즉 숙시닐화된 중간물질을 포함하는 반응 또는 디아미노피멜레이트 탈수소효소의 단일 반응에 의해 리신 중간물질 피페리데인 2,6-디카르복실레이트를 디아미노피멜레이트로 전환시키는 능력이다. 전체적으로, 이 경로로의 탄소 흐름은 두 지점에서 조절된다: 첫번째는 L-트레오닌과 L-리신 둘다의 레벨에 의한 아스파르테이트 키나제의 피드백 억제를 통해서이며, 두번째는 디히드로디피콜리네이트 신타제 레벨의 조절을 통해서이다. 따라서, 코리네박테리아에서 이러한 두 효소의 활성을 통제하지 않고 증가시키면 L-리신의 생산을 증가시킬 수 있다.
최근의 증거에 따르면, L-리신 합성으로 이끄는 생화학 경로 외에도, C. 글루타미컴의 리신 과다 생산 균주의 개발에 있어서 고려되어야 할 또 다른 조건은 세포에서 배지로의 리신 운송을 고려하는 것이다. Kramer와 그의 동료들에 의한 연구는, 누출(leaky) 막으로 인한 세포 밖으로의 수동적 운송은 리신 유출의 유일한 원인이 아니라는 것을 나타내며, 이들의 데이타는 아래의 특징들을 갖는 특수한 캐리어를 제시하고 있다: (1) 트랜스포터는 리신에 대해 다소 높은 Km 값(20 mM)을 보유하고, (2) 트랜스포터는 OH-심포트 시스템이며(흡수 시스템은 H+안티포트 시스템이다), (3) 트랜스포터는 양전하를 띠고, 막 전위는 분비를 자극한다(S. Broer 및 R. Kramer 등의 문헌[Eur. J. Biochem.210:137-143(1991)]).
영양요구성 또는 내성에 대해 분리된 다양한 균주를 이용하는 L-리신의 생산을 위한 여러 발효 공정이 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제2,979,439호는 호모세린(또는 메티오닌 및 트레오닌)을 요구하는 돌연변이체를 개시하고, 미국 특허 제3,700,557호는 트레오닌, 메티오닌, 아르기닌, 히스티딘, 로이신, 이소로이신, 페닐알라닌, 시스틴 또는 시스테인에 대한 영양요구성을 갖는 돌연변이체를 개시하고, 미국 특허 제3,707,441호는 리신 유사체에 대해 내성을 갖는 돌연변이체를 개시하고, 미국 특허 제3,687,810호는 L-리신 생산 능력과 바시트라신, 페니실린 G 또는 폴리믹신에 대해 내성을 갖는 돌연변이를 개시하고, 미국 특허 제3,708,395호는 호모세린, 트레오닌, 트레오닌과 메티오닌, 로이신, 이소로이신 또는 이들의 혼합물에 대한 영양요구성과 리신, 트레오닌, 이소로이신 또는 이들의 유사체에 대한 내성을 갖는 돌연변이체를 개시하고, 미국 특허 제3,825,472호는 리신 유사체에 대한 내성을 갖는 돌연변이체를 개시하고, 미국 특허 제4,169,763호는 L-리신을 생산하고, 아스파르트산 유사체와 설파제 중 하나 이상에 대해 내성인 코리네박테리아의 돌연변이 균주를 개시하고, 미국 특허 제5,846,790호는 비오틴 작용 억제제 없이 L-글루타민산 및 L-리신을 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 개시하고, 미국 특허 제5,650,304호는 4-N-(D-알라닐)-2,4-디아미노-2,4-디데옥시-L-아라비노스 2,4-디데옥시-L-아라비노스 또는 이들의 유도체에 내성인 L-리신 생산을 위한 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에 속하는 균주를 개시한다.
코리네박테리아를 이용한 L-리신 발효 생산 분야에서의 보다 최근의 발달은 리신 생산을 증가시키기 위해 분자생물학 기술을 이용하는 것과 관련이 있다. 아래의 예를 이러한 기술의 예시로서 제시한다. 미국 특허 출원 제4,560,654호 및 제5,236,831호는 S-(2-아미노에틸)-시스테인에 대해 감수성인 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 미생물 숙주를, S-(2-아미노에틸)-시스테인에 대한 내성과 리신 생산 능력 둘다를 부여하는 DNA 단편이 벡터 DNA에 삽입되어 있는 재조합 DNA 분자로 형질전환시켜서 얻은 L-리신 생산 돌연변이 균주를 개시한다. 미국 특허 제5,766,925호는 L-리신 및 L-트레오닌에 의한 피드백 억제가 탈감작된 코리네폼박테리아 유래의 아스파르토키나제를 암호화하는 유전자를, 누출형 호모세린 탈수소효소를 보유하는 코리네폼 박테리아 또는 호모세린 탈수소효소 유전자가 결핍된 코리네폼 박테리아의 염색체 DNA로 통합시켜서 생산한 돌연변이 균주를 개시한다.
코리네박테리아 및 관련 유기체는 L-리신 외에도 다른 아미노산, 예컨대 분지쇄 아미노산 L-로이신, L-이소로이신 및 L-발린의 생산에 유용하다. 분지쇄 아미노산 생합성으로 이끄는 생화학 경로 역시 잘 연구되어 있다. 아스파르테이트 경로로의 탄소 흐름은 L-리신 또는 L-트레오닌의 생산으로 집중될 수 있으며, 이는 L-이소로이신의 생산에 이용될 수 있다(도 1B). L-이소로이신은 L-트레오닌으로부터 5가지의 반응으로 생산된다. 이러한 반응들을 촉매하는 효소로는 (1) 트레오닌 데히드라타제, (2) 아세토히드록시산 신타제, (3) 이소메로리덕타제, (4) 디히드록시산 데히드라타제, 및 (5) 트랜스아미나제 B를 들 수 있다. 트레오닌 데히드라타제는 이 경로에 있어서 이소로이신 합성에만 특이적인 유일한 효소이다. 다른 4가지 효소는 다른 분지쇄 아미노산인 발린 및 로이신의 생산에도 이용된다. 트레오닌에서 이소로이신으로의 탄소 흐름은 트레오닌 데히드라타제와 아세토히드록시산 신타제(AHAS)에 의해 조절된다. 코리네박테리아 내의 이소로이신 경로의 효소를 암호화하는 유전자(ilvA, ilvB, ilvC, ilvD 및 ilvE)를 클로닝하여(C. Cordes 등의 문헌[Gene112:113-116(1992)]; B. Mockel 등의 문헌[J. Bacteriology174:8065-8072(1992)]; C. Keilhauer 등의 문헌[J. Bacteriology175:5595-5603(1993)]), 재조합 DNA 기술을 신규 균주를 생성하는 데 이용할 수 있다.
분지쇄 아미노산 생합성 경로에 있는 효소의 활성을 증가시킴으로써 아미노산 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린의 생산을 향상시키는 것에 대해서는 설명된 바 있다. 또한, ilvBN 오페론에 의해 암호화되는 아세토히드록시산 신타제(AHAS) 활성을 개량시킴으로써 분지쇄 아미노산의 생산을 향상시키는 것에 대해서도 설명된 바 있다(개괄적인 내용은 H. Sahm 등의 문헌[Ann. N. Y. Acad. Sci.782:25-39(1996)] 참조).
분지쇄 아미노산의 생산 공정의 예로는 다음을 들 수 있다: 미국 특허 제5,188,948호는 폴리케티드에 내성인 미생물을 이용한 L-발린 생산을 위한 발효 공정을 개시한다. 미국 특허 제5,521,074호는 (a) L-발린을 생산하는 능력, (b) 단일 탄소원으로서 아세트산을 함유하는 배지에서 L-발린에 대한 내성, 및 (c) 단일 탄소원으로서 글루코스를 함유하는 배지에서 피루브산 유사체에 대한 감수성을 나타내는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 속에 속하는 미생물을 이용하여 L-발린을 생산하는 방법을 개시한다. 미국 특허 제4,601,983호는 코리네폼 박테리아에서 복제할 수 있고, L-트레오닌 및 L-이소로이신을 생산하는 데 이용되는 호모세린 탈수소효소의 활성을 갖는 단백질을 생산하기 위한 유전 서열 암호를 개시한다. 미국 특허 제4,442,208호는 재조합 DNA 기술에 의해 얻은 α-아미노-β-히드록시 발러산에 내성인 브레비박테리아 또는 코리네박테리아 균주를 이용하여 L-이소로이신을 생산하는 발효 공정을 개시한다. 미국 특허 제4,656,135호는 메틸리신 내성 또는 α-케토말론산 내성을 보유하고, 액체 배지에서 L-이소로이신을 생산할 수 있는 브레비박테리아 또는 코리네박테리아 속에 속하는 미생물을 배양하는 단계 및 이 배지로부터 축적된 L-이소로이신을 수득하는 단계를 포함하는 L-이소로이신의 생산방법을 기술한다. 미국 특허 제5,118,619호는 D-락테이트를 이용하는 돌연변이체에 의한 D,L-α-히드록시부티레이트로부터의 L-이소로이신의 발효 생산 방법을 개시한다. 미국 특허 제5,763,231호는 코리네박테리아, 에쉐리키아(Escherichia), 브레비박테리아 또는 마이크로박테리아(Microbacterium) 속의 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 이렇게 얻은 세포를 당류 및 아세트산 또는 이의 염과 반응시켜 반응 용액 중에 L-로이신이 형성되어 축적되게 하는 단계를 포함하는 L-로이신의 생산 방법을 개시한다. 미국 특허 제3,970,519호는 로이신 또는 이의 유사체에 의한 피드백 억제에 대해 내성이 있고, L-로이신을 생산하기 위한 성장 영양물로서 이소로이신, 트레오닌 또는 메티오닌 중 하나 이상을 필요로 하는 균주를 개시한다.
발린의 생산을 감소시킴으로써 아미노산의 생산을 향상시키는 방법은 기술된 적이 없다.
AHAS 활성을 감소시킴으로써 아미노산의 생산을 향상시키는 방법에 대해서도 기술된 바 없다.
본 발명은 미생물 유전학 및 재조합 DNA 기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아미노산의 발효 생산에 관한 것이다. 본 발명은 아미노산 생산에 유용한 미생물, 아미노산 생산을 증가시키는 방법 및 아미노산 생산 공정에 관한 것이다.
도 1. (A) 코리네박테리아 내의 L-리신 생산으로 이끄는 생화학 경로의 모식도; (B) 코리네박테리아 내의 L-이소로이신 생산으로 이끄는 생화학 경로의 모식도.
도 2. (A-B) 코리네박테리아의 ilvBN 오페론의 뉴클레오티드 서열의 제시(서열 번호 1); (C) 코리네박테리아의 ilvBN 오페론의 아미노산 서열의 제시(서열 번호 2).
도 3. (A-B) 플라스미드 pAL203Δ에서의 ilvBN 결실 돌연변이에 대한 뉴클레오티드 서열의 제시(서열 번호 3); (C) 플라스미드 pAL203Δ에서의 ilvBN 결실 돌연변이에 대한 아미노산 서열의 제시(서열 번호 4).
도 4. (A-C) pRV1B5 대립유전자의 뉴클레오티드 서열의 제시(서열 번호 5); (D) pRV1B5 대립유전자의 아미노산 서열의 제시(서열 번호 6).
1. 정의
본 명세서와 청구항 및 하기 용어들이 제시되는 범위를 명료하고 일관적으로 이해되도록 아래의 정의를 제공한다.
영양요구체: 본 명세서에서 사용되는 영양요구체란 획득된 유전적 결함으로 인해 합성될 수 없는 특정 대사물질을 성장을 위해 외부에서 공급할 필요가 있는 미생물 균주를 말한다.
아미노산 보충: 본 명세서에서 사용되는 "아미노산 보충"이란 성장을 위해 필요하며 영양요구체의 성장을 지지하기 위해 최소 배지에 첨가되는 아미노산을 말한다.
영양완서체: 본 명세서에서 사용되는 영양완서체란 특정 대사물질을 외부에서 공급하지 않으면 성장 지연을 나타내는 미생물 균주를 말한다. 영양완서체는 대사물질을 합성할 수 있지만, 획득된 유전적 결합으로 인해 동일한 대사물질의 합성 속도가 모균주보다 느리다.
분지쇄 아미노산: 본 명세서에서 사용되는 분지쇄 아미노산이란 R기가 로이신, 이소로이신 및 발린과 같은 분지쇄 탄소 구조를 보유하는 아미노산을 말한다.
탄소 흐름: 본 명세서에서 사용되는 탄소 흐름이란 유기체의 양성대사적 생화학 경로, 이화 및/또는 동화 생화학 경로 사이에서 탄소가 이동하는 것을 말한다.
염색체 통합: 본 명세서에서 사용되는 염색체 통합이란 외인성 DNA 단편이 숙주 유기체의 염색체로 삽입되는 것을 말한다. 보다 구체적으로 이 용어는 외인성 DNA 단편과 숙주 세포 염색체의 적절한 영역 사이에 일어나는 상동성 재조합을 나타내는 데 사용된다.
고수율 유도체: 본 명세서에서 사용되는 고수율 유도체란 이것이 유래된 모균주와 비교하였을 때 덱스트로스로부터 특정 아미노산을 더 높은 수율로 생산하는 미생물 균주를 말한다.
돌연변이: 본 명세서에서 사용되는 돌연변이란 원하는 뉴클레오티드 서열에 단일 염기쌍 변화, 삽입 또는 결실이 일어난 것을 말한다.
오페론: 본 명세서에서 사용되는 오페론이란 구조 유전자 및 조절 요소를 포함하는, DNA 내의 박테리아 유전자의 발현 및 조절 단위를 말한다. 오페론 내에 포함되는 조절 요소의 예로는 프로모터와 오퍼레이터가 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
모균주: 본 명세서에서 사용되는 모균주란 본 발명의 미생물을 생산하기 위해 일정 유형의 돌연변이유발법으로 돌연변이시킨 미생물 균주를 말한다.
덱스트로스로부터의 퍼센트 수율: 이 용어는 식 [(생산된 아미노산(g)/소모된 덱스트로스(g)) x 100] = % 수율에 의해 정의되는 덱스트로스로부터의 아미노산의 수율을 말한다.
표현형: 본 명세서에서 사용되는 표현형이란 미생물의 유전적 구성에 따라 달리 관찰될 수 있는 물리적 특성을 말한다.
상대 성장율: 본 명세서에서 사용되는 상대 성장율이란 정해진 배지에서 일정 시간 동안 모균주와 자손 균주의 성장을 직접 비교하여 성장 평가를 나타내는 측정값을 말한다.
돌연변이유발: 본 명세서에서 사용되는 돌연변이유발이란 DNA 내에 돌연변이가 생성되는 과정을 말한다. "무작위" 돌연변이유발의 경우, 미생물 게놈 내의 어디에서나 일어나므로, 정확한 돌연변이 부위를 예측할 수 없으며, 이러한 돌연변이는 방사능 또는 화학적 처리와 같은 요인에 의해 유발되는 물리적 손상의 결과로서 발생된다. rDNA 돌연변이유발은 원하는 클로닝된 DNA를 대상으로 일어날 수 있고, 무작위적으로, 또는 특정 부위에 특이적으로 일어날 수 있다.
2. 분지쇄 아미노산 합성으로의 탄소 흐름 감소 및 비분지쇄 아미노산의 생산 증가를 기초로 한 본 발명의 미생물
본 발명은 대체적으로 분지쇄 아미노산의 합성에 대해 영양요구성인 미생물을 생성하여 탄소 흐름을 비분지쇄 아미노산 합성으로 이동시키는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 또는 발린(예컨대, 이소로이신 및 발린) 중 하나 이상을 요구하는 특수한 영양요구 표현형을 선별하거나, 또는 ilvBN 오페론 내에 이소로이신, 로이신 및 발린 합성으로의 탄소 흐름을 감소시키는 돌연변이를 고안하면, 이 시스템 내의 탄소 흐름이 다른 대사 경로(예컨대, L-리신 합성)에 이용될 수 있게 된다.
일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 X를 생산하는 미생물 C를 제공하는데, 이 미생물 C는 아래의 방법에 의해 얻어진다:
(a) 덱스트로스로부터 상기 아미노산을 퍼센트 수율 Y로 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계;
(b) (i) 무작위 화학적 돌연변이유발법; 및 (ii) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성되는 군에서 선택된 방법으로 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜서 미생물 B를 생산하는 단계;
(c) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성이거나 영양완서성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계 (b)로부터 선별하는 단계; 및
(d) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계 (c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 퍼센트 수율 Y보다 크다].
덱스트로스로부터의 퍼센트 수율은 식 [(아미노산(g)/L/(소모된 덱스트로스(g)/L)] x 100을 이용하여 계산하는 것이 바람직하다.
부모 미생물은 아미노산 X를 생산할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 미생물로부터 선택할 수 있다. 특히 바람직한 부모 미생물은 코리네박테리아 및 브레비박테리아이다.
본 발명의 균주는 당업자에게 공지되어 유용한 방법 및 기법 중 임의의 것을 이용하여 생산할 수 있다. 본 발명의 박테리아 균주를 구성하기 위한 적합한 방법의 예로는 다음을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)과 같은 적절한 제제를 이용한 돌연변이유발; 선형 DNA 단편을이용한 형질전환 및 상동성 재조합을 매개로 한 유전자 통합 기법; 및 박테리오파지에 의해 매개되는 트랜스덕션. 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이들의 참고 문헌의 예를 들면 다음과 같다: J.H. Miller의 문헌[Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1972)]; J.H. Miller 등의 문헌[A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1992)]; M. Singer 및 P. Berg의 문헌[Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California(1991)]; J. Sambrook, E.F. Fritsch 및 T. Maniatis의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)]; P.B. Kaufman 등의 문헌[Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida(1995)]; B.R. Glick 및 J.E. Thompson의 문헌[Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, Florida(1993)]; 및 P.F. Smith-Keary의 문헌[Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY(1989)].
A. 무작위 돌연변이유발에 의한 분지쇄 아미노산 영양요구체의 구성
본 발명의 바람직한 일 구체예는 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 생합성에 공통적인 효소 단계를 변형시켜서 덱스트로스로부터의 L-리신의 퍼센트 수율을 증가시키는 것이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 모균주를 무작위 돌연변이유발시켜서분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성인 미생물을 생산한 다음, 특정 표현형을 선별하는 방법을 제공한다. 원하는 아미노산을 생산하는 임의의 공지된 균주를 돌연변이유발을 위해 선택할 수 있다. 모균주는 바람직한 유기체로는 코리네박테리아 균주 및 브레비박테리아 균주를 들 수 있고, 가장 바람직한 유기체로는 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 균주 및 브레비박테리아 균주를 들 수 있다.
모균주는 방사능 및 화학적 절차(이에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 무작위 돌연변이유발 기법을 이용하여 돌연변이시킬 수 있다. 구체적으로, 무작위 화학적 돌연변이유발법이 바람직하며, J.H. Miller의 문헌[Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory(1972)]에 기술된 알킬화제 방법이 가장 바람직하다.
예컨대, 화학적 돌연변이유발법은 다음과 같이 구성하였다. 리신 생산 코리네박테리아 균주의 배양물을 풍부 배지에서 흡광도가 6.0이 될 때까지 30℃에서 성장시켰다. 세포를 최소 배지로 세정하고, 100 ㎍/㎖의 NTG를 함유하는 최소 배지에 재현탁시켰다. 세포를 30℃에서 30분간 돌연변이원에 노출시켰다. 세포를 최소 배지로 세정하고 풍부 배지에 플레이팅하였다. 풍부 배지로부터 얻은 콜로니를 풍부 배지 및 최소 배지에 레플리카 플레이팅하였다. 풍부 배지에서는 성장하지만 최소 배지에서는 성장하지 않는 콜로니를 영양요구체로서 분류하였다. 영양요구 돌연변이체를 최소 배지, 및 100 mM L-이소로이신 및 10 mM L-발린을 함유하는 최소 배지 상에 레플리카 플레이팅하였다. 이소로이신 및 발린에 의해 구제된 콜로니를 발린 영양요구체로서 분류하였다. 균주 B4B는 화학적 돌연변이유발법에 의해 생성된 발린 영양요구체이다.
B. rDNA 기법을 통한 돌연변이유발에 의한 분지쇄 아미노산 영양요구체의 구성
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 분지쇄 아미노산의 생합성에 중요한 단백질을 암호화하는 클로닝된 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 돌연변이유발을 위한 재조합 DNA 기술을 이용하는 것이다. 그 다음, 돌연변이된 DNA를 이용하여 모균주를 변형시켜서 분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성이고 모균주보다 더 높은 수율로 덱스트로스로부터 비분지쇄 아미노산을 생산하는 돌연변이 균주를 생산할 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 원하는 클로닝된 DNA를 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 재조합 DNA 기술을 통해 돌연변이시킬 수 있다. 당업자들이 알고 있는 바와 같이, 클로닝된 DNA에서의 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화(점 돌연변이), 다중 뉴클레오티드 변화, 뉴클레오티드 결실 또는 삽입으로 구성될 수 있다. 재조합 DNA 기술에 관한 일반적인 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 핵산 정제, 제한효소 분해, 결찰, 유전자 클로닝, 유전자 서열화, 유전자 서열의 폴리머라제 연쇄 증폭(PCR) 등과 같은 기본적인 기법들을 설명하는 통상적인 다수의 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다(참고 문헌: Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1989)]; Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York(1994)]; Innis 등의 문헌[PCR Protocols, AcademicPress, Inc., New York, pp. 407-415(1990)]).
클로닝된 DNA의 시험관내 돌연변이유발법을 구체적으로 설명하는 참고문헌 역시 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 특정 부위의 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발, 링커 스캐닝 돌연변이유발, 시험관내 무작위 화학적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 등은 M.J. McPherson의 문헌[Directed Mutagenesis: A Practical Approach, Oxford University Press, New York(1991)]에 상세히 기술되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 원하는 클로닝된 DNA를 숙주 세포 생체내에서 돌연변이시킬 수 있다. 이러한 유형의 "생체내 돌연변이유발법"은 DNA 수복 경로 중 하나 이상에 돌연변이가 생긴 E. 콜리 균주에서 DNA를 증폭시킴으로써, 임의의 원하는 클로닝된 DNA 내에 무작위 돌연변이를 생성하는 과정을 포함한다. 이러한 "돌연변이유발" 균주는 야생형 모균주보다 무작위 돌연변이 발생률이 더 높다. 이러한 균주들 중 하나에서 DNA를 증폭시키면 DNA 내에 무작위 돌연변이를 유발할 수 있다. 이를 달성하기 위해 고안된 시스템은 당업자에게 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 예를 들면, 스트라타진 인코포레이티드는 DNA 수복 유전자(MutH, MutL 및 MutS)가 결실되어 단시간 내에 다수의 상이한 돌연변이가 발생되는 E. 콜리의 XL1 레드 균주를 이용하는 시스템을 제공한다. 30시간 내에 10,000개에 이르는 돌연변이가 유발될 수 있어서, 당업계에 공지된 절차를 이용하여 돌연변이 DNA로부터 전체 돌연변이 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다.
돌연변이에 대해 선별된 클로닝된 DNA는, 합성에 중요한 하나 이상의 효소,또는 운송 및 배출에 중요한 하나 이상의 단백질 생성물을 암호화하는 서열(이에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 분지쇄 아미노산 합성에 중요한 당업계에 공지된 임의의 서열일 수 있다. 가장 바람직한 것은 코리네박테리아 또는 브레비박테리아의 ilvBN 오페론에 대해 클로닝된 서열이다. 분지쇄 아미노산 합성과 관련된 코리네박테리아 유전자는 클로닝되었다. 예컨대, 이 유전자 서열은 이소로이신 경로에 유용하다(ilvA, ilvB, ilvC, ilvD 및 ilvE)(C. Cordes 등의 문헌[Gene112:113-116(1992)]; B. Mockel 등의 문헌[J. Bacteriology174:8065-8072(1992)]; 및 C. Keilhauer 등의 문헌[J.Bacteriology175:5595-5603(1993)]).
L-이소로이신은 L-트레오닌으로부터 5가지의 반응으로 생산된다. 이러한 반응들을 촉매하는 효소로는 (1) 트레오닌 데히드라타제(ilvA), (2) 아세토히드록시산 신타제(ilvBN), (3) 이소메로리덕타제(ilvC), (4) 디히드록시산 데히드라타제(ilvD); 및 (5) 트랜스아미나제 B(ilvE)를 들 수 있다. 트레오닌 데히드라타제는 이러한 경로에서 이소로이신 합성에만 특이적인 유일한 효소이며, 다른 4가지 효소는 다른 분지쇄 아미노산인 발린 및 로이신의 생산에도 이용된다. 코리네박테리아 종 내의 이소로이신 생합성에 관여된 효소 경로를 도 2에 도시하였다.
아세토히드록시산 신타제(AHAS) 및 이소메로리덕타제(IR)는 이소로이신, 발린, 로이신 및 판토테네이트를 향한 대사물질의 흐름에서 후속 반응을 촉매한다. 다른 박테리아에서와 마찬가지로, 코리네박테리아 종의 AHAS는 두개의 유전자, ilvB 및 ilvN에 의해 암호화된다. 유전자 파괴를 통해 이들 유전자가 C. 글루타미컴에서 단일 AHAS 활성을 암호화한다는 것을 확인하였다(Keilhauer, C. 등의문헌[J. Bacteriology175:5595-5603(1973)]). 노던 블롯 분석을 통해 생체내에서 3.9, 2.3 및 1.1 Kb의 3개 전사체를 확인하였으며, 이들 전사체는 각각 ilvBNC, ilvNC 및 ilvC 메세지에 상응하는 것이었다. ilvC 전사체(IR을 암호화함)는 C. 글루타미컴의 ilv 오페론에서 유래하는 가장 풍부한 전사체이다. 또 다른 분석은 이 오페론에서 3개의 프로모터가 활성을 나타내며, ilvBNC 및 ilvNC 메세지 레벨의 정상 상태가 단일 AHAS의 총 활성에 크게 기여한다는 것을 보여준다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 클로닝된 ilvBN 오페론 DNA 서열을 제한 효소로 절단하여 결실이 유발된 돌연변이를 생성할 수 있다. 그런 다음, 상동성 재조합으로 야생형 서열을 돌연변이된 ilvBN 서열로 치환하고 분지쇄 아미노산 영양요구성에 대해 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 분지쇄 아미노산 이소로이신, 로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성이고, 모균주보다 더 높은 % 수율로 덱스트로스로부터 원하는 아미노산을 생산하는 미생물 코리네박테리아에 관한 것이다. 특히 바람직한 구체예의 아미노산은 L-리신이다.
본 발명의 매우 바람직한 다른 구체예는 NRRL 기탁번호 B-30149 또는 NRRL 기탁번호 B-30150의 특성을 거의 모두 갖는 미생물에 관한 것이다.
3. 아미노산의 생산을 증가시키는 방법
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산의 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 일반적으로 다음 단계들을 포함하는 아미노산 X의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 덱스트로스로부터 상기 아미노산을 퍼센트 수율 Y로 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계;
(b) (i) 무작위 화학적 돌연변이유발법; 및 (ii) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜서 미생물 B를 생산하는 단계;
(c) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계(b)로부터 선별하는 단계; 및
(d) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계(c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 퍼센트 수율 Y보다 크다].
특히 바람직한 일 구체예에서, 덱스트로스로부터 정해진 퍼센트 수율로 원하는 아미노산을 생산하는 모균주로서 당업계에 공지된 임의의 균주를 선택할 수 있다. 덱스트로스로부터의 퍼센트 수율은 하기 식을 이용하여 쉽게 계산할 수 있다: [(아미노산(g))/L(소모된 덱스트로스(g)/L)] x 100
유기체를 선택하고 덱스트로스로부터의 아미노산의 퍼센트 수율을 측정한 후, 유기체의 전체 게놈을 대상으로 하는 무작위 돌연변이유발 기법이나, 또는 원하는 클로닝된 DNA에 대한 rDNA 기법으로 이 미생물을 돌연변이시키는 것이 바람직하다. 이용되는 특정 돌연변이유발법에 관계없이, 분지쇄 아미노산 합성에 대한 영양요구성을 기준으로 하여 돌연변이된 유기체를 스크리닝하고 선별한다. 그런 다음, 선별된 영양요구체를 스크리닝하여 어느 균주가 모균주보다 더 높은 수율로 덱스트로스로부터 원하는 아미노산을 생산하는 지를 결정할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예는 유기체 코리네박테리아, 브레비박테리아 및 E. 콜리로부터 원하는 아미노산의 생산을 증가시키는 방법을 포함한다. 또한, 특정 구체예에 따라, 본 발명은 글리신, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스라파긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 비분지쇄 아미노산의 생산을 증가시키는 방법들을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 분지쇄 아미노산 합성에 대한 영양요구체를 생성하고, 로이신, 이소로이신 및 발린의 합성으로부터 탄소 흐름을 전환시킴으로써 비분지쇄 아미노산 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구체예는 돌연변이된 모균주로부터 발린 및 이소로이신 합성에 대해 영양요구성인 균주를 선별함으로써 아미노산의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 무작위 돌연변이유발 기법(예컨대, 방사능 또는 화학적 돌연변이유발법) 또는 rDNA 기법에 의한 ilvBN 오페론의 돌연변이유발에 의해 모균주를 돌연변이시킬 수 있는, 아미노산의 생산을 증가시키기 위한 방법의 다양한 바람직한 구체예를 제공한다. 바람직한 일 구체예는, 모균주를 무작위 화학적 돌연변이유발법으로 돌연변이시키는 것이다. 또 다른 바람직한 구체예는 클로닝된 ilvBN 오페론 뉴클레오티드 서열을 대상으로 하여 rDNA 기법으로 모균주를 돌연변이시키는 것이다.
4. 아미노산의 생산 방법
본 발명의 또 다른 목적은 아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 대체로 다음 단계를 포함하는 아미노산 X를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
(a) (i) 덱스트로스로부터 퍼센트 수율 Y로 아미노산 X를 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계;
(ii) (1) 무작위 화학적 돌연변이유발법; 및 (2) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성되는 군에서 선택된 방법으로 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜 미생물 B를 생성하는 단계;
(iii) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계 (b)로부터 선별하는 단계; 및
(iv) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계 (c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 상기 퍼센트 수율 Y보다 높다]의 방법으로 얻은 미생물 C를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 C로부터 생산되는 아미노산 X를 회수하는 단계.
본 발명의 바람직한 구체예의 방법은 배양된 미생물이 코리네박테리아, 브레비박테리아 및 E. 콜리를 포함하는 군에서 선택된다. 코리네박테리아 속의 유기체를 이용하는 방법이 특히 바람직하다. 본 발명의 방법을 위해 선택된 미생물은 원하는 아미노산, 특히 비분지쇄 아미노산을 생산하는 것이다. 보다 바람직한 미생물의 구체예는 글리신, 알라닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스라파긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루타민산, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘을 생산하는 미생물이다. 덱스트로스로부터의 퍼센트 수율을 계산하기 위해서는 다음 식을 이용하여 선택된 아미노산의 생산 레벨을 쉽게 결정할 수 있다: [(아미노산(g)/L/(소모된 덱스트로스(g)/L)] x 100.
본 발명의 방법에 이용되는 미생물은 선택된 모균주의 돌연변이유발로 얻는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예는 전체 게놈을 대상으로 무작위적으로 돌연변이시키거나, 또는 클로닝된 원하는 DNA를 rDNA 돌연변이시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는 모균주를 방사능 처리 또는 화학적 처리에 의해 무작위 돌연변이시키는 것인데, 이러한 방법에 국한되는 것은 아니다. 보다 더 바람직한 구체예는 모균주를 무작위 화학적 돌연변이시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 모균주를 rDNA 돌연변이유발법으로 돌연변이시키는 것이다. 보다 바람직한 구체예는 ilvBN 오페론을 시험관내 또는 생체내에서 rDNA 돌연변이시키는 것이다. 그 다음, 당업자에게 잘 알려진 상동성 재조합 기법을 이용하여 ilvBN 오페론의 돌연변이형 또는 이들의 단편들로 야생형 ilvBN 오페론 서열을 치환할 수 있다(실시예 6 참조).
그러나, 선택된 모균주 또는 클로닝된 DNA 서열을 돌연변이시키고, 이렇게 얻은 자손을 스크리닝하여 분지쇄 아미노산(즉, 로이신, 이소로이신 또는 발린) 합성에 대해 영양요구성인 것을 선별한다. 이러한 돌연변이의 선별에 대해서는 당업자라면 숙지하고 있을 것이다. 바람직한 구체예는 발린 및 이소로이신 생합성에 대해 영양요구성인 균주이다.
결국, 본 발명의 방법을 이용한 미생물의 선별은 선택된 아미노산의 생산에 따라 달라진다. 덱스트로스로부터의 퍼센트 수율을 측정하기 위해 식 [(아미노산(g)/L/(소모된 덱스트로스(g)/L)] x 100을 이용하여, 덱스트로스로부터 선택된 아미노산으로의 생산 수율이 모균주보다 큰가를 기준으로 하여 원하는 미생물을 선별한다.
본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 특정 미생물 배양 방법에 따라 달라지는 방법에 관한 것이다. 따라서, 당업계에 공지되어 있는 다양한 발효 기술을 아미노산 생산에 관한 본 발명의 방법에 이용할 수 있다.
적절한 탄소원의 예로는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 전분 가수분해물, 셀룰로오스 가수분해물 및 당밀과 같은 탄수화물; 아세트산, 프로피온산, 포름산, 말산, 시트르산 및 푸마르산과 같은 유기산; 및 글리세롤과 같은 알코올이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
적절한 질소원의 예로는 암모니아 기체 및 수성 암모니아를 비롯한 암모니아; 염화암모늄, 인산암모늄, 황산암모늄 및 아세트산암모늄과 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄 염; 및 육류 추출물, 펩톤, 곡물 진액(steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물 및 효모 추출물을 비롯한 기타 질소 함유 물질을 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
일반적으로, 본 발명을 통해 회분식(batch type) 또는 유가식(fed-batch type)과 같은 발효 공정으로 아미노산을 상업적으로 생산할 수 있다. 회분식 발효에서는 모든 영양물을 발효 시작시에 첨가한다. 유가식 또는 연장 유가식 발효에서는 한가지 또는 다수의 영양물을 발효 시작시부터, 또는 배양이 일정 단계에 이른 후, 또는 공급된 영양물(들)이 배양액에서 고갈되었을 때 배양물에 연속적으로 공급한다. 유가식 발효의 변형인 연장 회분식 발효는 유가식 발효 또는 필 앤드 드로(fill-and-draw) 발효를 반복하는 것으로서, 이때 발효기의 내용물의 일부를 일정 시점, 예컨대 발효기가 꽉 찼을때 제거하지만, 영양물은 계속 공급한다. 이렇게 하여 발효를 장기간 연장할 수 있다.
발효의 또 다른 유형인 연속 발효 또는 케모스탯 배양은 완전 배지를 연속적으로 공급하는 반면, 발효기 내의 브로스(broth)의 부피가 거의 일정하도록 배양액을 연속적으로 또는 반연속적으로 제거한다. 연속 배양은 이론적으로는 무한한 시간 동안 계속할 수 있다.
회분식 배양에서 유기체는 필수 영양물 중 하나가 고갈될 때까지, 또는 발효 조건이 부적절해질 때까지(예컨대, pH가 미생물 성장을 억제하는 값으로 감소되는 조건) 성장한다. 유가식 발효에서는 통상, 예컨대 pH 조절을 통해 유리한 성장 조건을 유지하도록 측정을 수행하며, 배양액에 이러한 영양물(들)을 공급함으로써 1종 이상의 필수 영양물이 고갈되는 것을 막는다. 미생물은 영양물 공급 속도에 의해 결정되는 성장 속도로 계속 성장하게 된다. 일반적으로 단일 영양물, 가장 흔하게는 탄소원이 성장을 제한하게 된다. 동일한 원리는 연속 발효에도 적용되는데, 통상 배지 내의 1종의 영양물이 제한성이며, 다른 모든 영양물은 과량으로 존재한다. 제한성 영양물은 매우 저농도로, 때로는 측정할 수 없을 정도로 낮은 농도로 배양액에 존재한다. 다른 종류의 영양물 제한이 이용될 수 있다. 탄소원 제한이 가장 빈번하게 이용된다. 다른 예로는, 질소원에 의한 제한, 산소에 의한 제한, 비타민 또는 아미노산과 같은 특수한 영양물에 의한 제한(미생물이 이러한 화합물에 대해 영양요구성인 경우), 황에 의한 제한 및 인에 의한 제한이 있다.
아미노산은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 회수할 수 있다. 그 예는 Van Walsem, H.J. & Thompson, M.C.의 문헌[J. Biotechnol.59:127-132(1997)] 및 미국 특허 제3,565,951호에 제공되며, 이들 문헌은 본 명세서에서 참고 인용한다.
본 명세서에서 언급한 모든 특허 및 공보들은 모두 본 명세서에서 참고 인용한 것들이다.
발명의 개요
본 발명의 일 목적은 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 미생물을 제공하는 것이다. 전환 효율은 하기 식으로 정량할 수 있고,
[(생산된 아미노산(g)/소모된 덱스트로스(g)) x 100] = % 수율
덱스트로스로부터의 수율로서 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 돌연변이유발법에 의해 하나 이상의 분지쇄 아미노산의 합성에 대해 영양요구성이 되도록 제조되어, 모균주보다 원하는 아미노산을 더 높은 % 수율로 생산할 수 있는 능력에 대해 선별된 미생물을 제공한다.
본 발명의 보다 구체적인 예를 들면, 본 발명은 모균주를 무작위 화학적 돌연변이유발법으로 돌연변이시키고, 분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성인 돌연변이된 변이체를 분리하고, 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하여 얻은 미생물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예는 ilvBN 오페론의 핵산 서열에 변화(즉, 돌연변이)를 도입하는 rDNA 기법을 이용하고, 분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 돌연변이된 변이체를 분리하고, 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하여 얻은 미생물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 L-리신을 생산한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 코리네박테리아 미생물 또는 브레비박테리아 미생물에 관한 것으로, 특히 바람직한 미생물은 L-리신을 생산하는 코리네박테리아 또는 브레비박테리아 미생물이다. 가장 바람직한 구체예의 미생물은 NRRL 번호 B-30149(LC10으로도 알려짐) 또는 NRRL 번호 B-30150(BF100-1030으로도 알려짐)의 확인 특성을 보유하는데, 이 균주들은 1999년 6월 29일에 미국 일리노이주 61604, 페오리아, 노스 유니버시티 스트리트 1815, Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)에 기탁된 것들이다.
본 발명의 또 다른 목적은 모균주를 돌연변이시키고, 하나 이상의 분지쇄 아미노산의 합성에 대해 영양요구성인 세포를 선별하고, 모균주보다 더 높은 % 수율로 덱스트로스로부터 원하는 아미노산을 생산하는 분지쇄 아미노산 영양요구체를 선별하여 아미노산 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
이 방법의 바람직한 구체예는 무작위 화학적 돌연변이유발법 또는 재조합 DNA(rDNA) 기법을 통해 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성 또는 영양완서성이 되도록 제조된 코리네박테리아를 배양하여 덱스트로스로부터 아미노산 L-리신의 수율을 증가시키는 것에 관한 것이다.
일 구체예에서, 분지쇄 아미노산 영양요구성은 코리네박테리아의 화학적 돌연변이유발의 결과이다. 또 다른 구체예에서, 분지쇄 아미노산 영양요구성은 rDNA 기법에 의해 ilvBN 오페론을 돌연변이유발시킨 결과이다.
본 발명의 또 다른 목적은 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 미생물로부터 아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성 또는 영양완서성이 되도록 모균주를 돌연변이시켜서 얻은 미생물을 배지에서 배양하고, 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하는 것을 포함하는 아미노산 생산 방법을 제공한다.
이 방법의 바람직한 구체예는 모균주를 무작위 화학적 돌연변이유발시키고,분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성인 돌연변이된 변이체를 분리하고, 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하여 발효에 이용되는 미생물을 얻는 것이다. 이 방법의 또 다른 바람직한 구체예는, rDNA 기법에 의해 ilvBN 오페론의 뉴클레오티드 서열을 변화시키고(즉, 돌연변이를 도입함), 분지쇄 아미노산 합성에 대해 영양요구성 또는 영양완서성이 된 돌연변이 변이체를 분리하고, 모균주보다 더 높은 효율로 글루코스를 L-이소로이신, L-로이신 및 L-발린 외의 아미노산으로 전환시킬 수 있는 변이체를 선별하여 발효에 이용되는 미생물을 얻는 것이다
전술한 개괄적인 설명과 후술하는 상세한 설명은 단지 예시와 설명을 위한 것으로, 청구하는 본 발명을 추가로 설명하고자 하는 것이다.
실시예 1
화학적 돌연변이유발 및 발린 영양요구체의 선별
Miller, J.H.의 문헌(1972)[Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술된 바와 같이 리신 생산 코리네박테리아 균주 BF100을 알킬화제로 돌연변이시켰다. 콜로니를 최소 배지(MM)에 레플리카 플레이팅하였다. MM 상에서 성장하지 않지만 완전 배지(CM)에서는 성장하는 것을 영양요구체로서 확인하였다. L-발린 및 L-이소로이신을 보충하였을 때 MM 상에서 성장할 수 있는 영양요구체를 리신 수율 분석을 위해 선별하였다.
MM은 1 ℓ당 D-글루코스 20 g, 황산암모늄 10 g, 우레아 2.5 g, KH2PO41 g, MgSO4.7H2O 0.4 g, NaCl 1 g, MnSO4.H2O 0.01 g, FeSO4.7H2O 0.01 g, 펜토테네이트 10㎎, 비오틴 50 ㎎, 티아민 200 ㎎ 및 니아신아미드 50 ㎎으로 구성되며, pH는 7.2였다. L-아미노산을 MM에 보충하는 데 이용할 때에는, 1 ℓ당 50 ㎎을 사용하였다. MMIV는 이소로이신과 발린을 첨가한 MM이었다.
3가지 아미노산을 보충한 최소 아가 플레이트 상에서 화학적 돌연변이유발에 의해 생성된 고수율 유도체 및 모균주의 성장 패턴은 하기 표 1에 기재하였다. 보충물은 50 ㎎/ℓ의 L-아미노산이다. 성장율은 30℃에서 3일 후에 상대적인 콜로니 크기로서 나타내었다.
실시예 2
rDNA 기법을 이용한 분지쇄 영양요구체의 생산
1. 결실된 ilvB 유전자의 제조
코리네박테리아 락토퍼멘텀(ATCC 21799)의 ilvBN 오페론을 PCR로 증폭시키고 pCR-스크립트로 클로닝하여 pAL203을 제조하였다. ilvB 유전자는 2개의 EcoNI 제한 부위에 의해 분리되어 있는 390 bp 영역을 포함한다. EcoNI은 플라스미드 pCR-스크립트를 절단하지 않는다. ilvB 결실 대립유전자는, 플라스미드 pAL203을 EcoNI으로 절단한 다음, 이를 자가결찰시켜서 pAL203델타를 제조함으로써 구성하였다.
2. 변형된 ilvBN 대립유전자의 코리네박테리아 염색체로의 상동성 재조합
Maloy 등의 문헌(1996)[Maloy S.R., Stewart V.J. 및 Taylor R.K.(1996);Genetic Analysis of Pathogenic Bacteria: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press]에 기술된 바와 같이 이중 교차에 의한 대립유전자 교환용 벡터를 구성하였다. E. 콜리에서는 복제하지만 코리네박테리아에서는 복제하지 않는 pK184플라스미드의 공급원은 ATCC 37766이었다. sacB 유전자를 SapI 부위로 서브클로닝하여 pJC3를 제조하였다. pJC3는 코리네박테리아에서 복제할 수 없다. 모든 카나마이신 내성 콜로니에서는 벡터가 클로닝된 유전자 내의 한 부위에서 상동성 재조합에 의해 염색체로 통합될 것이다. 통합된 벡터 상의 sacB 유전자의 치사 발현으로 인해 수크로스 존재 하에서 성장이 억제된다. 수크로스의 존재 하에서의 성장을 위해서는 클로닝된 삽입체의 상동성 영역을 따라 2차 교차가 발생하여야 한다. 1차 및 2차 교차가 변형(결실, 부위 돌연변이)의 측면에 접해있다면, ilvBN의 변형된 대립유전자와 숙주 균주의 염색체 상에 존재하는 대립유전자가 교환될 것이다.
pAL203Δ유래의 ilvBN 오페론의 변형된 대립유전자를 통합 벡터 pJC3에 서브클로닝하고 코리네박테리아의 BF100 균주에 전기천공시킨 다음, 수크로스를 함유하지 않고 카나마이신을 함유하는 풍부 배지 플레이트(DMK) 위에 플레이팅하였다. 콜로니를 취하여 수크로스와 카나마이신을 함유하지 않는 풍부 브로스에서 48시간 동안 성장시켰다. 배양물을 카나마이신은 함유하지 않지만 수크로스를 함유하는 풍부 플레이트 위에 스트리킹하였다. 수크로스 플레이트에서 단일 콜로니를 취하여 DMK, SM1, MM 및 MMIV 상에 레플리카 플레이팅하였다. 카나마이신 내성이 없고, 수크로스 상에서 성장할 수 있고, MM 상에서는 성장할 수 없지만, MMIV 상에서는 성장할 수 있는 균주를 진탕 플라스크 실험을 위해 선별하였다. LC10은 BF100 유래 영양요구체이다.
3가지 아미노산을 보충한 일련의 최소 아가 플레이트 상에서 재조합 DNA 기법으로 생성된 고수율 유도체 및 모균주의 성장 패턴은 하기 표 2에 기재하였다.보충물은 50 ㎎/ℓ의 L-아미노산이다. 성장은 30℃에서 3일 후에 상대적인 콜로니 크기로서 나타내었다.
실시예 3
무작위 화학적 돌연변이유발에 의해 생산된 발린 영양요구체 균주로부터의 L-리신 수율의 진탕 플라스크 측정
SM1 플레이트로부터 단일 콜로니를 취하여 SM1 브로스로 옮겨서 B4B 접종물을 준비하였다. SM1은 물 1 ℓ당 수크로스 50 g, K2HPO43 g, 우레아 3 g, MgSO4.7H2O 0.5 g, 폴리펩톤 20 g, 쇠고기 추출물 5g, D-비오틴 0.9 ㎎, 티아민 3 ㎎, 니아신아미드 125 ㎎, L-메티오닌 0.5 g, L-트레오닌 0.25 g, L-알라닌 0.5 g을 배합하여 제조하였고 pH를 7.3으로 조절하였다. 플레이트는 20 g/ℓ의 아가를 포함하였다. SM1 브로스에서 16시간 동안 성장시킨 후, 동일 부피의 30% 글리세롤을 첨가하고 배양물을 -80℃에서 동결시켰다.
SFM 20 ㎖를 포함하는 차폐된 250 ㎖의 시드(seed)용 진탕 플라스크에 0.1 ㎖의 해동시킨 접종물을 접종하였다. 시드 배지(SFM)는 물 1 ℓ당 D-글루코스 60 g, K2HPO43 g, 우레아 3 g, MgSO4.7H2O 0.5 g, 폴리펩톤 20 g, 쇠고기 추출물 5g, D-비오틴 3 ㎎, 니아신아미드 125 ㎎, L-메티오닌 0.5 g, L-트레오닌 0.25 g, L-알라닌 0.5 g을 배합하여 제조하였고 pH를 7.3으로 조절하였다. 배양물을 30℃에서 16시간 동안 성장시키고 2 인치 간격으로 배치하여 240 rpm으로 통기시켰다. 2 ㎖의 시드 배양물을 사용하여 21 ㎖의 발효 배지(FM4)에 접종하였다. 주배지 16 ㎖와덱스트로스 스톡 5 ㎖를 혼합하여 FM4 배지를 제조하였다. 덱스트로스 스톡은 D-글루코스 180 g + 물 500 ㎖였다. 주배지는 1 ℓ당 MnSO40.083 g, D-비오틴 0.4 ㎎, 곡물 진액, 라피네이트 및 CaCO350 g을 포함하였다. 곡물 진액은 FM4의 최종 건조 고형분 부피가 4%가 되도록 첨가하였다. 라피네이트는 FM의 최종 부피가 5% 황산암모늄을 포함하도록 첨가하였다. 배양물을 250 ㎖의 차폐된 진탕 플라스크에서 30℃에서 48시간 동안 배양하고 2인치 간격으로 배치하여, 240 rpm으로 통기시켰다.
하기 표 3은 발린 및 이소로이신 요구성에 대해 선별한 개량된 코리네박테리아 균주에 의한 진탕 플라스크에서의 L-리신 생산에 관한 데이타를 제시한 것이다.
실시예 4
rDNA 기법에 의해 생산된 발린 영양요구체 균주로부터의 L-리신 수율의 진탕 플라스크 측정
하기 표 4는 ilvBN 오페론의 염색체 카피로부터 390 베이스의 DNA 서열을 결실시킴으로써 개량시킨 코리네박테리아 균주에 의한 진탕 플라스크에서의 L-리신의 생산에 관한 데이타를 나타낸 것이다(실시예 2 참조). 실시예 3에 기술한 대로 배양물을 배양하여 분석하였다.
실시예 5
발린 영양요구체에 의한 리신 수율의 미량발효 측정
2 ℓ의 차폐된 진탕 플라스크 내의 500 ㎖의 SM1 중에서 18시간 동안 접종물을 배양하였다. 4 ℓ미량발효기에 FM4 배지 3.1 ℓ를 사용하였다. 온도는 32℃, pH는 7.2로 유지하였다. 20시간 후 교반 속도를 700 rpm에서 950 rpm으로 증가시켰다. 공기는 4.5 LPM으로 주입하였다. 덱스트로스는 3 g/ℓ농도로 유지하였다. 발효 시간은 48시간이었다.
하기 표 5는 L-이소로이신 및 L-발린을 합성할 수 없는 코리네박테리아 균주를 이용하여 4 ℓ발효기에서 L-리신을 생산한 것에 관한 데이타를 기재한 것이다.
실시예 6
클로닝된 ILVBN의 생체내 돌연변이유발에 의해 생산된 영양완서체에 의한 L-리신의 생산
1. 기능적 AHAS 효소를 생산하는 결함 ilvBN 오페론의 제조
pAL203의 ilvBN 오페론을 셔틀 벡터 pM2에 서브클로닝하여 pVAL1을 제조하였다. pM2는 E. 콜리와 코리네박테리아 둘다에서 복제할 수 있다. pVal1을 스트라타진 컴퍼니에서 입수한 돌연변이유발 균주 XL1RED로 형질전환시켰다. XL1RED 키트 설명서에 따라서 돌연변이된 플라스미드를 제조하고, 이를 발린 영양요구체, 즉 코리네박테리아에 전기천공시켰다. 발린 영양요구체는 이소로이신 및 발린에 의한 보충 또는 기능적 ilvBN 오페론의 유전적 보완 없이는 MM 플레이트 상에서 성장할 수 없다.
SM1 플레이트로부터 카나마이신 내성 형질전환체를 선별하고, 이를 MM 플레이트 상에 레플리가 플레이팅하였다. MM 플레이트에서 성장하는 콜로니는 ilvBN 결실의 기능적 보완을 나타내었다. 발린 영양요구체 활성 분석을 위해, 부모 플라스미드(pVAL1)를 보유하는 발린 영양요구체의 콜로니보다 더 적은 콜로니를 선별하였다. pRV1B5는 E. 콜리 및 코리네박테리아에서 복제할 수 있는 pVAL1 유래의 플라스미드이다. 발린 영양요구체 균주에서, 이것은 pVAL1에 의해 생산된 AHAS의 특수 활성의 1% 미만으로 AHAS 활성을 나타내었다. 이 구성물의 ilvBN 오페론은 누출형 AHAS 활성을 보유한다.
2. 코리네박테리아 염색체 DNA로의 상동성 재조합
ilvBN 오페론의 RV1B5 누출형 대립유전자를 통합 벡터 pJC3에 서브클로닝하고, 이를 실시예 2에서 수행한 바와 같이 상동성 재조합에 의해 누출형 대립유전자와 발린 영양요구체의 결실 대립유전자를 교환하는 데 이용하였다. BF100-1030은 RV1B5 대립유전자로 구성된 발린 영양완서체이다. 하기 표 6은 BF100-1030이 진탕 플라스크에서 모균주보다 발린을 적게 생산한다는 것을 보여주는 데이타를 제시한다. 하기 표 7은 BF100-1030 영양완서체가 표 5에서의 영양요구체보다 향상된 성장을 나타낸다는 것을 보여준다. 표 7은 또한 영양완서체가 미량발효기에서 모균주보다 발린을 적게 생산한다는 것을 보여준다.
표
하기 표에 제시한 데이타에 대해서는 실시예 부분에 설명되어 있다. "성장율"이란 660 nm에서 측정한 흡광도를 의미하는 것이고, "역가"는 1 ℓ당 아미노산의 그램수를 의미하고, "수율"은 식 [(리신(g)/L/(소모된 덱스트로스(g)/L)] x 100에 의해 정의되며, B4B는 화학적 돌연변이유발로 구성된 발린 영양요구체이고, LC10은 염색체 ilvB 유전자를 pAL203Δ의 ilvB 결실 대립유전자로 대체하여 제조한 발린 영양요구체이며, BF100-1030은 염색체 ilvB 유전자를 RV1B5 누출형 대립유전자로 대체하여 제조한 발린 영양완서체이다.
화학적 돌연변이유발 후의 발린 영양요구체 선별
아미노산 보충 상대 성장율
아가 플레이트 ile leu val BF100 B4B
MM - - - 5 0
MM + + - 5 0
MM + - + 5 2
MM - + + 5 0
MM + + + 5 5
rDNA 변형 후의 영양요구체 선별
아미노산 보충 상대 성장율
아가 플레이트 ile leu val BF100 LC10
MM - - - 3 0
MM + + - 3 0
MM + - + 3 1
MM - + + 3 0
MM + + + 3 3
무작위 화학적 돌연변이유발에 의해 생산된 발린 영양요구체 균주로부터의 L-리신 수율의 진탕 플라스크 측정
균주 성장율 리신 역가 % 수율
모균주-1 33 18 32
B4B 33 17 44
rDNA 기법에 의해 생산된 발린 영양요구체 균주로부터의 L-리신 수율의 진탕 플라스크 측정
균주 성장율 리신 역가 % 수율
BF100 35 25 38
LC10 35 28 43
리신 수율의 미량발효 측정
균주 성장율 리신 역가 % 수율 발린 역가
BF100 90 113 37 8.9
LC10 63 86 50 1.1
B4B 70 91 51 ---
ilvB의 RV1B5 대립유전자를 염색체로 통합시켜서 생산한 발린 영양완서체 균주로부터의 감소된 L-발린 역가의 진탕 플라스크 측정
균주 성장율 리신 역가 % 수율 발린 역가
BF100 36 27 29 5.2
BF100-1030 42 22 25 3.3
ilvB의 RV1B5 대립유전자를 염색체로 통합시켜서 생산한 발린 영양완서체 균주로부터의 감소된 L-발린 역가의 미량발효 측정
균주 성장율 리신 역가 % 수율 발린 역가
BF100 89 134 43 9
BF100-1030 78 123 44 6
기탁된 미생물에 관한 증명서(PCT Rule 13bis)
A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 8페이지의 16째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁의 확인추가 기탁물은 첨부한 용지에서 확인됨
기탁 기관의 명칭:Agricultural Research Culture Collection(NRRL)
기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 일리노이주 61604 페오리아 엔.유니버시티 스트리트 1815
기탁일: 1999.6.29 수탁 번호: NRRL B-30149
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) LC10
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용 국제 사무국용
이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자 권한을 가진 자
기탁된 미생물에 관한 증명서(PCT Rule 13bis)
A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 8페이지의 17째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁의 확인추가 기탁물은 첨부한 용지에서 확인됨
기탁 기관의 명칭:Agricultural Research Culture Collection(NRRL)
기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함):미국 일리노이주 61604 페오리아 엔.유니버시티 스트리트 1815
기탁일: 1999.6.29 수탁 번호: NRRL B-30150
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 용지에 계속됨
코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) BF100-1030
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 별도 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 사무국에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용 국제 사무국용
이 용지는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 용지는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자 권한을 가진 자

Claims (24)

  1. 아미노산 X를 생산하는 미생물 C로서, 상기 미생물 C는
    (a) 덱스트로스로부터 상기 아미노산을 퍼센트 수율 Y로 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계,
    (b) (i) 무작위 화학적 돌연변이유발법, 및 (ii) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜서 미생물 B를 생산하는 단계,
    (c) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계 (b)로부터 선별하는 단계, 및
    (d) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계 (c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 퍼센트 수율 Y보다 크다]
    에 의해 얻어지는 것인 미생물 C.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 X는
    (a) 글리신,
    (b) 알라닌,
    (c) 메티오닌,
    (d) 페닐알라닌
    (e) 트립토판,
    (f) 프롤린,
    (g) 세린,
    (h) 트레오닌,
    (i) 시스테인,
    (j) 티로신,
    (k) 아스파라긴,
    (l) 글루타민,
    (m) 아스파르트산,
    (n) 글루타민산,
    (o) 리신,
    (p) 아르기닌, 및
    (q) 히스티딘
    으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 미생물 C.
  3. 제2항에 있어서, 미생물 A는
    (a) 코리네박테리아(Corynebacterium),
    (b) 브레비박테리아(Brevibacterium), 및
    (c) E. 콜리(E. Coli)
    로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 미생물 C.
  4. 제3항에 있어서, 미생물 B는 발린 및 이소로이신에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 것이 특징인 미생물 C.
  5. 제3항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이유발법은 무작위 화학적 돌연변이유발법인 것이 특징인 미생물 C.
  6. 제3항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이유발법은 ilvBN 오페론의 특정 부위에 대한 돌연변이유발법인 것이 특징인 미생물 C.
  7. (a) 분지쇄 아미노산 이소로이신, 로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 특성, 및
    (b) 배지에서 배양하였을 때,
    (i) 글리신,
    (ii) 알라닌,
    (iii) 메티오닌,
    (iv) 페닐알라닌
    (v) 트립토판,
    (vi) 프롤린,
    (vii) 세린,
    (viii) 트레오닌,
    (ix) 시스테인,
    (x) 티로신,
    (xi) 아스파라긴,
    (xii) 글루타민,
    (xiii) 아스파르트산,
    (xiv) 글루타민산,
    (xv) 리신,
    (xvi) 아르기닌, 및
    (xvii) 히스티딘
    으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산을 생산하는 특성, 및
    (c) 덱스트로스로부터 단계 (b)의 아미노산을 약 30% 이상의 수율로 생산하는 특성
    을 갖는 미생물 코리네박테리아의 균주.
  8. 제7항에 있어서, ilvBN 오페론에 돌연변이가 일어난 것을 추가 특징으로 하는 미생물.
  9. 제8항에 있어서, ilvBN 오페론 돌연변이가 결실, 삽입 또는 점 돌연변이인것이 특징인 미생물.
  10. 제9항에 있어서, ilvBN 오페론 돌연변이가 서열번호 3 또는 서열번호 5의 서열을 특징으로 하는 미생물.
  11. NRRL 기탁번호 B-30149의 확인 특성을 갖는 미생물 코리네박테리아의 균주.
  12. NRRL 기탁번호 B-30150의 확인 특성을 갖는 미생물 코리네박테리아의 균주.
  13. 아미노산 X의 생산을 증가시키는 방법으로서,
    (a) 덱스트로스로부터 상기 아미노산을 퍼센트 수율 Y로 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계,
    (b) (i) 무작위 화학적 돌연변이유발법, 및 (ii) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜서 미생물 B를 생산하는 단계,
    (c) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계 (b)로부터 선별하는 단계, 및
    (d) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계 (c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 퍼센트 수율 Y보다 크다]
    를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 X는
    (a) 글리신,
    (b) 알라닌,
    (c) 메티오닌,
    (d) 페닐알라닌
    (e) 트립토판,
    (f) 프롤린,
    (g) 세린,
    (h) 트레오닌,
    (i) 시스테인,
    (j) 티로신,
    (k) 아스파라긴,
    (l) 글루타민,
    (m) 아스파르트산,
    (n) 글루타민산,
    (o) 리신,
    (p) 아르기닌, 및
    (q) 히스티딘
    으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 미생물 A는
    (a) 코리네박테리아,
    (b) 브레비박테리아, 및
    (c) E. 콜리
    로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 미생물 B는 발린 및 이소로이신에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 것이 특징인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 단계 (b)의 돌연변이유발법은 무작위 화학적 돌연변이유발법인 것이 특징인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 단계 (b)의 돌연변이유발법은 ilvBN 오페론의 특정 부위에 대한 돌연변이유발법인 것이 특징인 방법.
  19. (a) (i) 덱스트로스로부터 아미노산 X를 퍼센트 수율 Y로 생산하는 부모 미생물 A를 선별하는 단계,
    (ii) (1) 무작위 화학적 돌연변이유발법, 및 (2) ilvBN 오페론의 rDNA 돌연변이유발법으로 구성되는 군에서 선택된 방법으로 상기 부모 미생물 A를 돌연변이시켜서 미생물 B를 생산하는 단계,
    (iii) 분지쇄 아미노산 로이신, 이소로이신 및 발린 중 하나 이상에 대해 영양요구성인 하나 이상의 돌연변이된 미생물 B를 단계 (b)로부터 선별하는 단계, 및
    (iv) 덱스트로스로부터 상기 아미노산 X를 퍼센트 수율 Z로 생산하는 하나 이상의 미생물 C를 단계 (c)로부터 선별하는 단계[이때, 퍼센트 수율 Z는 퍼센트 수율 Y보다 크다]의 방법에 의해 얻어진 미생물 C를 배양하는 단계, 및
    (b) 상기 미생물 C로부터 생산되는 아미노산 X를 회수하는 단계
    를 포함하는 아미노산 X를 생산하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 아미노산 X는
    (a) 글리신,
    (b) 알라닌,
    (c) 메티오닌,
    (d) 페닐알라닌
    (e) 트립토판,
    (f) 프롤린,
    (g) 세린,
    (h) 트레오닌,
    (i) 시스테인,
    (j) 티로신,
    (k) 아스파라긴,
    (l) 글루타민,
    (m) 아스파르트산,
    (n) 글루타민산,
    (o) 리신,
    (p) 아르기닌, 및
    (q) 히스티딘
    으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 미생물 A는
    (a) 코리네박테리아,
    (b) 브레비박테리아, 및
    (c) E. 콜리
    로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 미생물 B는 발린 및 이소로이신에 대해 영양요구성 또는 영양완서성인 것이 특징인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이유발법은 무작위 화학적 돌연변이유발법인 것이 특징인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 단계 (ii)의 돌연변이유발법은 ilvBN 오페론의 특정 부위에 대한 돌연변이유발법인 것이 특징인 방법.
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