CN101573438B

CN101573438B - 具有增加的l-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产l-赖氨酸的方法

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Publication number: CN101573438B
Application number: CN2007800341803A
Authority: CN
Inventors: 朴英薰; 林相曹; 文准玉; 罗昭妍; 李熙宗; 张在佑; 权刀显; 金孝珍; 成珍锡; 金亨俊
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2007-09-17
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2027-09-17
Also published as: EP2066782A4; WO2008033001A1; JP2015171366A; EP3170889A1; KR20080025355A; EP2066782A1; CN101573438A; AU2007295159B2; JP2017221202A; JP5756259B2; JP6695308B2; US20100143984A1; AU2007295159A1; US9109242B2; BRPI0716980A2; KR100924065B1; JP2010503395A

Abstract

本发明公开了一种棒状杆菌(Corynebacterium)变体，其显示出比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶以及另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更大的活性，以及使用所述变体产生L-赖氨酸的方法。

Description

具有增加的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及棒状杆菌(Corynebacterium)变体，其显示出比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶(dicarboxylase)以及另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更大的活性，以及使用所述变体生产L-赖氨酸的方法。

发明背景

棒状杆菌，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是革兰氏阳性微生物，其被广泛用于生产L-氨基酸。在L-氨基酸中，L-赖氨酸可应用于各种工业中，包括动物饲料、制药和化妆品工业。对于在这些工业中的使用，通常使用棒状杆菌菌株经发酵生产L-赖氨酸。

固着有(anchoring)参与赖氨酸生物合成的增强基因的棒状杆菌菌株以及生产L-赖氨酸的方法是本领域众所周知的。例如，美国专利号6,746,855公开了具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因(lysineexport carrier gene))的棒状杆菌菌株，向其另外引入选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因，以及通过培养该菌株生产L-赖氨酸的方法。美国专利号6,221,636公开了携带重组DNA的棒状细菌(coryneform bacterium)，该重组DNA包含编码天冬氨酸激酶的DNA序列——其中L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制活性被基本上脱敏，以及包括编码二氨基庚二酸二脱羧酶(decarboxylase)的DNA序列。

在本发明之前公开的任何文件中都没有提及这样的棒状杆菌种(Corynebacterium spp.)，其显示出比其内源活性更高的参与赖氨酸生物合成途径的六种酶的活性，这六种酶是天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶。此外，在本发明之前公开的任何文件中未发现除了这六种酶之外，显示出比丙酮酸羧化酶的内源活性更高活性的棒状杆菌种。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供棒状杆菌菌株，所述菌株具有比参与赖氨酸生物合成途径的六种酶的内源活性更高的活性，这六种酶是天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶。

本发明的另一个目的是提供棒状杆菌菌株，所述菌株具有除了比这六种酶内源活性更高之外，比丙酮酸羧化酶的内源活性更高的活性。

本发明的另一个目的是提供使用该微生物生产L-赖氨酸的方法。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了固着有天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶的棒状杆菌(Corynebacteria)菌株，这些酶显示出比它们各自的内源活性更高的活性。

根据其另一方面，提供了棒状杆菌菌株，其中除了所述六种酶外，丙酮酸羧化酶的活性高于其内源活性。

根据进一步的方面，提供了使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。

本发明的棒状杆菌菌株以比内源水平高的水平显示出七种酶的活性。根据本发明的提高的酶活性是基于各种因素，包括基因拷贝数增加、用更有效的启动子替换天然启动子以及旨在增加活性的人工突变。更详细地，基因拷贝数可以通过外源等位基因的引入和/或内源基因的扩增而增加。至于基因启动子的置换，其例子包括引入外源启动子——其具有有效活性来表达其下游结构基因并置换内源基因启动子。使用本领域熟知的方法，例如通过在合适的条件下培养，可以容易实现基因扩增。

根据本发明的一方面，本发明棒状细菌的特征是在其核DNA中除了内源基因aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA之外，存在至少一个拷贝的aspB(编码天冬氨酸转氨酶的基因)、lysC(编码天冬氨酸激酶的基因)、asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因)、dapA(编码二氢吡啶二羧酸合成酶的基因)、dapB(编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因)和lysA(编码二氨基庚二酸二羧化酶的基因)中。在该方面的改进中，有效的外源启动子可以位于各自结构基因起始密码子的上游。

根据本发明的另一方面，本发明棒状细菌的特征是在带有至少一个拷贝的aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA位于其中的核DNA中，除了内源pyc基因外，存在至少一个拷贝的pyc(丙酮酸羧化酶)基因。。在该方面的改进中，有效的外源启动子位于pyc基因起始密码子的上游，而有效的外源启动子置换六个各自基因的内源启动子。

只要它属于棒状杆菌属(Corynebacterium)，任何棒状细菌可以用作导入基因的亲本菌株。用于本发明的棒状杆菌微生物的例子包括谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentu)ATCC13869，和由其衍生的L-氨基酸生产突变体或菌株，诸如谷氨酸棒状杆菌KFCC10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC11001，优选谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。

在本发明的棒状杆菌微生物中，aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc分别具有SEQ ID NOS.：25、26、27、28、29、30和37的核苷酸序列，每个序列包含天然的启动子和终止密码子。

本发明的棒状杆菌微生物可以是转化有分别具有图2至6切割图谱的载体pDZ-2aspB、pDZ-2lysC/asd、pDZ-2dapA/dapB、pDZ-2lysA和pDZ-2pyc的棒状细菌。这些载体可以以预先确定的顺序或同时引入。如上所述，各自的外源启动子可以位于基因起始密码子的上游。优选地，微生物在基因组DNA中固着至少一个另外各自的aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc拷贝。在可选的或更优选的实施方式中，有效的外源启动子被插入在每一基因的起始密码子和内源启动子之间。可以使用本领域熟知的方法——例如同源重组来实现外源基因插入基因组DNA。

本发明中特别有用的是谷氨酸棒状杆菌KFCC-1008-CJ5，登录号为KCCM10770P。该菌株可以获自谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881，通过引入分别具有图2至5切割图谱的pDZ-2aspB、pDZ-2lysC/asd、pDZ-2dapA/dapB和pDZ-2lysA，在选择培养基中培养转化体，以使得外源基因aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA与各自的内源等位基因进行同源重组，从而将两个拷贝的aspB、lysC、asd、dapA、dapB和lysA固着在其基因组DNA中。该菌株可以以高于亲本菌株的效率生产L-赖氨酸。通过将具有图6切割图谱的载体pDZ-2pyc另外引入转化体以将两个pyc拷贝固着在基因组DNA中，可以进一步增加L-赖氨酸生产效率。

根据本发明的另一方面，本发明提供以高产率生产L-赖氨酸的方法，该方法包括将异源启动子插入在单个基因的天然启动子和起始密码子之间。

在本发明的实施方式中，用各自异源有效的CJ7启动子替换赖氨酸生物合成基因的启动子。在本发明中有用的CJ7启动子是有效的启动子，其具有SEQ ID NO.44的核苷酸序列，获自之前由本申请人开发的(韩国专利号KR-0620092)产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)。一旦谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的lysC表达，发现CJ7启动子增加天冬氨酸激酶的活性是内源启动子的两倍。虽然在这里只给出CJ7启动子的例子，但是应该理解的是韩国专利号KR-0620092公开的CJ1至CJ6启动子可以以与CJ7启动子使用的同样方式应用于产赖氨酸菌株的制备，所述CJ1至CJ6启动子分别具有SEQ ID NOS.：45至50的核苷酸序列，获自产氨棒状杆菌。因此，CJ1至CJ6启动子以及CJ7 启动子落入的范围，所述异源启动子用于增加根据本发明的感兴趣基因的表达水平。

根据其进一步的方面，本发明提供生产L-赖氨酸的方法，包括：

培养本发明的微生物以在细胞内表达L-赖氨酸或将L-赖氨酸释放至培养基；和

从细胞或培养基回收L-赖氨酸。

培养步骤进一步如下文解释。

根据本发明的L-赖氨酸生产方法中的微生物如上文所述。

对于培养步骤，可以采用本领域熟知的各种方法中的其中一种方法。棒状杆菌菌株可以以分批方法或连续方法培养，诸如补料分批方法或反复补料分批方法。

对于在培养中使用，培养基必须满足待被培养的菌株的要求。棒状杆菌某些种的培养基是本领域熟知的(例如，Manual of Methods forGeneral Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.，USA，1981)。用于培养的碳源的例子包括糖类和碳水化合物——诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素和类似物，油和脂类——诸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油和类似物，脂肪酸——诸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和类似物，醇类——诸如丙三醇、乙醇和类似物，以及有机酸——诸如乙酸。这些物质可以单独使用或组合使用。用于本发明细菌的培养基中的氮源的代表有蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浸泡固体(corn steep solid)、大豆粉、尿素和无机化合物诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用。磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其钠盐可以作为氮源用于培养基中。而且，培养基需要金属盐，诸如硫酸镁或硫酸离子，作为微生物生长的必须成分。此外，培养基中包含其它必要成分，诸如氨基酸和维生素。代替这些成分本身，可以使用它们的前体。这些成分可以以分批方式或连续方式加入到微生物培养基中。

培养基的pH可以用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水，或酸性化合物诸如磷酸或硫酸调节。可以加入消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇醚以防止泡沫产生。可以通过将氧或含氧气体(如空气)注入培养基维持有氧状态。当培养生物体时，培养基可以维持在20至45℃的范围内，优选25至40℃的范围。培养持续进行，直到L-氨基酸的生产达到最大。在这点上，达到L-赖氨酸最大量要10至160小时。该氨基酸可以释放到培养基中或可以保留在细胞中。

回收步骤如下进行。从细胞或培养基回收L-赖氨酸是本领域熟知的。L-赖氨酸回收方法的例子包括但不限于：过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC。

有利效果

因为具有比天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶和另外的丙酮酸羧化酶的内源活性更高的酶活性，所以本发明的棒状杆菌微生物可以以更高的产率生产L-赖氨酸。

因此，特征在于使用棒状杆菌微生物的方法可以应用于L-赖氨酸的高产率生产。

附图简述

图1是显示载体pDZ的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图2是显示载体pDZ-2aspB的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图3是显示载体pDZ-2lysC/asd的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图4是显示载体pDZ-2dapA/dapB的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图5是显示载体pDZ-2lysA的示意图，所述载体用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图6是显示载体pDZ-2pyc的示意图，所述载体用用于核靶向基因进入棒状杆菌。

图7是显示载体pDZ-PCJ7的示意图。

图8是显示载体pDZ-PCJ7/aspB的示意图。

图9是显示载体pDZ-PCJ7/lysC的示意图。

图10是显示载体pDZ-PCJ7/dapA的示意图。

图11是显示载体pDZ-PCJ7/dapB的示意图。

图12是显示载体pDZ-PCJ7/lysA的示意图。

图13是显示载体pDZ-PCJ7/pyc的示意图。

实施发明的最佳方式

通过下述实施例可以获得对本发明更好的理解，这些实施例被阐述以举例说明本发明，而不被解释为对本发明的限制。

实施例1：用于核靶向基因的载体pDZ的构建和使用该载体插入基因

基于大肠杆菌(E.coli)克隆载体pACYC177(New EnglandBiolab，GenBank登录号X06402)，如下构建携带棒状杆菌染色体的重组载体pDZ。

使用Klenow酶使得用AcuI和BanI限制性酶处理得到的pACYC177载体消化物变成平端。对于用作选择标记，如下制备大肠杆菌的lacZ基因：通过PCR从大肠杆菌K12 W3110的核DNA进行基因扩增，设计成含有其启动子，然后进行5′末端磷酸化作用，并用T4 DNA聚合酶或多核苷酸激酶产生平端。这两个DNA片段被相互连接以得到环状DNA分子，然后将含有许多限制性位点的人工合成的接头插入环状DNA分子的限制性位点BamHI，以构建核靶向到棒状杆菌的基因的载体pDZ。图1是显示载体pDZ的示意图，所述载体用于将基因核靶向到棒状杆菌。

之后，感兴趣基因被插入棒状杆菌的核DNA。为达到这一目的，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-L-赖氨酸生产菌株，通过电穿孔用含有两个串联的感兴趣基因的拷贝的pDZ载体转化(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的电脉冲方法)，并在含有25 mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选转化体，其中感兴趣基因由于同源性被插入到染色体中。在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的固体培养基上出现蓝色表明成功地用载体将基因插入核DNA。将最初的核插入菌株振荡培养在营养肉汤中(30℃，8小时)，然后从10^-4连续稀释至10^-10，之后涂布在含有X-gal的固体培养基上。生长的大部分的克隆染有蓝色。选择白色克隆，其是生长的克隆的少数。这些二次选择的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列，因为它通过交换从基因组除去。最后测试这些菌株对卡那霉素的敏感性，并在最终选择之前通过PCR分析基因结构。

实施例2：通过突变制备产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)

要插入负责赖氨酸生物合成途径的基因的菌株以谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)为基础，谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)对S-(2-氨乙基)半胱氨酸(S-(2-aminoethyl)cysteine，以后称为“AEC”)具有抗性，并且是高丝氨酸渗漏型的(homoserine-leaky)。

从野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)制备突变体菌株KFCC-10881。含有10⁷～10⁸细胞/ml浓度母株的培养基用500μg/ml的诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，之后称为“NTG”)在30℃处理30min，然后选择在含有5g/l AEC的复合板上生长的克隆。分析初级突变体菌株的ACE抗性和赖氨酸生产力后，用NTG进行次级突变。将由此形成的许多克隆用牙签挑入基本培养基，该基本培养基补充或不补充高丝氨酸以分离高丝氨酸营养缺陷型(次级突变体)，高丝氨酸营养缺陷型不能在缺少高丝氨酸的基本培养基上生长。使高丝氨酸营养缺陷型进行三级突变，以产生高丝氨酸-渗漏型菌株，其通过在含有10mg/L高丝氨酸的基本培养基中温育进行鉴定。检查在培养基中生长的菌株的赖氨酸生产力(表1)。得到的产赖氨酸菌株——其是AEC抗性的以及高丝氨酸渗漏的，保藏在韩国联邦菌物保藏中心(Korean Federation of Culture Collection)，登录号为KFCC-10881。在本实施例中使用的基本培养基和生产培养基描述如下。

表1

基本培养基(pH 7.0)

葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

实施例3：产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的aspB基因的克隆，重组载体(pDZ-2aspB)的构建和固着aspB的菌株的制备

对参与赖氨酸生物合成途径的aspB基因进行PCR，用实施例2中制备的产赖氨酸的PCR谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板。从NIH GenBank数据获得关于aspB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0237)的信息，并用于设计两对引物，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表2)。

表2

引物	碱基序列	SEQ ID NO.
			F-aspB-Sma I_P1	ccc ggg gcg gtt cag cta gag tta tgc	1
R-aspB-Hind III_P2	aag ctt tta gtt agc gta atg ctc cgc	2
			F-aspB-Hind III_P3	aag ctt gcg gtt cag cta gag tta tgc	3
R-aspB-Nhe I_P4	gct agc tta gtt agc gta atg ctc cgc	4

使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸2分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的aspB基因(aspB-A和aspB-B)，每一种含有1,493bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ IDNOS.1和2以及一组SEQ ID NOS.3和4产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-aspB-A和pCR-aspB-B。这些pCR载体分别用对aspB-A和aspB-B的相反端特异的限制性酶(aspB-A：SmaI+HindIII、aspB-B：HindIII+NheI)处理，以从pCR载体分离aspB基因。这些片段通过3-片连接(3-piece ligation)克隆入pDZ载体的EcoRV-NheI位点，以产生重组载体pDZ-2aspB，其中克隆有串联的两个aspB拷贝。图2是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2aspB载体的图谱。

重组载体pDZ-2aspB被转化入实施例2中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881中，然后通过交换在核DNA中紧靠aspB基因插入另外的aspB基因拷贝，以产生固着有两个aspB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1。使用引物对SEQID NOS.17和18(表3)，通过PCR证实两个aspB基因拷贝的相邻定位，引物对SEQ ID NOS.17和18设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。

表3

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			F-M-aspB	gca gtg gac tgt ccc tgc	17
R-M-aspB	cct gca gcg aaa ctg aac tc	18

实施例4：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的lysC/asd基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysC/asd)的构建和固着lysC/asd的菌株的制备

从NIH GenBank的数据获得关于lysC/asd基因的碱基序列 (NCBI登记号NC_003450，Ncgl0247～0248)的信息，并用于设计两对引物，以扩增从启动子区域到终止密码子的aspB基因(表4)，方式同实施例3。

表4

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			lysC-F1(BamHI)	ttg cac gga tcc cag ggt agt tga cta aag	5
asd-R1(SmaI)	atg gat ccc ggg tat caa cgc gtc ggt aga	6
			lysC-F2(SmaI)	ttg cac ccc ggg cag ggt agt tga cta aag	7
asd-R2(PvuI)	atg gat cga tcg tat caa cgc gtc ggt aga	8

使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.1和2或寡核苷酸SEQ ID NOS.3和4作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：在96℃变性30秒，在52℃退火30秒，在72℃延伸3分钟。

发现由此获得的PCR产物是两种类型的lysC/asd基因：lysC/asd-A和lysC/asd-B，每一种含有2,805bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.5和6以及一组SEQ ID NOS.7和8产生。在TOPO克隆试剂盒(TOPO Cloning Kit)(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-lysC/asd-A和pCR-lysC/asd-B。

这些pCR载体分别用对lysC/asd-A和lysC/asd-B的相反端特异的限制性酶(lysC/asd-A：BamHI+SmaI，lysC/asd-B：SmaI+PvuI)处理，以从pCR载体分离lysC/asd基因。这些片段通过3-片连接反应克隆入pDZ载体的BamHI-PvuI位点，以构建重组载体pDZ-2lysC/asd，其中克隆有串联的两个lysC/asd拷贝。图3是核靶向入棒状杆菌的基因的pDZ-2lysC/asd载体的图谱。

重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例3中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ1中，然后通过交换在核DNA中紧靠 lysC/asd基因插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有两个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ2。使用一组引物(表5)，通过PCR鉴定两个aspB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计用于扩增两个aspB基因拷贝之间的接触区域。

表5

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			lysC-2	cat ggc gag gat ccc gtt aga aat acg ctc	19
asd-1	ttc acg ccg aat tcg aca agg caa tca ccg	20

实施例5：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的dapA/dapB基因的克隆，重组载体(pDZ-2dapA/dapB)的构建和固着有dapA/dapB的菌株的制备

从NIH GenBank的数据获得关于dapA/dapB基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1896～1898)的信息。dapA基因被确定包含dapB基因和具有位于它们之间的功能未知的ORF(Ncgl1897)的操纵子。信息被用于设计两对引物，以扩增范围从dapB启动子到终止密码子的全dapB-ORF(Ncgl1897)-dapA基因(表6)。

表6

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			Dap-EcoRI-F	gac gaa ttc tca ttg gcg ttt ccg gat cc	9
Dap-Sac I-R	tca gag ctc aca agc gcc aag gaa cta cc	10
			Dap-SacI-F	tga gag ctc tca ttg gcg ttt ccg gat cc	11
Dap-XhoI-R	tgt ctc gag aca agc gcc aag gaa cta cc	12

使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.9和10或寡核苷酸SEQ ID NOS.11和12作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸3分钟。

发现由此获得的PCR产物是两种类型的dapA/dapB基因：dapA/dapB-A和dapA/dapB-B，每一种含有3,210bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.9和10以及一组SEQ ID NOS.11和12产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-dapA/dapB-A和pCR-dapA/dapB-B。

这些PCR载体用对dapA/dapB-A和dapA/dapB-B的相反端特异的相应限制性酶(dapA/dapB-A：EcoRI+SacI，dapA/dapB-B：SacI+XhoI)处理，以从PCR载体分离dapA/dapB基因。这些片段通过3-片连接(3-pieceligation)克隆入pDZ载体的EcoRI-XhoI位点，以构建重组载体pDZ-2dapA/dapB，其中克隆有串联的两个dapA/dapB拷贝。图4是pDZ-2dapA/dapB载体的图谱。

重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例4中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ2中，然后通过交换在核DNA中紧靠dapA/dapB基因插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有两个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ3。使用一组引物对(表7)，通过PCR鉴定两个dapA/dapB基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。

表7

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			Dap-seq-3	agg cat ttc att ggc a	21
Dap-seq-5	ttt gcg tgc cgc agc a	22

实施例6：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的lysA基因的克隆，重组载体(pDZ-2lysA)的构建和固着lysA的菌株的制备

从NIH GenBank数据获得关于lysA基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl1132～1133)的信息。经分析，lysA基因包含argS基因(精氨酰-tRNA合成酶)和操纵子。该信息被用于设计两对引物，以扩增范围从argS启动子到终止密码子的全argS-lysA基因(表8)。

表8

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			FargHN1	ATT AAG CTT TGC ATG GGC ACGTCG ATG	13
RargHN1	ATT GCG GCC GCT CCA CGG CGAAGG TGA AG	14
			FargNX2	ATT GCG GCC GCT GCA TGG GCACGT CGA TG	15
RargNX2	ATT CTA GAT CCA CGG CGA AGGTGA AG	16

使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.13和14或寡核苷酸SEQ ID NOS.15和1 6作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。

发现由此获得的PCR产物是两种类型的argS/lysA基因：argS/lysA-A和argS/lysA-B，每一种含有3,359bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.13和14以及一组SEQ ID NOS.15和16产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，得到重组载体pCR-argS/lysA-A和pCR-argS/lysA-B。

这些pCR载体用对argS/lysA-A和argS/lysA-B的相反端特异的相应限制性酶(argS/lysA-A：HindIII+NotI，argS/lysA-B：NotI+XbaI)处理，以从PCR载体分离argS/lysA基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的HindIII-XbaI位点，以构建重组载体pDZ-2lysA，其中克隆有串联的两个argS/lysA拷贝。图5是pDZ-2lysA载体的图谱。

重组载体pDZ-2lysA被转化入实施例5中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ3中，然后通过交换在核DNA中紧靠lysA基因插入另外的lysA基因拷贝，以产生固着有两个lysA基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4。使用一组引物(表9)，通过PCR确定两个lysA基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个lysA基因拷贝之间的接触区域。

表9

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			2lysAR	GAGATC AGC TGGTGT CAT GG	23
2lysAF5	ATC CAC AGC GAA CTG GGC G	24

产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4——其固着有六个负责体内赖氨酸生物合成的基因，于2006年8月21日保藏在韩国联邦菌物保藏中心，登录号KCCM10770P。

实施例7：产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生的pycGene的克隆，重组载体(pDZ-2pyc)的构建和固着pyc的菌株的制备

从NIH GenBank数据获得关于pyc基因的碱基序列(NCBI登记号NC_003450，Ncgl0659)的信息，并用于设计两对引物)，以扩增范围从启动子区域到终止密码子的pyc基因(表10)，方式如实施例3。

表10

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			pyc-XbaI-F	ggc tct aga agg att gct ttg tgc act cct g	31
pyc-EcoRV-R	gaa gat atc gag cct tgg tct cca tct tc	32
			pyc-EcoRV-F	gaa gat atc agg att gct ttg tgc act cct g	33
pyc-HindIII-R	gac aag ctt gag cct tgg tct cca tct tc	34

使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板以及使用一组寡核苷酸SEQ ID NOS.31和32或寡核苷酸SEQ ID NOS.33和34作为引物，在PfuUltra^TM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下进行PCR，进行如下30个循环：96℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟。发现由此获得的PCR产物是两种类型的pyc基因：pyc-A和pyc-B，每一种含有3,925bp-长的启动子区域，其分别用一组SEQ ID NOS.31和 32以及一组SEQ ID NOS.33和34产生。在TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)帮助下，将PCR产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，以得到重组载体pCR-pyc-A和pCR-pyc-B。

这些pCR载体用对pyc-A和pyc-B的相反端特异的相应限制性酶(pyc-A：XbaI和EcoRV，pyc-B：EcoRV和HindIII)处理，以从pCR载体分离pyc基因。这些片段通过3-片连接克隆入pDZ载体的XbaI-HindIII位点，以构建重组载体pDZ-2pyc，其中克隆有串联的两个pyc拷贝。图6是pDZ-2pyc载体的图谱。

重组载体pDZ-2pyc被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4中，然后通过交换在核DNA中紧靠pycA基因插入另外的pycA基因拷贝，以产生固着有两个pyc基因拷贝的产赖氨酸的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5。使用一组引物(表11)，通过PCR确定两个pyc基因拷贝的相邻定位，所述一组引物设计成扩增两个pyc基因拷贝之间的接触区域。

表11

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			2pyc-F	ctg agg aag agc agg cgc acc tcg	35
2pyc-R	ttc cgc aca ctc gcg ggc aag ctg	36

结果，产赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ5固着有七个参与赖氨酸生物合成的基因。

实施例8：从固着负责赖氨酸生物合成的基因的菌株生产赖氨酸

培养分别在实施例6和7中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5，以生产L-赖氨酸，如下所述。

将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ5接种在含有25ml下述种子培养基的240ml-角挡板瓶(corner baffle flask)中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

种子培养基(pH 7.0)

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、盐酸硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺2000□(于1升蒸馏水中)。

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC10881-CJ4和KFCC10881-CJ5培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表12中。

表12

从表12可见，发现与母株KFCC-10881相比，固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4增加赖氨酸生产力约7％。而且，测量到与母株KFCC-10881相比，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5获得约8％的赖氨酸生产增加，谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ5除了六种赖氨酸生物合成基因外还固着有pyc基因。

实施例9：固着三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备

实施例4中制备的重组载体pDZ-2lysC/asd被转化入实施例6中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻lysC/asd基因拷贝插入另外的lysC/asd基因拷贝，以产生固着有三个lysC/asd基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6。使用一组引物(表13)，通过PCR确定串联的三个lysC/asd基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个lysC/asd基因拷贝之间的接触区域。

表13

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			3lysC-F	ggg cga att ctg cag at	38
3lysC-R	atc tgc aga att cgc cc	39

经发现，产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6的天冬氨酸激酶活性为KFCC10881-CJ4的2.1倍，这通过根据Pechere J.F.和Capony J.P.(Anal Biochem 22：536-539，1968)使用天冬氨酰异羟肟酸(aspartyl hydroxamate)的方法测量(表14)。

表14

菌株	天冬氨酸激酶活性(倍数)
		KFCC10881-CJ4	1
KFCC10881-CJ6	2.1

实施例10：固着三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-衍生菌株的制备

实施例5中制备的重组载体pDZ-2dapA/dapB被转化入实施例9中制备的产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ6，然后通过交换在核DNA中紧靠两个相邻dapA/dapB基因拷贝插入另外的dapA/dapB基因拷贝，以产生固着有三个dapA/dapB基因拷贝的产赖氨酸菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ7。使用一组引物(表15)，通过PCR确定串联的三个dapA/dapB基因拷贝的排列，所述一组引物设计成扩增三个dapA/dapB基因拷贝之间的接触区域。

表15

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			3lysC-F	aaa cgc caa tga gag ctc tca	40
3lysC-R	ctt ggc gct tgt gag ctc tga	41

实施例11：从固着负责赖氨酸生物合成的复合基因的菌株生产赖氨酸

培养在实施例10中制备的产L-赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7，以生产L-赖氨酸，如下所述。

将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

种子培养基(pH 7.0)

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖100g、(NH₄)₂SO₄ 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□、CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ4和KFCC-10881-CJ7培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表16中。

表16

从表16可见，发现与母株KFCC-10881-CJ4相比，参与赖氨酸生物合成的三个基因以三副本方式固着的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-CJ7增加赖氨酸生产力约11％。

实施例12：启动子置换载体的构建和置换赖氨酸生物合成基因的外源启动子的菌株的制备

基于pDZ，对于赖氨酸生物合成基因，用外源有效CJ7启动子置换天然启动子。CJ7启动子是强大的、产氨棒状杆菌-衍生的启动子，其具有SEQ ID NOS.44至50表示的碱基。它公开在韩国专利号0620092中，授权给本申请人。当谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的核lysC在CJ7启动子存在下表达时，发现天冬氨酸激酶活性被提高到使用固有启动子的2倍高。

如下制备将CJ7启动子引入产赖氨酸菌株的核DNA的载体。

首先，用限制性酶XbaI和NdeI处理pDZ载体。在作为引物的SEQ ID NOS.42和43(表17)存在下进行PCR，所述引物设计用于将XbaI和NdeI位点分别插入在PCR产物的5′-和3′-端，所述PCR产物由产氨棒状杆菌的核DNA的CJ7启动子扩增得到。在用XbaI和NdeI处理后，CJ7启动子PCR产物被连接到截短的pDZ载体，以得到pDZ-PCJ7载体，其用作将CJ7启动子引入菌株的核DNA的初级质粒(图7)。

表17

引物	碱基序列	SEQ ID NOS.
			PCJ7-F-XbaI	tct agaaga aac atc cca gcg cta c	42
PCJ7-R-NdeI	cat atggag tgt ttc ctt tcg ttg	43

用实施例2中制备的产赖氨酸菌株谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的核DNA作为模板，进行PCR，以获得两种类型的DNA片段，该片段是CJ7启动子置换引入核DNA的基因各自的天然启动子所必需的，也就是从碱基+2起向下游方向延伸的大约300bp长的部分天然启动子片段和大约300bp长的部分ORF。设计这样的用于PCR的引物，以便XbaI位点插入在部分天然启动子片段的PCR产物的相反端，NdeI位点插入在部分ORF的PCR产物的相反端。这些PCR产物用各自的限制性酶处理。pDZ-PCJ7用XbaI消化以连接到部分天然启动子片段的截短的PCR产物，然后用NdeI消化以连接到部分ORF的截短的PCR产物，从而构建重组质粒，分别称为pDZ-PCJ7-aspB、pDZ-PCJ7-lysCasd、pDZ-PCJ7-dapA、pDZ-PCJ7-dapB、pDZ-PCJ7-argSlysA和pDZ-PCJ7-pyc，每一种包含位于两个PCR DNA片段之间的CJ7启动子(图8至13)。

质粒被用于目标基因的重组，如下所述。首先，将重组载体pDZ-PCJ7-aspB转化入产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881，然后在核DNA中aspB基因的启动子区域进行与CJ7启动子的交换。以同样的方式，其它重组质粒被转化以产生新菌株KFCC-10881-PCJ7-5，其中CJ7启动子位于aspB、lysCasd、dapA、dapB和argSlysA基因的启动子区域中。除了启动子，pyc基因的启动子用CJ7启动子置换以产生KFCC-10881-PCJ7-6。

实施例13：在具有赖氨酸生物合成基因的外源启动子的菌株中生产赖氨酸

培养产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6，以产生L-赖氨酸，如下所述。

将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6接种在含有25ml下述种子培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml的每一培养物接种入含有24ml下述生产培养基的250ml-角挡板瓶中，并于30℃以200rpm振荡培养120小时。种子培养基和生产培养基包含下面的组合物。

种子培养基(pH 7.0)

生产培养基(pH 7.0)

葡萄糖100g、(NH₄)₂SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浸泡固体5g、尿素3g、KH₂PO4 1g、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、生物素100□、氯化硫胺素1000□、泛酸钙2000□、烟酰胺3000□和CaCO₃ 30g(于1升蒸馏水中)。

培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株生产的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、KFCC-10881-PCJ7-5和KFCC-10881-PCJ7-6培养物中的L-赖氨酸浓度总结在下表18中。

表18

从表18可见，发现与母株KFCC-10881相比，其中固着有六个参与赖氨酸生物合成的基因和它们各自的外源CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-5，以及除了六个基因和启动子外还固着pyc基因和其CJ7启动子的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881-PCJ7-6，分别增加赖氨酸生产力约17.4％和18.6％。

实施例14：在固着负责赖氨酸生物合成的额外基因和具有其置换的外源启动子的菌株中，赖氨酸生物合成酶的活性

分析分别在实施例6、10和12中制备的产L-赖氨酸菌株——谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CJ4、KFCC10881-CJ7和 KFCC-10881-PCJ7-5——的天冬氨酸激酶和二氨基庚二酸二羧化酶活性，这两种酶作为赖氨酸生物合成酶的代表，原因是它们的活性相对容易被测量。对于天冬氨酸激酶活性通过Pechere J.F.和Capony J.P.(AnalBiochem 22：536-539，1968)的方法测量，对于二氨基庚二酸二羧化酶活性通过J.Cremer等人的方法测量，发现与起始母株KFCC10881(表19)相比，修饰的产赖氨酸菌株增加酶活性。

表19

<110>CJ株式会社

<120>具有增加的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌

和使用其生产L-赖氨酸的方法

<150>KR1020060089672

<151>2006-09-15

<160>50

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的正向引物

<400>1

cccggggcgg ttcagctaga gttatgc 27

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的反向引物

<400>2

aagcttttag ttagcgtaat gctccgc 27

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的正向引物

<400>3

aagcttgcgg ttcagctaga gttatgc 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>aspB扩增的反向引物

<400>4

gctagcttag ttagcgtaat gctccgc 27

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的正向引物

<400>5

ttgcacggat cccagggtag ttgactaaag 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的反向引物

<400>6

atggatcccg ggtatcaacg cgtcggtaga 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的正向引物

<400>7

ttgcaccccg ggcagggtag ttgactaaag 30

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>lysCasd扩增的反向引物

<400>8

atggatcgat cgtatcaacg cgtcggtaga 30

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的正向引物

<400>9

gacgaattct cattggcgtt tccggatcc 29

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的反向引物

<400>10

tcagagctca caagcgccaa ggaactacc 29

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的正向引物

<400>11

tgagagctct cattggcgtt tccggatcc 29

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dapAdapB扩增的反向引物

<400>12

tgtctcgaga caagcgccaa ggaactacc 29

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的正向引物

<400>13

attaagcttt gcatgggcac gtcgatg 27

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的反向引物

<400>14

attgcggccg ctccacggcg aaggtgaag 29

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的正向引物

<400>15

attgcggccg ctgcatgggc acgtcgatg 29

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>argSlysA扩增的反向引物

<400>16

attctagatc cacggcgaag gtgaag 26

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

gcagtggact gtccctgc 18

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

cctgcagcga aactgaactc 20

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

catggcgagg atcccgttag aaatacgctc 30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

ttcacgccga attcgacaag gcaatcaccg 30

<210>21

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

aggcatttca ttggca 16

<210>22

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

tttgcgtgcc gcagca 16

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gagatcagct ggtgtcatgg 20

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

atccacagcg aactgggcg 19

<210>25

<211>1488

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400>25

gcggttcagc tagagttatg cgaaggatcc cgtgcggcgt ttatcttgtg aactccccca 60

gggcaggaat gcagcaaggg tcagcgagct ctgacgggtg cgcgggatcc cctaaaacgt 120

ctagagtagt ggcttgaggt cactgctctt tttttgtgcc cttttttggt ccgtctattt 180

tgccaccaca tgcggaggta cgcagttatg agttcagttt cgctgcagga ttttgatgca 240

gagcgaattg gtttgttcca cgaggacatt aagcgcaagt ttgatgagct caagtcaaaa 300

aatctgaagc tggatcttac tcgcggtaag ccttcgtcgg agcagttgga tttcgctgat 360

gagttgttgg cgttgcctgg taagggtgat ttcaaggctg cggatggtac tgatgtccgt 420

aactatggcg ggctggatgg catcgttgat attcgccaga tttgggcgga tttgctgggt 480

gttcctgtgg agcaggtctt ggcgggggat gcttcgagct tgaacatcat gtttgatgtg 540

atcagctggt cgtacatttt cggtaacaat gattcggttc agccttggtc gaaggaagaa 600

accgttaagt ggatttgccc tgttccgggc tatgatcgcc atttctccat cacggagcgt 660

ttcggctttg agatgatttc tgtgccaatg aatgaagacg gccctgatat ggatgctgtt 720

gaggaattgg tgaagaatcc gcaggttaag ggcatgtggg ttgttccggt gttttctaac 780

ccgactggtt tcacggtgac agaagacgtc gcaaagcgtc taagcgcaat ggaaaccgca 840

gctccggact tccgcgttgt gtgggataat gcctacgccg ttcatacgct gaccgatgaa 900

ttccctgagg ttatcgatat cgtcgggctt ggtgaggccg ctggcaaccc gaaccgtttc 960

tgggcgttca cttctacttc gaagatcact ctcgcgggtg cgggcgtgtc gttcttcctc 1020

acctctgcgg agaaccgcaa gtggtacacc ggccatgcgg gtatccgtgg cattggccct 1080

aacaaggtca atcagttggc tcatgcgcgt tactttggcg atgctgaggg agtgcgcgcg 1140

gtgatgcgta agcatgctgc gtcgttggct ccgaagttca acaaggttct ggagattctg 1200

gattctcgcc ttgctgagta cggtgtcgcg cagtggactg tccctgcggg cggttacttc 1260

atttcccttg atgtggttcc tggtacggcg tctcgcgtgg ctgagttggc taaggaagcc 1320

ggcatcgcgt tgacgggtgc gggttcttct tacccgctgc gtcaggatcc ggagaacaaa 1380

aatctccgtt tggcaccgtc gctgcctcca gttgaggaac ttgaggttgc catggatggc 1440

gtggctacct gtgtgctgtt ggcagcagcg gagcattacg ctaactaa 1488

<210>26

<211>1506

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>26

cagggtagtt gactaaagag ttgctcgcga agtagcacct gtcacttttg tctcaaatat 60

taaatcgaat atcaatatat ggtctgttta ttggaacgcg tcccagtggc tgagacgcat 120

ccgctaaagc cccaggaacc ctgtgcagaa agaaaacact cctctggcta ggtagacaca 180

gtttattgtg gtagagttga gcgggtaact gtcagcacgt agatcgaaag gtgcacaaag 240

gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 300

aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 360

tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 420

ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 480

gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 540

ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 600

gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 660

aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 720

ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 780

accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 840

atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 900

cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 960

attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 1020

gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 1080

aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 1140

tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 1200

cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1260

gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1320

accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1380

tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1440

ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1500

cgctaa 1506

<210>27

<211>1299

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>27

agttttaaag gagtagtttt acaatgacca ccatcgcagt tgttggtgca accggccagg 60

tcggccaggt tatgcgcacc cttttggaag agcgcaattt cccagctgac actgttcgtt 120

tctttgcttc cccacgttcc gcaggccgta agattgaatt ccgtggcacg gaaatcgagg 180

tagaagacat tactcaggca accgaggagt ccctcaagga catcgacgtt gcgttgttct 240

ccgctggagg caccgcttcc aagcagtacg ctccactgtt cgctgctgca ggcgcgactg 300

ttgtggataa ctcttctgct tggcgcaagg acgacgaggt tccactaatc gtctctgagg 360

tgaacccttc cgacaaggat tccctggtca agggcattat tgcgaaccct aactgcacca 420

ccatggctgc gatgccagtg ctgaagccac ttcacgatgc cgctggtctt gtaaagcttc 480

acgtttcctc ttaccaggct gtttccggtt ctggtcttgc aggtgtggaa accttggcaa 540

agcaggttgc tgcagttgga gaccacaacg ttgagttcgt ccatgatgga caggctgctg 600

acgcaggcga tgtcggacct tatgtttcac caatcgctta caacgtgctg ccattcgccg 660

gaaacctcgt cgatgacggc accttcgaaa ccgatgaaga gcagaagctg cgcaacgaat 720

cccgcaagat tctcggtctc ccagacctca aggtctcagg cacctgcgtc cgcgtgccgg 780

ttttcaccgg ccacacgctg accattcacg ccgaattcga caaggcaatc accgtggacc 840

aggcgcagga gatcttgggt gccgcttcag gcgtcaagct tgtcgacgtc ccaaccccac 900

ttgcagctgc cggcattgac gaatccctcg ttggacgcat ccgtcaggac tccactgtcg 960

acgataaccg cggtctggtt ctcgtcgtat ctggcgacaa cctccgcaag ggtgctgcgc 1020

taaacaccat ccagatcgct gagctgctgg ttaagtaaaa acccgccatt aaaaactccg 1080

cttgagtgct acactttaag cggggtttta atgtttgagg ggcgatgggg gtcgagcttg 1140

tgaagtggaa ttttccacaa gttttaagtt tctttagcag gggaaacact gctgatagca 1200

ctagcgataa agaacatgaa aatgcaacgg agctagcggc cgaagcttta gcggatgtca 1260

tttttcagtg gaaaaactgg gtctaccgac gcgttgata 1299

<210>28

<211>1422

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>28

cgcaaagctc acacccacga gctaaaaatt catatagtta agacaacatt tttggctgta 60

aaagacagcc gtaaaaacct cttgctcgtg tcaattgttc ttatcggaat gtggcttggg 120

cgattgttat gcaaaagttg ttaggttttt tgcggggttg tttaaccccc aaatgaggga 180

agaaggtaac cttgaactct atgagcacag gtttaacagc taagaccgga gtagagcact 240

tcggcaccgt tggagtagca atggttactc cattcacgga atccggagac atcgatatcg 300

ctgctggccg cgaagtcgcg gcttatttgg ttgataaggg cttggattct ttggttctcg 360

cgggcaccac tggtgaatcc ccaacgacaa ccgccgctga aaaactagaa ctgctcaagg 420

ccgttcgtga ggaagttggg gatcgggcga agctcatcgc cggtgtcgga accaacaaca 480

cgcggacatc tgtggaactt gcggaagctg ctgcttctgc tggcgcagac ggccttttag 540

ttgtaactcc ttattactcc aagccgagcc aagagggatt gctggcgcac ttcggtgcaa 600

ttgctgcagc aacagaggtt ccaatttgtc tctatgacat tcctggtcgg tcaggtattc 660

caattgagtc tgataccatg agacgcctga gtgaattacc tacgattttg gcggtcaagg 720

acgccaaggg tgacctcgtt gcagccacgt cattgatcaa agaaacggga cttgcctggt 780

attcaggcga tgacccacta aaccttgttt ggcttgcttt gggcggatca ggtttcattt 840

ccgtaattgg acatgcagcc cccacagcat tacgtgagtt gtacacaagc ttcgaggaag 900

gcgacctcgt ccgtgcgcgg gaaatcaacg ccaaactatc accgctggta gctgcccaag 960

gtcgcttggg tggagtcagc ttggcaaaag ctgctctgcg tctgcagggc atcaacgtag 1020

gagatcctcg acttccaatt atggctccaa atgagcagga acttgaggct ctccgagaag 1080

acatgaaaaa agctggagtt ctataaatat gaatgattcc cgaaatcgcg gccggaaggt 1140

tacccgcaag gcgggcccac cagaagctgg tcaggaaaac catctggata cccctgtctt 1200

tcaggcacca gatgcttcct ctaaccagag cgctgtaaaa gctgagaccg ccggaaacga 1260

caatcgggat gctgcgcaag gtgctcaagg atcccaagat tctcagggtt cccagaacgc 1320

tcaaggttcc cagaaccgcg agtccggaaa caacaaccgc aaccgttcca acaacaaccg 1380

tcgcggtggt cgtggacgtc gtggatccgg aaacgccaat ga 1422

<210>29

<211>1787

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>29

acaagcgcca aggaactacc tgcggaacgg gcggtgaagg gcaacttaag tctcatattt 60

caaacatagt tccacctgtg tgattaatcc ctagaacgga acaaactgat gaacaatcgt 120

taacaacaca gaccaaaacg gtcagttagg tatggatatc agcaccttct gaacgggtac 180

gtctagactg gtgggcgttt gaaaaactct tcgccccacg aaaatgaagg agcataatgg 240

gaatcaaggt tggcgttctc ggagccaaag gccgtgttgg tcaaactatt gtggcagcag 300

tcaatgagtc cgacgatctg gagcttgttg cagagatcgg cgtcgacgat gatttgagcc 360

ttctggtaga caacggcgct gaagttgtcg ttgacttcac cactcctaac gctgtgatgg 420

gcaacctgga gttctgcatc aacaacggca tttctgcggt tgttggaacc acgggcttcg 480

atgatgctcg tttggagcag gttcgcgact ggcttgaagg aaaagacaat gtcggtgttc 540

tgatcgcacc taactttgct atctctgcgg tgttgaccat ggtcttttcc aagcaggctg 600

cccgcttctt cgaatcagct gaagttattg agctgcacca ccccaacaag ctggatgcac 660

cttcaggcac cgcgatccac actgctcagg gcattgctgc ggcacgcaaa gaagcaggca 720

tggacgcaca gccagatgcg accgagcagg cacttgaggg ttcccgtggc gcaagcgtag 780

atggaatccc ggttcatgca gtccgcatgt ccggcatggt tgctcacgag caagttatct 840

ttggcaccca gggtcagacc ttgaccatca agcaggactc ctatgatcgc aactcatttg 900

caccaggtgt cttggtgggt gtgcgcaaca ttgcacagca cccaggccta gtcgtaggac 960

ttgagcatta cctaggcctg taaaggctca tttcagcagc gggtggaatt ttttaaaagg 1020

agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt ggagttgata gcgtgcagtt 1080

cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt tgagggcgcg gaagcactcg 1140

tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa gccgaaccct cgaactgctt 1200

ccaatgctgc gtatctgcgc cacatcatgg aagtggggca cactgctttg cttgagcatg 1260

ccaatgccac gatgtatatc cgaggcattt ctcggtccgc gacccatgaa ttggtccgac 1320

accgccattt ttccttctct caactgtctc agcgtttcgt gcacagcgga gaatcggaag 1380

tagtggtgcc cactctcatc gatgaagatc cgcagttgcg tgaacttttc atgcacgcca 1440

tggatgagtc tcggttcgct ttcaatgagc tgcttaatgc gctggaagaa aaacttggcg 1500

atgaaccgaa tgcactttta aggaaaaagc aggctcgtca agcagctcgc gctgtgctgc 1560

ccaacgctac agagtccaga atcgtggtgt ctggaaactt ccgcacctgg aggcatttca 1620

ttggcatgcg agccagtgaa catgcagacg tcgaaatccg cgaagtagcg gtagaatgtt 1680

taagaaagct gcaggtagca gcgccaactg ttttcggtga ttttgagatt gaaactttgg 1740

cagacggatc gcaaatggca acaagcccgt atgtcatgga cttttaa 1787

<210>30

<211>3360

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>30

tgcatgggca cgtcgatgct gccacattga gcggaggcaa tatctacctg aggtgggcat 60

tcttcccagc ggatgttttc ttgcgctgct gcagtgggca ttgataccaa aaaggggcta 120

agcgcagtcg aggcggcaag aactgctact acccttttta ttgtcgaacg gggcattacg 180

gctccaagga cgtttgtttt ctgggtcagt taccccaaaa agcatataca gagaccaatg 240

atttttcatt aaaaaggcag ggatttgtta taagtatggg tcgtattctg tgcgacgggt 300

gtacctcggc tagaatttct ccccatgaca ccagctgatc tcgcaacatt gattaaagag 360

accgcggtag aggttttgac ctcccgcgag ctcgatactt ctgttcttcc ggagcaggta 420

gttgtggagc gtccgcgtaa cccagagcac ggcgattacg ccaccaacat tgcattgcag 480

gtggctaaaa aggtcggtca gaaccctcgg gatttggcta cctggctggc agaggcattg 540

gctgcagatg acgccattga ttctgctgaa attgctggcc caggcttttt gaacattcgc 600

cttgctgcag cagcacaggg tgaaattgtg gccaagattc tggcacaggg cgagactttc 660

ggaaactccg atcacctttc ccacttggac gtgaacctcg agttcgtttc tgcaaaccca 720

accggaccta ttcaccttgg cggaacccgc tgggctgccg tgggtgactc tttgggtcgt 780

gtgctggagg cttccggcgc gaaagtgacc cgcgaatact acttcaacga tcacggtcgc 840

cagatcgatc gtttcgcttt gtcccttctt gcagcggcga agggcgagcc aacgccagaa 900

gacggttatg gcggcgaata cattaaggaa attgcggagg caatcgtcga aaagcatcct 960

gaagcgttgg ctttggagcc tgccgcaacc caggagcttt tccgcgctga aggcgtggag 1020

atgatgttcg agcacatcaa atcttccctg catgagttcg gcaccgattt cgatgtctac 1080

taccacgaga actccctgtt cgagtccggt gcggtggaca aggccgtgca ggtgctgaag 1140

gacaacggca acctgtacga aaacgagggc gcttggtggc tgcgttccac cgaattcggc 1200

gatgacaaag accgcgtggt gatcaagtct gacggcgacg cagcctacat cgctggcgat 1260

atcgcgtacg tggctgataa gttctcccgc ggacacaacc taaacatcta catgttgggt 1320

gctgaccacc atggttacat cgcgcgcctg aaggcagcgg cggcggcact tggctacaag 1380

ccagaaggcg ttgaagtcct gattggccag atggtgaacc tgcttcgcga cggcaaggca 1440

gtgcgtatgt ccaagcgtgc aggcaccgtg gtcaccctag atgacctcgt tgaagcaatc 1500

ggcatcgatg cggcgcgtta ctccctgatc cgttcctccg tggattcttc cctggatatc 1560

gatctcggcc tgtgggaatc ccagtcctcc gacaaccctg tgtactacgt gcagtacgga 1620

cacgctcgtc tgtgctccat cgcgcgcaag gcagagacct tgggtgtcac cgaggaaggc 1680

gcagacctat ctctactgac ccacgaccgc gaaggcgatc tcatccgcac actcggagag 1740

ttcccagcag tggtgaaggc tgccgctgac ctacgtgaac cacaccgcat tgcccgctat 1800

gctgaggaat tagctggaac tttccaccgc ttctacgatt cctgccacat ccttccaaag 1860

gttgatgagg atacggcacc aatccacaca gcacgtctgg cacttgcagc agcaacccgc 1920

cagaccctcg ctaacgccct gcacctggtt ggcgtttccg caccggagaa gatgtaacaa 1980

tggctacagt tgaaaatttc aatgaacttc ccgcacacgt atggccacgc aatgccgtgc 2040

gccaagaaga cggcgttgtc accgtcgctg gtgtgcctct gcctgacctc gctgaagaat 2100

acggaacccc actgttcgta gtcgacgagg acgatttccg ttcccgctgt cgcgacatgg 2160

ctaccgcatt cggtggacca ggcaatgtgc actacgcatc taaagcgttc ctgaccaaga 2220

ccattgcacg ttgggttgat gaagaggggc tggcactgga cattgcatcc atcaacgaac 2280

tgggcattgc cctggccgct ggtttccccg ccagccgtat caccgcgcac ggcaacaaca 2340

aaggcgtaga gttcctgcgc gcgttggttc aaaacggtgt gggacacgtg gtgctggact 2400

ccgcacagga actagaactg ttggattacg ttgccgctgg tgaaggcaag attcaggacg 2460

tgttgatccg cgtaaagcca ggcatcgaag cacacaccca cgagttcatc gccactagcc 2520

acgaagacca gaagttcgga ttctccctgg catccggttc cgcattcgaa gcagcaaaag 2580

ccgccaacaa cgcagaaaac ctgaacctgg ttggcctgca ctgccacgtt ggttcccagg 2640

tgttcgacgc cgaaggcttc aagctggcag cagaacgcgt gttgggcctg tactcacaga 2700

tccacagcga actgggcgtt gcccttcctg aactggatct cggtggcgga tacggcattg 2760

cctataccgc agctgaagaa ccactcaacg tcgcagaagt tgcctccgac ctgctcaccg 2820

cagtcggaaa aatggcagcg gaactaggca tcgacgcacc aaccgtgctt gttgagcccg 2880

gccgcgctat cgcaggcccc tccaccgtga ccatctacga agtcggcacc accaaagacg 2940

tccacgtaga cgacgacaaa acccgccgtt acatcgccgt ggacggaggc atgtccgaca 3000

acatccgccc agcactctac ggctccgaat acgacgcccg cgtagtatcc cgcttcgccg 3060

aaggagaccc agtaagcacc cgcatcgtgg gctcccactg cgaatccggc gatatcctga 3120

tcaacgatga aatctaccca tctgacatca ccagcggcga cttccttgca ctcgcagcca 3180

ccggcgcata ctgctacgcc atgagctccc gctacaacgc cttcacacgg cccgccgtcg 3240

tgtccgtccg cgctggcagc tcccgcctca tgctgcgccg cgaaacgctc gacgacatcc 3300

tctcactaga ggcataacgc ttttcgacgc ctgaccccgc ccttcacctt cgccgtggag 3360

3360

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的正向引物

<400>31

ggctctagaa ggattgcttt gtgcactcct g 31

<210>32

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的反向引物

<400>32

gaagatatcg agccttggtc tccatcttc 29

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的正向引物

<400>33

gaagatatca ggattgcttt gtgcactcct g 31

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pyc扩增的反向引物

<400>34

gacaagcttg agccttggtc tccatcttc 29

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>35

ctgaggaaga gcaggcgcac ctcg 24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>36

ttccgcacac tcgcgggcaa gctg 24

<210>37

<211>3925

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<400>37

aggattgctt tgtgcactcc tgggttttca ctttgttaag cagttttggg gaaaagtgca 60

aagtttgcaa agtttagaaa tattttaaga ggtaagatgt ctgcaggtgg aagcgtttaa 120

atgcgttaaa cttggccaaa tgtggcaacc tttgcaaggt gaaaaactgg ggcggggtta 180

gatcctgggg ggtttatttc attcactttg gcttgaagtc gtgcaggtca ggggagtgtt 240

gcccgaaaac attgagagga aaacaaaaac cgatgtttga ttgggggaat cgggggttac 300

gatactagga cgcagtgact gctatcaccc ttggcggtct cttgttgaaa ggaataatta 360

ctctagtgtc gactcacaca tcttcaacgc ttccagcatt caaaaagatc ttggtagcaa 420

accgcggcga aatcgcggtc cgtgctttcc gtgcagcact cgaaaccggt gcagccacgg 480

tagctattta cccccgtgaa gatcggggat cattccaccg ctcttttgct tctgaagctg 540

tccgcattgg taccgaaggc tcaccagtca aggcgtacct ggacatcgat gaaattatcg 600

gtgcagctaa aaaagttaaa gcagatgcca tttacccggg atacggcttc ctgtctgaaa 660

atgcccagct tgcccgcgag tgtgcggaaa acggcattac ttttattggc ccaaccccag 720

aggttcttga tctcaccggt gataagtctc gcgcggtaac cgccgcgaag aaggctggtc 780

tgccagtttt ggcggaatcc accccgagca aaaacatcga tgagatcgtt aaaagcgctg 840

aaggccagac ttaccccatc tttgtgaagg cagttgccgg tggtggcgga cgcggtatgc 900

gttttgttgc ttcacctgat gagcttcgca aattagcaac agaagcatct cgtgaagctg 960

aagcggcttt cggcgatggc gcggtatatg tcgaacgtgc tgtgattaac cctcagcata 1020

ttgaagtgca gatccttggc gatcacactg gagaagttgt acacctttat gaacgtgact 1080

gctcactgca gcgtcgtcac caaaaagttg tcgaaattgc gccagcacag catttggatc 1140

cagaactgcg tgatcgcatt tgtgcggatg cagtaaagtt ctgccgctcc attggttacc 1200

agggcgcggg aaccgtggaa ttcttggtcg atgaaaaggg caaccacgtc ttcatcgaaa 1260

tgaacccacg tatccaggtt gagcacaccg tgactgaaga agtcaccgag gtggacctgg 1320

tgaaggcgca gatgcgcttg gctgctggtg caaccttgaa ggaattgggt ctgacccaag 1380

ataagatcaa gacccacggt gcagcactgc agtgccgcat caccacggaa gatccaaaca 1440

acggcttccg cccagatacc ggaactatca ccgcgtaccg ctcaccaggc ggagctggcg 1500

ttcgtcttga cggtgcagct cagctcggtg gcgaaatcac cgcacacttt gactccatgc 1560

tggtgaaaat gacctgccgt ggttccgact ttgaaactgc tgttgctcgt gcacagcgcg 1620

cgttggctga gttcaccgtg tctggtgttg caaccaacat tggtttcttg cgtgcgttgc 1680

tgcgggaaga ggacttcact tccaagcgca tcgccaccgg attcattgcc gatcacccgc 1740

acctccttca ggctccacct gctgatgatg agcagggacg catcctggat tacttggcag 1800

atgtcaccgt gaacaagcct catggtgtgc gtccaaagga tgttgcagct cctatcgata 1860

agctgcctaa catcaaggat ctgccactgc cacgcggttc ccgtgaccgc ctgaagcagc 1920

ttggcccagc cgcgtttgct cgtgatctcc gtgagcagga cgcactggca gttactgata 1980

ccaccttccg cgatgcacac cagtctttgc ttgcgacccg agtccgctca ttcgcactga 2040

agcctgcggc agaggccgtc gcaaagctga ctcctgagct tttgtccgtg gaggcctggg 2100

gcggcgcgac ctacgatgtg gcgatgcgtt tcctctttga ggatccgtgg gacaggctcg 2160

acgagctgcg cgaggcgatg ccgaatgtaa acattcagat gctgcttcgc ggccgcaaca 2220

ccgtgggata caccccgtac ccagactccg tctgccgcgc gtttgttaag gaagctgcca 2280

gctccggcgt ggacatcttc cgcatcttcg acgcgcttaa cgacgtctcc cagatgcgtc 2340

cagcaatcga cgcagtcctg gagaccaaca ccgcggtagc cgaggtggct atggcttatt 2400

ctggtgatct ctctgatcca aatgaaaagc tctacaccct ggattactac ctaaagatgg 2460

cagaggagat cgtcaagtct ggcgctcaca tcttggccat taaggatatg gctggtctgc 2520

ttcgcccagc tgcggtaacc aagctggtca ccgcactgcg ccgtgaattc gatctgccag 2580

tgcacgtgca cacccacgac actgcgggtg gccagctggc aacctacttt gctgcagctc 2640

aagctggtgc agatgctgtt gacggtgctt ccgcaccact gtctggcacc acctcccagc 2700

catccctgtc tgccattgtt gctgcattcg cgcacacccg tcgcgatacc ggtttgagcc 2760

tcgaggctgt ttctgacctc gagccgtact gggaagcagt gcgcggactg tacctgccat 2820

ttgagtctgg aaccccaggc ccaaccggtc gcgtctaccg ccacgaaatc ccaggcggac 2880

agttgtccaa cctgcgtgca caggccaccg cactgggcct tgcggatcgt ttcgaactca 2940

tcgaagacaa ctacgcagcc gttaatgaga tgctgggacg cccaaccaag gtcaccccat 3000

cctccaaggt tgttggcgac ctcgcactcc acctcgttgg tgcgggtgtg gatccagcag 3060

actttgctgc cgatccacaa aagtacgaca tcccagactc tgtcatcgcg ttcctgcgcg 3120

gcgagcttgg taaccctcca ggtggctggc cagagccact gcgcacccgc gcactggaag 3180

gccgctccga aggcaaggca cctctgacgg aagttcctga ggaagagcag gcgcacctcg 3240

acgctgatga ttccaaggaa cgtcgcaata gcctcaaccg cctgctgttc ccgaagccaa 3300

ccgaagagtt cctcgagcac cgtcgccgct tcggcaacac ctctgcgctg gatgatcgtg 3360

aattcttcta cggcctggtc gaaggccgcg agactttgat ccgcctgcca gatgtgcgca 3420

ccccactgct tgttcgcctg gatgcgatct ctgagccaga cgataagggt atgcgcaatg 3480

ttgtggccaa cgtcaacggc cagatccgcc caatgcgtgt gcgtgaccgc tccgttgagt 3540

ctgtcaccgc aaccgcagaa aaggcagatt cctccaacaa gggccatgtt gctgcaccat 3600

tcgctggtgt tgtcaccgtg actgttgctg aaggtgatga ggtcaaggct ggagatgcag 3660

tcgcaatcat cgaggctatg aagatggaag caacaatcac tgcttctgtt gacggcaaaa 3720

tcgatcgcgt tgtggttcct gctgcaacga aggtggaagg tggcgacttg atcgtcgtcg 3780

tttcctaaac ctttctgtaa aaagccccgc gtcttcctca tggaggaggc ggggcttttt 3840

gggccaagat gggagatggg tgagttggat ttggtctgat tcgacacttt taagggcaga 3900

gatttgaaga tggagaccaa ggctc 3925

<210>38

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

gggcgaattc tgcagat 17

<210>39

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

atctgcagaa ttcgccc 17

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>40

aaacgccaat gagagctctc a 21

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>41

cttggcgctt gtgagctctg a 21

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>42

tctagaagaa acatcccagc gctac 25

<210>43<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>43

catatggagt gtttcctttc gttg 24

<210>44

<211>318

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)CJHB100

<400>44

agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60

gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120

catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180

cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240

agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300

caacgaaagg aaacactc 318

<210>45

<211>301

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>45

caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60

gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120

caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180

gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240

tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 300

a 301

<210>45

<211>285

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>46

aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60

atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120

cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180

atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240

aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285

<210>47

<211>291

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>47

gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60

gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120

gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180

caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240

aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291

<210>48

<211>312

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>48

actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60

ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120

cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180

gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240

caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300

ggaggacata ca 312

<210>49

<211>249

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>49

tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60

ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120

gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180

ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240

acaactacc 249

<210>50

<211>332

<212>DNA

<213>产氨棒状杆菌CJHB100

<400>50

ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60

aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120

acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180

cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240

gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300

aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332

Claims

1.一种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)微生物，其与天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸二羧化酶各自的内源活性相比，具有增加的酶活性，其中所述酶增加的酶活性归因于aspB基因、lysC基因、asd基因、dapA基因、dapB基因和lysA基因的表达增加，所述表达增加是由于引入了一个或多个外源拷贝的所述基因或由于引入了每个所述基因的外源启动子。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其与丙酮酸羧化酶的内源活性相比，进一步具有增加的酶活性，其中所述酶增加的酶活性归因于pyc基因的表达增加，所述表达增加是由于引入了一个或多个拷贝的外源基因或由于引入了所述基因的外源启动子。

3.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述微生物是用具有登录号KFCC10881的棒状细菌制备的。

4.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述aspB基因、所述lysC基因、所述asd基因、所述dapA基因、所述dapB基因、所述lysA基因和所述pyc基因分别具有SEQ ID NOS.25、26、27、28、29、30和37的核苷酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述外源基因的引入通过分别将载体pDZ-2aspB、pDZ-2lysC/asd、pDZ-2dapA/dapB、pDZ-2lysA、pDZ-2pyc转化入棒状细菌而进行。

6.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述外源等位基因被固着在所述微生物的核DNA中。

7.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述微生物是具有登录号KCCM10770P的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881-CJ4。

8.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子具有SEQ ID NOS.44至50其中之一所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求8所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子是SEQ ID NO.44的核苷酸序列。

10.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒状杆菌微生物，其中所述外源启动子通过将载体pDZ-PCJ7/aspB、pDZ-PCJ7/lysC、pDZ-PCJ7/dapA、pDZ-PCJ7/dapB、pDZ-PCJ7/lysA、pDZ-PCJ7/pyc中至少一种载体引入棒状细菌而引入。

11.一种生产L-赖氨酸的方法，其包括：

培养权利要求1至10任一项所述的微生物；和

从所述微生物的细胞或细胞培养物中回收赖氨酸。