KR20160017389A

KR20160017389A - 피드백 저항성 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-발린의 생산방법

Info

Publication number: KR20160017389A
Application number: KR1020140100669A
Authority: KR
Inventors: 전애지; 송병철; 김종현; 김혜원; 이지혜
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-02-16
Also published as: US10457919B2; EP3178926B1; WO2016021932A1; KR101720836B1; JP2017523787A; JP2019088322A; JP6518317B2; US20170226488A1; US10316297B2; ES2702726T3; DK3178926T3; CN107075496A; US20190071652A1; PL3178926T3; CN107075496B; EP3178926A4; EP3178926A1

Abstract

본 발명은 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된 아세토하이드록시산 신타아제 변이체, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-발린의 생산방법에 관한 것이다.

Description

피드백 저항성 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 및 이를 이용한 L-발린의 생산방법{Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase variants and a method of producing L-valine using the same}

L-발린은 필수 아미노산 중 하나로서, 사료 성분 및 식품용 소재로 유용하게 쓰이고 있다.

분지쇄 아미노산, 즉 L-발린, L-이소류신, L-류신은 생합성 과정에 동일한 효소를 사용하기 때문에 한가지의 분지쇄 아미노산을 산업적 규모의 발효로 제조하는 데는 어려움이 있는 것으로 알려져 있다. 추가적으로 최종 산물인 L-발린 또는 이의 유도체에 의해 중요 효소에서 피드백 저해가 발생하여 발효에 제약이 따른다는 문제점을 갖고 있다.

이에 본 발명자들은 효과적인 L-발린 생산방법에 대해 지속적인 연구를 한 결과, L-발린에 의한 피드백 저해가 해제된, 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 규명하였고, 상기 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물의 경우, 이를 포함하지 않는 모균주에 비하여 L-발린 생산능이 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는, L-발린을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-발린을 생산하는 미생물을 이용하여 L-발린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 137번 아미노산 잔기인 류신(Leucine, L)이 류신 이외의 아미노산으로 치환되어 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "L-발린"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-류신, L-이소류신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 (CH₃)₂CHCH(NH₂)COOH인 L-아미노산을 의미한다.

본 발명에서 용어, "아세토하이드록시산 신타아제"는 L-발린 생합성에서 첫 번째 효소로서, 아세토락테이트 산타아제로도 명명된다. 아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산(pyruvate)의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토락테이트를 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토히드록시부티레이트를 생산할 수 있다.

아세토하이드록시산 신타아제는 ilvB 및 ilvN, 두 유전자에 의하여 코딩되며, ilvB 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체(large subunit)를, ilvN 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 작은 소단위체(small subunit)를 각각 코딩한다. 이 중 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 작은 소단위체가 피드백 저해에 중요하게 관여한다고 여겨진다.

상기 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 아세토하이드록시산 신타아제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어, "피드백 저해"는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 피드백 저해는 L-발린이 이의 생합성 경로의 첫 번째 단계를 매개하는 아세토하이드록시산 신타아제의 활성을 저해하는 것을 말하나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 아세토하이드록시산 신타아제의 피드백 저해를 해제하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 L-발린의 생산성을 높일 수 있다. 본 발명에서는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 아세토하이드록시산 신타아제의 N-말단으로부터 137번 아미노산 잔기인 류신이 다른 아미노산, 구체적으로 페닐알라닌(phenylalanine, Phe, F)으로 치환되는 경우, L-발린에 대한 피드백 저해가 해제되는 것을 확인하였다.

상기 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된 아세토하이드록시산 신타아제는 구체적으로 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열뿐만 아니라 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 변이체로서 실질적으로 야생형 아세토하이드록시산 신타아제에 비하여 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된 것이라면 제한없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재된 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태인 슈퍼패밀리 유래 단백질 및 다른 종 유래의 상동 단백질을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용 상에 의해 수식될 경우에는 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 발린에 대한 피드백이 해제된 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 L-발린을 생산하는 미생물의 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 상기 미생물의 돌연변이는 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 발생 둘 중의 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적합한 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NTG), 디에폭시부탄, 에틸메탄 설폰에이트, 머스타드 화합물, 히드라진 및 아질산을 포함하는데, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 포함할 수 있는데, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 L-발린 생산능이 향상된 미생물 변이주를 얻기 위하여 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)을 사용하였으며, 이는 알파-아미노부티르산(α-aminobutyric acid, ABA), 알파-하이드록시발린(α-hydroxyvaline, AHV), 티아졸알라닌(thiazole alanine, TA) 및 노르발린(Norvaline, NV)에 대해 내성을 가지는 변이주이다. 본 발명에서는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 NTG를 처리하고, 이러한 균주 중에서 알파-아미노부티르산(α-Aminobutyric aicd, ABA)에 내성을 보이는 변이주를 획득하였고, 이를 NA100-311로 명명하였다. 상기 NA100-311은 모균주와 비교하였을 때, 동일한 양의 세포가 생산하는 L-발린의 양이 20.3% 가량 증가한 결과를 나타내었다. 또한, 이의 염기서열을 분석한 결과, 상기 변이주의 아세토하이드록시산 신타아제의 아미노산 서열 상에 돌연변이가 일어났으며, 구체적으로 서열번호 3의 아미노산 서열에서 137번 아미노산 잔기인 류신이 페닐알라닌으로 치환된 것을 확인할 수 있었다(실시예 2).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 아세토하이드록시산 신타아제 및 변이체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미하며 본 발명에서는 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 예로 서열번호 5의 염기서열을 가질 수 있으며, 이는 서열번호 3의 아세토하이드록시산 신타아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 409번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있는 것으로, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서 벡터(vector)는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정 되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ(대한민국 공개특허공보 제2008-0025355호; 본원 발명에서 전체로서 인용되어 포함된다.)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는, L-발린을 생산하는 미생물을 제공한다.

상기 L-발린, 아세토하이드록시산 신타아제 및 변이체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "L-발린을 생산하는 미생물"은 L-발린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 말한다. 본 발명의 목적상 상기 미생물은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하여 L-발린을 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하며, 그 예로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰을 들 수 있다.

상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물은, 상기 아세토하이드록시산 신타아제를 암호화하는 염색체상의 유전자가 돌연변이되어 본 발명에 따른 아세토하이드록시산 신타아제 변이체 서열을 포함하는 미생물 또는/및 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입시켜 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는 미생물을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는 L-발린을 생산하는 미생물은, 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체의 활성이 모균주에 비해 강화된 것일 수 있다.

상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체의 활성을 강화시키는 방법으로는, 상기 변이체를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 변이체를 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 변이체를 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 변이체의 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 변이체의 활성이 강화되도록 상기 변이체 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 CaCl₂침전법, CaCl₂방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 상기 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 전달된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터로 형질전환시켜 L-발린 생산능을 분석한 결과, L-발린 생산능이 모균주에 비해 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 L-발린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-발린을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 L-발린, 아세토하이드록시산 신타아제, 변이체 및 미생물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 L-발린을 생산하기 위해, L-발린 생산 균주를 배양하는 방법은 당업계에 널리진 알려져 있는 코리네박테리움 속 미생물의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다.

또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 배지는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-발린의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있으며, 보통 10 내지 160 시간 동안 진행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. L-발린은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 L-발린 제조방법은, 세포 또는 배양물로부터 L-발린을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세포 또는 배양물로부터 L-발린을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리하였다.

본 발명에 따른 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제되어 있으므로, 이를 포함하는 L-발린 생산용 미생물은 모균주에 비하여 고수율로 L-발린을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시에에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 인공변이법을 통한 변이주 선별

L-발린 생산능이 향상된 미생물 변이주를 얻기 위해 하기와 같은 방법을 사용하여 미생물의 변이를 유도하였다.

구체적으로, 모균주인 L-발린 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)을 121℃에서 15분간 멸균한 하기 기재된 성분의 종배지에 접종하고, 13시간 동안 배양한 후, 배양액 25 ㎖을 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액(citrate buffer)으로 세척한 후, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 400 ㎍/㎖가 되게 첨가한 후, 30분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG가 처리된 균주를 하기 기재된 성분의 최소배지에 도말하여 사멸율을 구해본 결과 사멸율은 99.6%였다.

알파-아미노부티르산(α-Aminobutyric aicd, ABA)에 대한 내성 변이주를 구하기 위해서, 상기 NTG가 처리된 균주를 ABA의 최종농도가 0, 20, 50, 100, 200 mM이 되게 첨가된 최소배지에 도말하고, 30℃에서 7일간 배양하여 ABA 내성 변이주를 획득하였다. 획득된 변이주를 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311로 명명하였다.

<종배지>

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준), pH 7.0

<최소배지>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질(Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1,000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3,000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0

실시예 2 : 선정된 변이주의 L-발린 생산능 확인 및 ilvN 염기서열 확인

실시예 1에서 선정된 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311의 L-발린 생산성을 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다.

하기 기재된 성분의 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 및 상기 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311을 1 백금이 접종한 후, 30℃에서 72시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-발린을 생산하였다.

<생산배지>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO₃30 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0

배양종료 후, 고속액체크로마토그래피로 L-발린의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-발린 농도를 하기 표 1에 나타내었다.

ABA 내성 변이주의 L-발린 생산성

균주	L-발린 농도 (g/ℓ)	광학밀도 (OD)
코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P	2.8	47.5
코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311	1.9	26.8

그 결과, 상기 결과에 따르면 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 경우 배양액의 광학밀도가 47.5이며, 2.8 g/ℓ의 농도로 L-발린을 생산하였으나, 본 발명에 따른 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311은 배양액의 광학밀도가 26.9 밖에 되지 않음에도 불구하고 1.9 g/ℓ의 농도로 L-발린을 생산하였다. 광학밀도 1 당 생산하는 L-발린의 농도 (g/ℓ/OD)를 계산하면, 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 경우는 0.059이지만, 본 발명에 따른 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311은 0.071로 증가한 것을 알 수 있으며, 이는 동일한 양의 세포가 생산하는 L-발린의 양이 모균주 대비 20.3% 증가했음을 의미한다.

상기 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311에서 아세토하이드록시산 신타아제의 소단위체를 암호화하는 유전자인 ilvN 염기서열을 확인하고자, 변이주의 염색체 DNA를 중합효소연쇄반응 방법 (이하 'PCR 방법'이라 함)을 통하여 증폭하였다.

구체적으로, 먼저 상기 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 NA100-311의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 결합, 72℃에서 40초간 Taq DNA중합효소로 중합하는 조건을 28회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 950개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 이를 상기와 같은 프라이머로 염기서열을 분석한 결과 409번째 뉴클레오티드인 C가 T로 치환되어 있음을 확인하였으며, 이는 137번째 아미노산인 류신이 페닐알라닌으로 치환되는 변이임을 의미한다.

실시예 3 : ilvN 의 치환된 염기서열을 포함하는 벡터 제작

상기 실시예 2에서 확인된 변이 염기서열를 포함하는 벡터를 제작하고자, 상기 변이주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분간 Pfu DNA중합효소로 중합하는 조건을 25회 반복하는 PCR 방법을 통하여 BamHI과 XbaI 제한효소 자리를 가진 약 950개 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 증폭된 단편은 제한효소 BamHI과 XbaI로 처리한 후, 같은 효소로 처리된 pDZ로 ligation을 통해 pDZ-ilvN(L137F)를 제작하였다.

실시예 4 : ilvN 의 염기서열이 치환된 균주 제작

상기 변이주에서 발견된 ilvN 변이 염기서열를 포함하는 균주를 제작하기 위해, 모균주로 L-발린 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 사용하였다.

전기천공법에 의해 상기 실시예 3에서 제작된 pDZ-ilvN(L137F) 벡터로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P를 형질전환시켰다. 2차 교차 과정을 거쳐 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P의 염색체 상에서 ilvN 유전자로 코딩되는 아미노산 서열의 137번째 아미노산인 류신이 페닐알라닌으로 치환되어 있는 L-발린 생산균주를 확보했다. ilvN의 염기치환 여부는, 서열번호 1과 2 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분간 변성, 58℃에서 30초간 결합, 72℃에서 40초간 Taq DNA중합효소로 중합하는 조건을 28회 반복하는 PCR 방법을 통하여 약 950개 염기쌍의 단편을 증폭한 후 서열번호 2 프라이머로 염기서열을 분석하여 확인하였다.

상기 pDZ-ilvN(L137F) 벡터로 형질전환된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644라 명명하고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2013년 11월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM11485P를 부여받았다.

실시예 5 : ilvN 의 염기서열이 치환된 균주에서의 L-발린 생산

상기 실시예 4에서 제작한 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644로부터 L-발린을 생산하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다.

생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 및 상기 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644를 1 백금이 접종한 후, 30℃에서 72시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-발린을 생산하였다.

배양종료 후 고속액체크로마토그래피로 L-발린의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-발린 농도는 아래 표 2과 같다.

코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 및 KCJ-644의 L-발린 생산성

균주	L-발린 농도 (g/ℓ)
코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P	2.8
코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644	3.0

상기 표 2에 나타난 바와 같이, ilvN 유전자에 L137F 변이가 있는 L-발린 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 비해 L-발린 생산성이 7.1% 향상됨을 확인하였다.

실시예 6: ilvN 의 염기서열이 치환된 균주에서의 아세토하이드록시산 신타아제 활성 측정

상기 실시예 4에서 제작한 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644에서 아세토하이드록시산 신타아제의 활성을 측정하기 위해, 하기와 같은 방법으로 실험하였다.

종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 및 상기 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644를 1 백금이 접종한 후, 30℃에서 16시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양종료 후 배양액을 원심분리하여 상층액은 버리고, 펠릿을 용균완충용액으로 세척 및 혼탁하여 구슬파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 용균액의 단백질 정량은 브래드포드법을 따랐으며, 100 ㎍/㎖의 단백질이 포함된 용균액을 이용하였을 때 생성되는 아세토인을 측정함으로써 아세토하이드록시산 신타아제의 활성을 측정하였다. 각 균주에서의 아세토하이드록시산 신타아제의 활성측정 결과는 표 3과 같다.

균주	ilvN 활성 (μM/mg/min)
코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P	73.6
코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644	84.1

상기 표 3에 나타난 바와 같이, ilvN 유전자에 L137F 변이가 있는 L-발린 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJ-644는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P에 비해 아세토하이드록시산 신타아제의 활성이 14.3%로 향상됨을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11485P

20131122

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase variants and a method of producing L-valine using the same <130> KPA140779-KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cgttggccag caccagatgt 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gatgtcgtca gctggcttga tc 22 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(172) <223> Acetohydroxy acid synthase <400> 3 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 4 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> acetohydroxy acid synthase variant <400> 4 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Phe Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 5 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> acetohydroxy acid synthase variant <400> 5 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgtaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagtt ccgcgcactg 420 cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519

Claims

서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 137번 아미노산 잔기인 류신(Leucine, L)이 류신 이외의 아미노산으로 치환되어 L-발린에 대한 피드백 저해가 해제된, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체.
제1항에 있어서,
상기 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인, 아세토하이드록시산 신타아제 변이체.
제1항의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
제1항의 아세토하이드록시산 신타아제 변이체를 포함하는, L-발린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제5항에 있어서,
상기 아세토하이드록시산 신타아제 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것인, L-발린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제5항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-발린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
(a) 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 L-발린을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 L-발린을 생산하는 단계; 및
(b) 상기 미생물 또는 배지로부터 L-발린을 회수하는 단계를 포함하는,
L-발린을 생산하는 방법.