KR101721722B1

KR101721722B1 - L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 l-발린 생산방법

Info

Publication number: KR101721722B1
Application number: KR1020130025528A
Authority: KR
Inventors: 김혜원; 이지혜; 송병철; 김종현; 이한형; 전애지
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2017-04-10
Also published as: PH12015501906B1; BR112015020274B1; WO2014142463A1; JP6359037B2; EP2975114A4; JP2016506756A; US10072278B2; ES2833104T3; HUE051725T2; CN105026550A; KR20140111421A; EP2975114A1; BR112015020274A2; PH12015501906A1; MY175182A; US20160108444A1; EP2975114B1; CN105026550B

Abstract

본 발명은 L-발린 오페론의 조절부위 내의 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 상기 신규의 L-발린 생산 균주를 이용하여 L-발린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
당해 신규의 발린 생산 균주 및 당해 균주를 이용하는 본 발명의 L-발린의 생산방법에 의하면, L-발린을 고효율 및 고수율로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

L-발린 생산능이 향상된 균주 및 이를 이용한 L-발린 생산방법{A microorganism having enhanced L-valine productivity and a method of producing L-valine using the microorganism}

본 발명은 유전자 조작을 통해 L-발린 생산능이 향상된 균주 및 당해 균주를 이용한 L-발린 생산방법에 관한 것이다.

분지쇄 아미노산 중 하나인 L-발린은 미생물에 있어서 피루브산으로부터 출발하여 아세토젖산(acetolactic acid), 디하이드록시 이소발레르산(dihydroxy isovaleric acid), 케토이소발레르산(ketoisovaleric acid)을 경유하여 생합성된다. 이러한 중간 대사산물들은 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase), 아세토하이드록시산 이소메로 리덕타아제(acetohydroxy acid isomeroreductase), 디하이드록시산 디하이드레타제(dihydroxy acid dehydratase), 트랜스아미나제 B(transaminase B)에 의하여 촉매된 반응에 의하여 생성된다. 그러나, 상기 효소들은 케토부티르산(ketobutyric acid)과 피루브산으로부터 시작되는 L-이소류신 생합성에도 관여하며, 중간대사물인 케토이소발레르산으로부터 2-이소프로필말산(2-isopropylmalic acid), 3-이소프로필말산(3-isopropylmalic acid), 케토이소카프로산(ketoisocaproic acid)을 경유하여 L-류신이 생합성되기도 한다. 따라서, 상기와 같이 분지쇄 아미노산, 즉 L-발린, L-이소류신, L-류신은 그 생합성 과정에 동일한 효소를 사용하기 때문에 한가지의 분지쇄 아미노산을 발효를 통해 공업적으로 제조하는 데는 어려움이 있는 것으로 알려져 있으며, 추가적으로 최종 산물인 L-발린 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 발생하여 이를 공업적으로 대량 제조하기에는 제약이 따른다는 문제점을 갖고 있다.

본 발명자들은 L-발린 생산능이 우수한 균주를 개발하기 위해 각고의 노력 끝에, L-발린 오페론의 조절부위가 불활성화되도록 형질전환시킨 균주가 모균주에 비해 L-발린 생산능이 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1990-0007948 B1 KR 10-2008-0025355 A1

본 발명의 목적은, L-발린 오페론의 조절부위 내의 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은, 상기 신규의 L-발린 생산 균주를 이용하여 L-발린을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 L-발린 오페론의 조절부위 변이체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-발린 오페론의 조절부위 내의 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체 가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 신규의 L-발린 생산 균주를 이용하여 L-발린을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 또는 4 로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-발린 오페론의 조절부위 변이체를 제공한다.

상기와 같이 본 발명의 신규의 L-발린 생산 균주는 L-발린 오페론의 조절부위 내의 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 생합성에 관여하는 효소 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase)의 발현이 증가됨으로 말미암아, L-발린의 생산능이 우수한 효과가 있다.

또한, 상기 신규의 발린 생산 균주를 이용하는 본 발명의 L-발린의 생산방법에 의하면, L-발린을 고효율 및 고수율로 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 ilvBN 오페론의 조절부위와 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손된 변이형 조절부위(DvalL), 리더펩티드 중 정지부위가 결손된 변이형 조절부위(DvalP), 리더펩티드 중 정지부위의 마지막 아미노산이 종결코돈으로 변이된 변이형 조절부위(DvalS)와 리더펩티드와 감쇠부위 모두가 결손된 변이형 조절부위(DvalA)를 포함하는 ilvBN 오페론의 대략적인 모식도이다.
도 2는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 ilvBN 오페론의 조절부위의 세부 모식도이다.
도 3은 도 1의 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손된 변이형 조절부위(DvalL)의 세부 모식도이다.
도 4는 도 1의 리더펩티드 중 정지부위가 결손된 변이형 조절부위(DvalP)의 세부 모식도이다.
도 5는 도 1의 리더펩티드 중 정지부위의 마지막 아미노산이 종결코돈으로 변이된 변이형 조절부위(DvalS)의 세부 모식도이다.
도 6은 도 1의 리더펩티드와 감쇠부위 모두가 결손된 변이형 조절부위(DvalA)의 세부 모식도이다.

본 발명은 L-발린 오페론의 조절부위 내의 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 L-발린 오페론(이하 'ilvBN 오페론'이라 함)은 L-발린 생산 미생물에서 L-발린의 생합성의 첫번째 단계에 관여하는 효소로 2분자의 피루브산(pyruvate)로부터 아세토젖산(acetolactate)을 합성하는 효소인 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase)를 암호화하는 유전자(ilvBN)를 포함한다.

더욱 상세히는, 상기 ilvBN 오페론은 프로모터(promotor), 리더펩티드(leader peptide)를 암호화하는 염기서열, 리더펩티드 내에 위치하는 정지부위(pause site) 및 감쇠부위(attenuator)를 포함하는 조절부위 및 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase)를 암호화하는 구조유전자(structural gene)를 포함한다(도 1 및 2 참조).

본 발명에서, 상기 ilvBN 오페론은 조절부위 중 리더펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어 상기 아세토하이드록시산 신타제(acetohydroxy acid synthase)를 암호화하는 구조유전자의 발현을 강화시킴으로서, L-발린의 생산능을 향상시킨 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 리더펩티드를 암호화하는 염기서열의 일부 결손 또는 치환 부위는 정지부위 내일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 일부 치환 부위가 정지부위의 말단부 염기서열이 종결코돈으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기와 같이 ilvBN 오페론의 조절부위 중 리더펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주를 제공하기 위해, 먼저, ilvBN 오페론의 조절부위 중 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환된 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다.

상기 벡터의 제작을 위해, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 우선 코리네박테리움 속 미생물의 염색체를 주형으로 Polymerase Chain Reaction을 통하여 ilvBN 오페론의 조절부위 중 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환된 염기서열을 갖는 조절부위(DvalL, DvalP, DvalS)를 증폭시키고, 상기 증폭된 조절부위를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작한 후, 상기 재조합 벡터로 모균주를 각각 형질전환시켰다.

상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 pDZ를 사용하였다. 상기 벡터 pDZ는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 삽입용 벡터로, 대한민국 공개 특허공보 제2008-0025355호에 개시된 방법에 따라 제조된다.

상기 벡터 pDZ에 상기 증폭된 조절부위(DvalL, DvalP, DvalS)를 각각 삽입하여 재조합 벡터 pDZDvalL, pDZDvalP, pDZDvalS를 제작하였다.

본 발명에서, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환되는 모균주는 L-발린을 생산할 수 있는 미생물이면 특별히 제한이 없으며, 바람직하게 에스케리키아 속 미생물이나 코리네박테리움 속 미생물이며, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이거나, 바람직하게는 L-발린 또는 이의 유도체에 대해 내성이 있는 L-발린 생산 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 사용할 수 있다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P는 본 발명자의 선행 등록특허 제10-1117022호에 개시된 균주로서, L-글루타민산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10661(Corynebacterium glutamicum KFCC 10661, 대한민국특허 출원번호 제1988-0016543; 공고번호 제1990-0007948호)을 모균주로 무작위 돌연변이를 수행한 후, 이소류신 유도체인 알파-아미노부티르산(α-Aminobutyric acid, ABA), 발린 유도체인 알파-하이드록시발린(α-hydroxyvaline, AHV), 티아졸알라닌(thiazole alanine, TA) 및 노르발린(Norvaline, NV)이 함께 첨가된 최소배지에 도말하여 각각에 대해 20 mM, 20 mM, 40 mM 및 50 mM 농도에 내성을 가지는 공통 내성 변이주로서, 상기 공통 내성 변이주는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10661에 비해 L-발린 생산량이 4배 이상 증가한 우수한 균주이다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 모균주로 하여 상기 재조합 벡터로 형질전환시킨 균주 KCCM11336P, KCCM11337P, KCCM11338P가 상기 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 비해 L-발린 생산능이 우수함을 확인하였다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P는 pDZ 벡터에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리더펩티드를 코딩하는 염기서열 전체가 결손된 변이형 조절부위(DvalL)가 삽입된 재조합 벡터 pDZDvalL로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 형질전환시킨 균주로서, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-456이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2012년 11월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11336P를 부여받았다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P는 pDZ 벡터에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리더펩티드 중 정지부위가 결손된 변이형 조절부위(DvalP)가 삽입된 재조합 벡터 pDZDvalP로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 형질전환시킨 균주로서, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-457이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2012년 11월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11337P를 부여받았다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P는 pDZ 벡터에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 리더펩티드 중 정지부위의 마지막 아미노산이 종결코돈으로 치환된 변이형 조절부위(DvalS)가 삽입된 재조합 벡터 pDZDvalS로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 형질전환시킨 균주로서, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-458이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2012년 11월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11338P를 부여받았다.

또한, 본 발명에서는, L-발린 생합성 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 벡터를 추가로 제작하고, 이를 이용해 공지의 야생형 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 형질전환시켜, L-발린 생합성 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 균주를 제공한다.

본 발명에서, 상기 L-발린 생합성 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 벡터의 제작을 위해 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA의 염색체를 주형으로 하여 PCR 방법을 통하여 벡터 삽입용 염기서열을 증폭하였고, 이를 pECCG117 벡터에 각각 삽입하여, 각각의 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-DvalW, pECCG117-DvalL, pECCG117-DvalP, pECCG117-DvalS 및 pECCG117-DvalA 를 제작하였다

그후, 상기 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-DvalW, pECCG117-DvalL, pECCG117-DvalP, pECCG117-DvalS 및 pECCG117-DvalA로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 형질전환시켜, L-발린 생합성 유전자 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalA를 제작하였다.

상기 균주 중 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 L-발린 생합성 유전자의 조절부위를 가지도록 형질전환된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW 에 비해 L-발린 생산능이 우수함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 L-발린 오페론의 조절부위 내의 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된 신규의 L-발린 생산 균주를 이용하여 L-발린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 L-발린을 생산하기 위해, 본 발명의 신규의 L-발린 생산 균주를 배양하는 방법은 당업계에 널리진 알려져 있는 코리네박테리움 속 미생물의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, “Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 그 외에, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다.

또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 원하는 L-발린의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-발린은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 L-발린 제조방법은, 세포 또는 배양물로부터 L-발린을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세포 또는 배양물로부터 L-발린을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시에에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : L-발린 생합성 유전자의 조절부위의 불활성화를 위해 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환된 염기서열을 포함하는 벡터 제작

도 1 및 2에 표시된, 프로모터(Pro), 리더펩티드를 암호화하는 염기서열(Leader peptide), 정지부위(Pause site), 감쇠부위(Attenuator)를 포함하는 조절부위와 구조유전자(gene)로 구성된, 아세토하이드록시산 신타제를 합성하는 L-발린 오페론(ilvBN)의 조절부위 중, 도 1과 같이 리더펩티드를 코딩하는 염기서열 전체가 결손된 변이형 조절부위(이하 'DvalL'이라 함), 리더펩티드 중 정지부위가 결손된 변이형 조절부위(이하 'DvalP'이라 함), 리더펩티드 중 정지부위의 마지막 아미노산이 종결코돈으로 치환된 변이형 조절부위(이하 'DvalS'라 함)와 리더펩티드와 감쇠부위 모두가 결손된 변이형 조절부위(이하 'DvalA'라 함)를 증폭하기 위해 미국 생물자원센터(American Type Culture Collection: ATCC)로부터 구매한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 염색체 DNA를 주형으로 Polymerase Chain Reaction(이하 'PCR 방법'이라 함)을 통하여 증폭하였다.

구체적으로, DvalL을 만들기 위해, 먼저 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 5와 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 중합하는 조건을 Pfu polymerase로 30회 반복하는 PCR 방법을 통하여 5'영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

두번째로, 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 방법을 통하여 3'영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편들은 GeneAll^R Expin^TM GEL SV키트(Seoul, Korea)로 분리한 후, crossover PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

그 후, 서열번호 5와 8의 프라이머를 이용해, 위에서 얻어진 두 DNA 단편을 주형으로 하여 crossover PCR을 수행하였다. 구체적으로 상기 기재된 PCR 방법을 통하여 약 2000개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 ligation을 통해 pDZDvalL를 제작하였다 .

DvalP를 만들기 위해, 먼저, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 5과 9의 프라이머를 이용해 5'영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

두번째로, 서열번호 10과 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 방법을 통하여 3'영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

그 후 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여 상기 기재된 crossover PCR 방법을 통해 약 2000개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI 과 XbaI 로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 ligation을 통해 pDZDvalP를 제작하였다.

DvalS를 만들기 위해, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 5와 11의 프라이머를 이용해 5'영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

두번째로, 서열번호 12와 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 방법을 통하여 3'영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

그후 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여 상기 기재된 crossover PCR 방법을 통해 약 2000개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI 과 XbaI 로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 ligation을 통해 pDZDvalS를 제작하였다.

DvalA를 만들기 위해, 먼저, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 5와 13의 프라이머를 이용해 5'영역에 BamHI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

두번째로, 서열번호 14와 8의 프라이머를 이용하여 상기 기재된 PCR 법을 통하여 3'영역에 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 700개 염기쌍의 단편을 증폭하였다.

그후 증폭된 두 DNA 단편을 주형으로 하여 상기 기재된 crossover PCR 방법을 통해 약 2000개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 ligation을 통해 pDZDvalA를 제작하였다.

아미노산 수준에서의 상기 리더펩티드 및 정지부위의 서열은 각각 서열번호 1, 2와 같고, DvalP 및 DvalS의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3 및 4와 같다.

또한, 발린 오페론 ilvBN의 조절부위 전체 염기서열, 리더펩티드 염기서열 및 정지부위 염기서열은 각각 서열번호 21, 22 및 23과 같으며, DvalL, DvalP, DvalS 및 DvalA의 염기서열은 각각 서열번호 24 내지 27과 같다.

실시예 2 : L-발린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 유래의 L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 균주의 제작

L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 균주를 제작하기 위해, 모균주로 L-발린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 사용하였다.

전기천공법에 의해 상기 실시예 1에서 제작된 pDZDvalL, pDZDvalP, pDZDvalS 및 pDZDvalA 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 각각 형질전환시켰다.

2차 교차 과정을 거쳐 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 염색체 상에서 L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 변이된 염기서열을 포함하고 있는 L-발린 생산균주를 각각 얻었다.

프로모터의 염기치환 여부는 DvalL의 경우 서열번호 15, DvalP의 경우 서열번호 16, DvalS의 경우 서열번호 17, DvalA의 경우 서열번호 18의 프라이머를 서열번호 8의 프라이머와 조합으로 사용하여 PCR을 통한 유전자 증폭 여부 및 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

상기 pDZDvalL, pDZDvalP, pDZDvalS 벡터로 형질전환된 균주를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-456, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-457, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-458이라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2012년 11월 19일자로 기탁하여 각각 기탁번호 KCCM11336P, KCCM11337P, KCCM11338P를 부여받았다.

또한, pDZDvalA 벡터로 형질전환된 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA이라 명명하였다.

실시예 3 : L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 벡터의 제작

L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P으로부터 L-발린 생합성 과발현 벡터를 제작하였다.

또한 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA로부터 L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 벡터를 제작하였다.

상기 벡터의 제작을 위해, 서열번호 19와 20의 프라이머를 조합으로 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 방법을 통하여 유전자를 증폭하였고, 제한효소 BamHI 과 XbaI 을 처리한 후 같은 효소로 처리된 pECCG117 벡터에 삽입하여 각각의 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-DvalW, pECCG117-DvalL, pECCG117-DvalP, pECCG117-DvalS 및 pECCG117-DvalA 를 제작하였다.

실시예 4 : L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 균주의 제작

상기 실시예 3에서 제조한 L-발린 생합성 과발현 벡터 pECCG117-DvalW, pECCG117-DvalL, pECCG117-DvalP, pECCG117-DvalS 및 pECCG117-DvalA를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법으로 각각 삽입하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalA 균주를 각각 제작하였다. 벡터가 형질전환 될 경우 kanamycine 내성을 가지게 되므로 kanamycine이 25㎍/㎖ 의 농도로 포함된 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.

실시예 5 : L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 균주에서의 L-발린 생산

상기 실시예 2에서 제조한 각각의 L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA 로부터 L-발린 생산을 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다. 이때, 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 배양하여 사용하였다.

또한 상기 실시예 4에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalA 균주로부터 L-발린 생산을 위해 동일한 방법으로 배양하였다.

아래의 표 1과 같은 조성의 생산 배지 25ml을 함유하는 250ml 코너-바풀 플라스크에 1백금이의 균주를 접종하고 30℃ 에서 72시간 동안 200rpm으로 생산하였다.

배양종료 후 HPLC로 L-발린의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-발린 농도는 아래 표 2 및 3과 같았다.

생산 배지

포도당 5%, 황산암모늄 2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200 ug/L, pH7.2

코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, KCCM11336P, KCCM11337P, KCCM11338P 및 KCCM11201P_DvalA 의 발린 생산성

균주	L-발린농도 (g/L)
KCCM11201P	2.8
KCCM11336P	3.1
KCCM11337P	3.2
KCCM11338P	3.5
KCCM11201P_DvalA	0.5

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW, ATCC13032_DvalL, ATCC13032_DvalP, ATCC13032_DvalS, ATCC13032_DvalA의 발린 생산성

균주	L-발린농도 (g/L)
ATCC13032_DvalW	0.1
ATCC13032_DvalL	0.9
ATCC13032_DvalP	1.1
ATCC13032_DvalS	1.3
ATCC13032_DvalA	0.1

상기 표 2에 나타난 바와 같이, L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화되도록 형질전환된 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA 를 제외하고, 모균주인 L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 비해 L-발린 생산성이 향상됨을 확인하였다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P는 모균주에 비해 L-발린 생산량이 25% 향상된 결과를 나타내였다.

또한, 상기 표 3에 나타난 바와 같이 L-발린 생합성 유전자의 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 L-발린 생합성 유전자의 조절부위를 가지도록 형질전환된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalW에 비해 L-발린 생산능이 9배 내지 13배 우수함을 확인하였다.

Pro : 프로모터(Promoter),
Leader Peptide : 리더펩티드를 코딩하는 염기서열
Pause site : 정지부위
Attenuator : 감쇠부위
Gene : 구조 유전자

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11336P

20121119

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11337P

20121119

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11338P

20121119

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A microorganism having enhanced L-valine productivity and a method of producing L-valine using the microorganism <130> PA12-0466 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Thr Ile Ile Arg Leu Val Val Val Thr Ala Arg Arg Leu Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Arg Leu Val Val Val 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Thr Ile Ile Thr Ala Arg Arg Leu Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Ile Ile Arg Leu Val Val *** Thr Ala Arg Arg Leu Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalL, DvalP, DvalS <400> 5 gcgcgatgac atctgtgatg tt 22 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalL <400> 6 agacgacttg gaaggccggt gtgtcatgct acacacatcg a 41 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalL <400> 7 tgtgtgtagc atgacacacc ggccttccaa gtcgtctc 38 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalL, DvalP, DvalS <400> 8 cagttcttcg tgtgcatcag cct 23 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalP <400> 9 tgtagcatga cacaccatga ccattattac cgcgcggcgc ctgccgt 47 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalP <400> 10 cggcaggcgc cgcgcggtaa taatggtcat ggtgtgtc 38 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalS <400> 11 cggcaggcgc cgcgcggtca tactacaagt cgaataatgg tcatggtgtg 50 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalS <400> 12 ccattattcg acttgtagta tgaaccgcgc ggcgcctgcc g 41 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalA <400> 13 cgtccaagcc aagccgattt cagtgtgtca tgctacacac a 41 <210> 14 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalA <400> 14 ctcgatgtgt gtagcatgac acactgaaat cggcttggct tgg 43 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalL <400> 15 catgacacac cggccttc 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalP <400> 16 atgaccatta ttaccgcgcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalS <400> 17 acttgtagta tgaaccgcgc 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DvalA <400> 18 gtagcatgac acactgaaat cgg 23 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cgaggatcca accggtatcg acaatccaat 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctgtctagaa atcgtgggag ttaaactcgc 30 <210> 21 <211> 303 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 21 atgaccatta ttcgacttgt agtagtaacc gcgcggcgcc tgccgtaacg gccttccaag 60 tcgtctcgtc aagcgccctc gacaacactc accacagtgt tggaacgagg gctttcttgt 120 tggttatgac ccaagtagcc aactttgcaa cagacatctg tcgcactgcg tgcacacgca 180 tccgcgtcgg aacaatttta aatgagggct ttgtctttag gctgagttga aatcggcttg 240 gcttggacgg gtcctgtgaa aatccttatt tagtaaagga gccagaaagt cgtgaatgtg 300 gca 303 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 atgaccatta ttcgacttgt agtagtaacc gcgcggcgcc tgccgtaa 48 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 23 cgacttgtag tagta 15 <210> 24 <211> 1582 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 ttgttgatgc acactttcgc cgtggagttg gggatgatca cggtctcttg tgcaatcgtg 60 cgaattttgg tcgcgcgcat ggtgatctca atgacggtgc cttcgacaac gatgccgttg 120 ccctcaaaac gcacccagtc acccacgccg aattgctttt ccgtcaggat gaaaaatccg 180 gccaagaagt ccgcaacaat cgactgcgca ccaaggccaa tggcagctga cgcaatggtt 240 gccggaatcg cagcgcccgc gagagagaaa ccaaaagcct gcatcgcgga gacggcaagc 300 atgaaaaacg ccacaatttg cgcgatataa acgccaacgc cagcgaacgc gagctggttc 360 ttagtggtgt ccgcatcggc tgcagactcc actcgccgct tgataatacg catggccagt 420 cggccgatac gtggaatcaa aaacgccaag accaggataa ttgctacatc aaaaccggta 480 tcgacaatcc aattccacaa tgaatagagc aaatattgaa tgggtacgcc taaaatcatg 540 agccaagatt agcgctgaaa agtagcggga gcctgcctga actttgtgag aatcctgatt 600 ccttaaccga agtgggggag ttttgggggt gggaattttc gtgcgttgtg gaattggaaa 660 ctcgatgtgt gtagcatgac acaccggcct tccaagtcgt ctcgtcaagc gccctcgaca 720 acactcacca cagtgttgga acgagggctt tcttgttggt tatgacccaa gtagccaact 780 ttgcaacaga catctgtcgc actgcgtgca cacgcatccg cgtcggaaca attttaaatg 840 agggctttgt ctttaggctg agttgaaatc ggcttggctt ggacgggtcc tgtgaaaatc 900 cttatttagt aaaggagcca gaaagtcgtg aatgtggcag cttctcaaca gcccactccc 960 gccacggttg caagccgtgg tcgatccgcc gcccctgagc ggatgacagg tgcacaggca 1020 attgttcgat cgctcgagga gcttaacgcc gacatcgtgt tcggtattcc tggtggtgcg 1080 gtgctaccgg tgtatgaccc gctctattcc tccacaaagg tgcgccacgt cctggtgcgc 1140 cacgagcagg gcgcaggcca cgcagcaacc ggctacgcgc aggttactgg acgcgttggc 1200 gtctgcattg caacctctgg cccaggcgca accaacttgg ttaccccaat cgctgatgca 1260 aacttggact ccgttcccat ggttgccatc accggccagg tcggaagtgg cctgctgggt 1320 accgatgctt tccaggaagc cgatatccgc ggcatcacca tgccagtgac caagcacaac 1380 ttcatggtca ccgaccccaa cgacattcca caggcattgg ctgaggcatt ccacctcgcg 1440 attactggtc gccctggccc tgttctggtg gatattccta aggatgtcca aaacgctgaa 1500 ttggatttcg tctggccacc aaagatcgac ctgccaggct accgcccagt ttctactccg 1560 catgctcgac agattgagca gg 1582 <210> 25 <211> 1616 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 25 ttgttgatgc acactttcgc cgtggagttg gggatgatca cggtctcttg tgcaatcgtg 60 cgaattttgg tcgcgcgcat ggtgatctca atgacggtgc cttcgacaac gatgccgttg 120 ccctcaaaac gcacccagtc acccacgccg aattgctttt ccgtcaggat gaaaaatccg 180 gccaagaagt ccgcaacaat cgactgcgca ccaaggccaa tggcagctga cgcaatggtt 240 gccggaatcg cagcgcccgc gagagagaaa ccaaaagcct gcatcgcgga gacggcaagc 300 atgaaaaacg ccacaatttg cgcgatataa acgccaacgc cagcgaacgc gagctggttc 360 ttagtggtgt ccgcatcggc tgcagactcc actcgccgct tgataatacg catggccagt 420 cggccgatac gtggaatcaa aaacgccaag accaggataa ttgctacatc aaaaccggta 480 tcgacaatcc aattccacaa tgaatagagc aaatattgaa tgggtacgcc taaaatcatg 540 agccaagatt agcgctgaaa agtagcggga gcctgcctga actttgtgag aatcctgatt 600 ccttaaccga agtgggggag ttttgggggt gggaattttc gtgcgttgtg gaattggaaa 660 ctcgatgtgt gtagcatgac acaccatgac cattattacc gcgcggcgcc tgccgtaacg 720 gccttccaag tcgtctcgtc aagcgccctc gacaacactc accacagtgt tggaacgagg 780 gctttcttgt tggttatgac ccaagtagcc aactttgcaa cagacatctg tcgcactgcg 840 tgcacacgca tccgcgtcgg aacaatttta aatgagggct ttgtctttag gctgagttga 900 aatcggcttg gcttggacgg gtcctgtgaa aatccttatt tagtaaagga gccagaaagt 960 cgtgaatgtg gcagcttctc aacagcccac tcccgccacg gttgcaagcc gtggtcgatc 1020 cgccgcccct gagcggatga caggtgcaca ggcaattgtt cgatcgctcg aggagcttaa 1080 cgccgacatc gtgttcggta ttcctggtgg tgcggtgcta ccggtgtatg acccgctcta 1140 ttcctccaca aaggtgcgcc acgtcctggt gcgccacgag cagggcgcag gccacgcagc 1200 aaccggctac gcgcaggtta ctggacgcgt tggcgtctgc attgcaacct ctggcccagg 1260 cgcaaccaac ttggttaccc caatcgctga tgcaaacttg gactccgttc ccatggttgc 1320 catcaccggc 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cctgccaggc taccgcccag tttctactcc 1380 gcatgctcga cagattgagc agg 1403

Claims

L-발린 오페론의 조절부위 내의 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 리더펩티드를 암호화하는 염기서열 전체가 결손되거나 일부가 결손 또는 치환되어, L-발린 오페론의 발현이 강화되도록 형질전환된, 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물로부터 선택되는 L-발린 생산 균주.
제1항에 있어서,
상기 리더펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열의 정지부위(pause site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
제2항에 있어서,
상기 정지부위를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부가 결손되거나 상기 정지부위를 암호화하는 염기서열의 일부가 치환된 것을 특징으로 하는 균주.
제3항에 있어서,
상기 정지부위를 암호화하는 서열번호 23의 염기서열의 13 내지 15번째 핵산이 종결코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는 코리네박테리움 속 미생물인 것을 특징으로 하는 균주.
제5항에 있어서,
상기 균주는, 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계 및 상기 균주의 배양액으로부터 L-발린을 회수하는 단계;를 포함하는 L-발린 생산방법.
서열번호 3 또는 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 L-발린 오페론의 조절부위 변이체.